海洋氨肽酶菌株的筛选鉴定及其酶学特性研究

从大连渤海海域海泥海水样品中分离出一株高产海洋氨肽酶(aminopeptidase)菌株YZ1-2,对其进行形态学、生理生化、分子生物学(16S rDNA)鉴定,确定该菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。并对其产海洋氨肽酶进行酶学特性研究,结果表明,最适作用温度为30 ℃;最适作用pH值为8.5;Co2+、Zn2+等能较强地激活氨肽酶的活性,Ni2+、Ca2+等对酶的抑制性较强;乙二胺四乙酸(EDTA)可以有效地抑制氨肽酶活性。     

毛霉亮氨酸氨肽酶的纯化及性质研究

采用硫酸铵盐析、离子交换层析、疏水层析、凝胶层析及超滤方法对毛霉胞外蛋白酶组分进行分离纯化,从毛霉的发酵麸曲中分离纯化得到氨肽酶组分,并对其性质进行探讨。结果表明：纯化的毛霉氨肽酶是亮氨酸氨肽酶,其对小肽N端的亮氨酸有非常强的水解活性;该氨肽酶在40℃、pH6.5有最大催化活性,在40℃以内,pH5.0～8.0有很好的稳定性;在所实验的几种蛋白酶抑制剂(PMSF、EDTA、E-64、Pepstatin A)中,仅EDTA可以完全抑制该氨肽酶的活性,由此说明,纯化的毛霉氨肽酶是一种金属蛋白酶;常见的金属离子中,Ca2+对该氨肽酶有激活作用,而Zn2+、Cu2+及Mn2+对其有强的抑制作用;该氨肽酶对大豆多肽的苦味有明显的去除效果,大豆多肽脱苦处理4h后其苦味基本消除。     

己酸菌的筛选及发酵特性研究

在浓香型白酒生产中,己酸菌是窖泥中的重要功能菌,影响着白酒的品质。本研究通过对老窖泥进行富集培养,分离筛选出1株高产己酸的己酸菌,经16S rDNA鉴定为速生梭菌(Clostridium celerecrescens),命名为E-6。并研究培养时间、培养温度、乙醇添加量对菌株的生长和发酵特性的影响。结果表明,E-6产己酸的最佳培养温度为34℃,乙醇添加量为2 mL/100 mL,此条件下培养10 d左右己酸产量可达到9.4 g/L。     

耐低温高产氨肽酶乳酸菌株的筛选及氨肽酶提取方法的优化

以吉林长白山区特色发酵酱菜为原材料,筛选获得160株乳酸菌,通过检测菌株的耐低温能力、产酸能力、耐酸耐胆盐能力、菌株自溶度等指标筛选出4株具有优良性能的耐低温乳酸菌,其中3株具有较强的蛋白水解能力。利用溶菌酶和高速离心破碎菌体,提取粗酶液,以Glu-ρ-NA为底物筛选出菌株106为高产氨肽酶菌株,酶活为14.56 U/mL。经形态学鉴定和16S rDNA分析,确定菌株106为植物乳杆菌,命名为植物乳杆菌106。本实验筛选到的植物乳杆菌106不但具有产酸、耐酸耐胆盐等特性,还具有耐低温、高产氨肽酶的特性,本研究结果为缩短切达干酪快速成熟时间和降低切达干酪成熟过程中的苦味提供了优良菌株来源,具有非常重要的应用价值。     

食品级高产亮氨酸氨肽酶重组Bacillus subtilis的构建和发酵优化

为解决枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在发酵产亮氨酸氨肽酶(leucine aminopeptidase,LAP)需额外添加抗生素的问题,该研究构建了1株食品级产LAP重组B. subtilis。首先通过Cre/lox系统敲除B. subtilis 168基因组中D-丙氨酸消旋酶基因(dal)得到缺陷型菌株BS168 (dal)^-。其次使用高斯组装的方法构建以dal作为标记基因的质粒pMA5-lap-dal (Amp^R,Ori)-并转化至BS168 (dal)^-中得到食品级重组菌BS168 (dal)-/p MA5-lap-dal (Amp^R,Ori)^-。该工程菌发酵产LAP无需添加抗生素且不含抗性基因。对该菌株进行5 L发酵罐条件优化,在转速300 r/min、温度33℃、p H 7. 0、分阶段补料的条件下,酶活最高达到302 U/m L。结果表明,构建的食品级重组B. subtilis产LAP具有潜在的工业应用前景。     

枯草芽孢杆菌ZH-Zj016产亮氨酸氨肽酶的发酵控制研究

一种通过原生质体转化技术所获得的可产亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢杆菌工程菌ZH-Zj016,在对其发酵条件单因素初步优化的基础上,通过控制最低溶氧、两阶段变温培养、细胞通透性调节等,获得15L自控式发酵罐最适发酵条件:初始pH8.0,装液量8.0L,发酵温度(15h前39℃,15h后37℃),培养时间28h,接种量7‰(V/V),搅拌转速为250～500r/min,罐压控制在0.06～0.08MPa,通气量1.2vvm,溶氧和搅拌转速相偶联,最低溶氧维持在40％,在此条件下,酶活可达138U/mL,与该菌摇瓶优化条件下相当,是原野生菌15L发酵罐平均水平(6.5U/mL)的21倍.     

一株耐酒精纤维素酶产生菌的筛选、鉴定及其特性研究

利用乙醇-CMC-Na平板初筛,经摇瓶发酵复筛,从谷酒成熟酒醪中筛选获得1株耐酒精纤维素酶活力较高的细菌Lys-1249。经生理生化测定、形态观察及16S rDNA 基因序列的同源性分析,将其鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）。经正交试验优化该菌株的产酶条件,表明该菌株在麸皮2.0%,蛋白胨0.6%,K2HPO4 0.1%,MgSO4·7H2O 0.05%,FeSO4·7H2O 0.02%,MnSO4 0.01%,培养基初始pH值为7.0,培养温度37 ℃,发酵周期48 h的条件下,其耐酒精纤维素酶活力达到158.54 U/mL。该菌株在6.0%vol乙醇培养基中生长良好,活性可保持65.95%。     

枯草芽孢杆菌ZH-Zj016产亮氨酸氨肽酶的发酵控制研究

一种通过原生质体转化技术所获得的可产亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢杆菌工程菌ZH-Zj016,在对其发酵条件单因素初步优化的基础上,通过控制最低溶氧、两阶段变温培养、细胞通透性调节等,获得15L自控式发酵罐最适发酵条件:初始pH8.0,装液量8.0L,发酵温度（15h前39℃,15h后37℃）,培养时间28h,接种量7‰（V/V）,搅拌转速为250⁵00r/min,罐压控制在0.06⁰.08MPa,通气量1.2vvm,溶氧和搅拌转速相偶联,最低溶氧维持在40%,在此条件下,酶活可达138U/mL,与该菌摇瓶优化条件下相当,是原野生菌15L发酵罐平均水平（6.5U/mL）的21倍。      

一种枯草芽孢杆菌亮氨酸氨肽酶的提取及部分酶学性质研究

采用(NH4)2SO4盐析法、有机溶剂沉淀法以及超滤浓缩等操作提取亮氨酸氨肽酶,初步建立了一种易于规模化提取枯草芽孢杆菌亮氨酸氨肽酶的工艺。发酵液采用质量分数为15%的(NH4)2SO4澄清,再经30kDa的超滤膜浓缩2.5倍时,纯化倍数为6.1,酶的回收率为87.7%。超滤后的保留液再经质量分数为25%的(NH4)2SO4盐析,可沉淀出保留液中90%的酶。按此工艺超滤浓缩后的液态酶稳定性较好,85d仍能保留80%以上的酶活。Co2+对此亮氨酸氨肽酶有较强的激活作用,Zn2+、Fe2+、Mn2+和Ca2+等几种金属离子对酶有不同程度的抑制作用。     

亮氨酸氨肽酶的制备及在大米肽脱苦中的协同应用

采用絮凝、超滤和冷冻干燥组合的方法制备重组枯草芽孢杆菌亮氨酸氨肽酶,以氨肽酶切除末端疏水性氨基酸为酶解脱苦效果的指标,考察了该氨肽酶与脯氨酸氨肽酶协同水解大米肽的脱苦效果。酶的制备工艺条件如下:加入0.15%±0.008%的絮凝剂,2.5%±0.006%的硅藻土,调节p H8.0进行过滤,采用30 k Da的PES卷式膜,超滤浓缩7倍,氨肽酶的总回收率为64.69%±1.29%;在优化的酶解条件下,大米肽的酶解液中的亮氨酸、精氨酸及游离的疏水性氨基酸总量分别是酶解前的3.39±0.10、16.48±0.49、4.39±0.13倍,酶解后分子量500~1000 Da的肽含量降低了30.63%±0.61%,经双酶协同水解后脯氨酸含量是单酶水解后的1.78±0.07倍。优化后工艺简便,且该酶在大米肽脱苦中有良好的应用。      

产L-亮氨酸营养缺陷型突变株黄色短杆菌SFL8-3的选育

氨基酸是构成蛋白质的基本单位，是生物体内不可缺少的营养成分，L-亮氨酸是人体8种必需氨基酸之一，也是三种支链氨基酸之一，在医药、食品、饲料、化妆品等行业具有重要的用途。以一株黄色短杆菌为出发菌株，经紫外线、盐酸羟胺和硫酸二乙酯等多次诱变处理，单菌落分离、摇瓶初筛和摇瓶复筛，获得了一株蛋氨酸和异亮氨酸双重缺陷型突变株SFL8-3（Met^-，Ile^-），摇瓶发酵L-亮氨酸产量达18．98g／L。     

海藻糖合成酶产生菌筛选、鉴定及其产酶特性

以麦芽糖为唯一碳源高盐培养基,经高温培养,从温泉水样及其附近土壤中筛选得到一株菌株T2,经过生物合成途径初步验证,该菌株产海藻糖合酶,能够通过海藻糖合成酶（TreS）途径将麦芽糖转化为海藻糖。菌株T2为革兰氏阳性菌,杆状,有芽孢,经过生物学鉴定,将其初步鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）。对其产海藻糖合酶的酶学性质进行了研究：酶反应最适作用温度为60 ℃,在60 ℃条件下保温100 min仍能保持酶活性80.7%;最适作用pH值为7.0,在pH 6.0～7.5范围内稳定。采用正交试验对其发酵培养基配方进行了优化研究,确定了最佳的培养基组成为牛肉膏3.0 g/L,麦芽糖20.0 g/L,蛋白胨7.5 g/L,无机盐（K2HPO4＋NaH2PO4＋MgSO4·7H2O）3.0 g/L。在此条件下,菌株T2产海藻糖合酶酶活力达到310.6 U/L。     

一株耐酸性酿酒酵母的筛选鉴定及特性

基于浓香型白酒回糟酸度高、残糖含量高的生产现状,通过平板划线纯化、WL培养基形态观察及显微镜观察对中高温大曲中酵母菌进行初步鉴定,再通过TTC培养基染色筛选、差异酸度培养基筛选适用于回糟发酵耐酸性产酒精能力强的酵母菌,并进行分子生物学鉴定、生物学特性及回糟发酵小试研究.结果表明:中高温大曲中筛选得到的菌株dq1在pH ...     

产海藻糖合酶菌株的筛选及发酵条件的优化

从土壤中分离筛选得到一株能合成海藻糖的菌株,经生物转化途径验证,该菌株含有特异性地将麦芽糖转化为海藻糖的海藻糖合酶,以海藻糖转化率为评价指标,对其进行摇瓶发酵条件的优化。结果表明,其发酵最适条件为：碳源为2%麦芽糖,氮源为0.5%酵母粉和1%蛋白胨,发酵初始pH值为7.0,接种量4%,发酵温度35 ℃,发酵时间48 h,在此优化条件下,海藻糖的转化率为50%。     

产香酵母的筛选及其苹果酒发酵特性

从分离自赤霞珠葡萄酿酒不同时期发酵液中的酵母菌中筛选产香菌株,并对其苹果酒发酵特性进行研究。结果表明,经感官评定初筛,获得7株产香较优的酵母菌,并对其进行耐酒精、耐SO2和耐盐性能分析,其中菌株B2-13具有较好的发酵性能,经分子生物学鉴定菌株B2-13为葡萄酒有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）。菌株B2-13发酵苹果酒酒精度为4.2%vol～5.5%vol,糖度为2.6～44 g/L,共鉴定出32种香气成分,主要有酯类（6种）、醛酮类（4种）、醇类（6种）、酸类（8种）等,其中异戊醇、苯乙醇含量最高,分别为0.36 mg/mL和0.16 mg/mL,另外还有赤霞珠干红葡萄酒的特有香气物质3-羟基-2-丁酮（0.16 mg/mL）。菌株B2-13是一株具有较好的苹果酒发酵和产香性能的酵母菌株,有良好的工业化生产应用前景。     

传统发酵牦牛酸乳中细菌素产生菌的筛选与鉴定

从西藏羊八井地区、云南香格里拉的传统牦牛酸乳中分离出26株乳酸菌,以枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及酿酒酵母为指示菌。采用牛津杯双层琼脂扩散法检测菌株的抑菌谱大小,并经过有机酸排除、过氧化氢排除、蛋白酶水解检测试验,最终筛选得到5株产细菌素的菌株,编号分别为3、23、24、21和25。通过微生物形态学与16SrDNA序列同源性分析,鉴定这些菌株分别为干酪乳杆菌、植物乳杆菌和乳酸乳球菌乳球亚种。抑菌谱试验表明,这些细菌素能够抑制部分食源性革兰氏阳性菌和阴性致病菌,对真菌无抑菌活性。