基因重组毕赤酵母产蛋清溶菌酶发酵工艺及表达条件的优化

以甲醇诱导型蛋清溶菌酶基因重组毕赤酵母（Pichia pastoris）NCY-2为研究菌株,选用麦芽汁为培养基,首先通过单因素试验,对培养基锥形瓶种类、原麦芽汁稀释度及外加氮源进行了优化,在此基础上,采用均匀设计试验,得到菌株NCY-2的最佳发酵工艺条件为发酵温度31 ℃、pH 5.5,转速220 r/min,接种量4%;蛋清溶菌酶最佳表达条件为诱导温度18 ℃、诱导pH 4.4、转速190 r/min、甲醇初始添加量为0.3%（之后每隔24 h分别添加体积分数1.0%、1.5%、2.0%,诱导72 h结束）。在此优化条件下,摇床水平发酵液中蛋清溶菌酶酶活力可达到962.4 U/mL。     

β-葡萄糖苷酶产生菌摇瓶发酵条件的研究

本实验对产β-葡萄糖苷酶融菌株的摇瓶发酵条件进行了研究。采用正交交互试验对融合菌株发酵生产β-葡萄糖苷酶的摇瓶发酵条件进行优化。结果表明,最优摇瓶发酵条件：装液量20ml／250ml,接种量12％,发酵温度27℃,摇床转速180r／min,发酵时间7d。此条件下,β-葡萄糖苷酶活力为5．312U／ml。     

产纤维素酶细菌的微波诱变及产酶条件的研究

以实验室保藏的产纤维素酶芽孢杆菌S（3）7为出发菌,对其进行微波诱变处理,采用透明圈法初筛和液体摇瓶发酵复筛,得到一株产纤维素酶活力较高的突变菌株S（3）7-5。对该突变菌株的产酶条件进行研究,结果表明,突变菌株最适产酶条件为：发酵温度37℃,起始pH9．0,发酵时间4d。在此条件下,该突变菌株所产纤维素酶活最高,达52．55U／mL,比出发菌株的产酶活力提高了26．6％。     

重组毕赤酵母生产耐高温α-淀粉酶发酵条件的优化

利用重组毕赤酵母诱导表达可产生耐高温α-淀粉酶,在摇瓶发酵基础上,从诱导时间、甲醇添加量、pH值、接种量4个因素考察发酵条件对耐高温α-淀粉酶酶活力的影响,结合四元线性回归正交试验设计研究方法构建出甲醇诱导重组毕赤酵母生产耐高温α-淀粉酶的回归模型;优化最佳工艺参数为：诱导时间96h、甲醇添加量0.5%、接种量150mL/100mL、摇床转速200r/min。确定最优工艺条件下,耐高温α-淀粉酶酶活为217.2U/mL。     

Spinigerin α抗菌肽中试化发酵条件的研究

在已获得Spinigerin α抗菌肽摇瓶发酵条件的基础上,对其在50 L发酵罐中的初始甘油质量浓度、补料方式、甲醇与山梨醇混合比例、诱导温度、诱导pH值和诱导时间进行优化,并对诱导阶段甲醇与山梨醇混合体积比、诱导温度和诱导pH值进行正交试验。结果表明：甘油初始质量浓度10 g/L、补料方式为变速补料、甲醇与山梨醇混合体积比1∶1、诱导时间96 h、诱导温度24 ℃、诱导pH 5.0。在此最佳发酵条件下,50 L发酵罐的Spinigerin α抗菌肽产量较摇瓶条件提高20%。     

低嘌呤、高纳豆激酶活性枯草芽孢杆菌SH21筛选及发酵条件优化

采用酪蛋白平板初筛-摇瓶复筛的方法,从自然发酵大酱中筛选获得1株高产纳豆激酶(nattokinase, NK)的菌株SH21,经16S rRNA基因序列鉴定其为枯草芽孢杆菌。以NK酶活力及嘌呤含量为指标,通过单因素试验和响应面法优化枯草芽孢杆菌SH21液体发酵条件。在单因素试验的基础上,得出碳源、氮源、pH、接种量、发酵温度、发酵时间对菌株发酵液中NK酶活力和嘌呤含量的影响。采用Plackett-Burman设计筛选得到pH、接种量和发酵温度3个显著因素,结合Box-Behnken设计中心组合试验并进行响应面分析。优化后的发酵条件为pH 6.0,接种量3%,发酵温度38℃,在此条件下,NK酶活力由166.99 U/mL提升到204.52 U/mL,提高了1.22倍,嘌呤含量由75.4 mg/L降低到51.27 mg/L,降低了32%。该研究为进一步开发高NK酶活性、低嘌呤产量的枯草芽孢杆菌发酵产品奠定了研究基础。     

杂色云芝漆酶基因在甲醇毕赤酵母中表达条件研究

重组甲醇毕赤酵母（Pichia methanolica）工程菌PMADl6／pMETA-Lccl能分泌表达杂色云芝重组漆酶。本文通过对其发酵条件的研究，找出摇瓶发酵表达漆酶的最适培养条件：在BMMY培养基中添加0．2mmol／L的Cu^2＋．装液量为25mL／250mL三角瓶，接种量体积之比为45：25，0．5％甲醇诱导，20℃条件下摇瓶培养5d，漆酶最高酶活力达1192U／L。     

^60Coγ—DES复合诱变选育高产中性蛋白酶枯草杆菌及其发酵工艺研究

由一株枯草芽孢杆菌作为出发菌株,通过^60Coγ—DES（^60Coγ-硫酸二乙酯）进行物理化学复合诱变,采用平板酪蛋白水解圈法初筛,摇瓶复筛后,得到一株活力较出发菌株产酶活力增大44．5％的突变株。研究了发酵工艺参数对该突变菌体生长及产酶的影响,并确定了接种量1％,最佳初始pH为7．0,发酵温度为30℃的发酵工艺条件,结果证实,经过优化,可以获得较好的酶活,平均产酶能力可达到2135．43U,较原始菌株提高了59．60％。     

巴斯德毕赤酵母表达人溶菌酶分批发酵工艺研究

对毕赤酵母表达重组人溶菌酶的诱导条件进行优化研究,采用恒溶解氧的分批补料发酵方式,确定甲醇诱导最适合的pH为4.5-5.5,最适合的表达温度为25℃,在细胞密度为OD600=400的条件下开始诱导,诱导60h后发酵上清液酶活力达到14013U/ml,为进一步的工业化生产奠定了基础。     

产胞外谷胱甘肽酿酒酵母的诱变选育及发酵优化

为获得一株能产胞外谷胱甘肽（glutathione,GSH）的突变株,对酿酒酵母GAQ4进行紫外迭代诱变处理,最终筛选得到突变菌株UV3-10,其胞外谷胱甘肽含量为18.56 mg/L,是出发菌株GAQ4胞外谷胱甘肽含量的2.52倍。为进一步提高胞外谷胱甘肽含量,通过单因素试验优化突变株UV3-10发酵条件,得到其最优摇瓶发酵条件为发酵周期48 h、发酵温度34℃、摇瓶转速140 r/min、摇瓶装液量75 mL/300 mL、初始pH值为6.5;优化后其胞外GSH含量达到52.05 mg/L,是发酵条件优化前胞外GSH含量的2.80倍。     

米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质分析

根据NCBI(GenBank Accession No.:D83732.1)中注册的米曲霉内切葡聚糖酶CelB基因序列设计引物,以本实验室自行筛选的天然米曲霉基因组DNA为模板,PCR高保真扩增出内切葡聚糖酶基因eg,将其定向插入到酵母表达载体pPICZαA上,转化酵母宿主菌X33,刚果红水解圈筛选结果表明已成功表达。SDS-PAGE分析表明,表达产物分子量约为65 ku。对酵母表达工程菌X33-eg进行发酵条件优化,结果显示最适甲醇诱导浓度为0.75%,用1 L三角瓶诱导培养5天达到最高酶活120 U/mL。对重组酶的酶学性质分析表明,其最适反应pH值和温度分别为pH4.0和45℃,在30～45℃和pH3.4～pH6.9范围内可保持内切葡聚糖酶最高酶活力70%以上。     

重组大肠杆菌制备珍珠贝源抗氧化肽发酵条件优化

为进一步提高实验室前期构建的产抗氧化肽重组工程菌株DE3-p EGX6p-1-PFMAP制备珍珠贝源抗氧化肽的制备效率,通过摇瓶发酵过程中发酵条件包括诱导温度、诱导时间、IPTG浓度、培养基、摇床转速和接种量的单因素优化实验确定最佳发酵条件,并进一步利用正交实验优化50 L发酵罐发酵条件,结果表明摇瓶和50 L发酵罐最佳发酵条件一致,均为诱导温度30℃、诱导时间4 h、IPTG浓度0.2 mmol/L、培养基p H7、摇床转速220 r/min和接种量5%（v/v）。该工艺操作方便、过程简单、时间短,能高效制备出目的蛋白,为珠母贝源抗氧化肽的下一步工业化应用提供了有力技术支撑。      

毕赤酵母工程菌发酵木聚糖酶条件的响应面优化

通过单因素实验研究了诱导温度、种龄、p H、甲醇浓度以及诱导时间对毕赤酵母工程菌产木聚糖酶的影响。在此基础上进行响应面优化设计实验,并根据结果拟合小二乘二次项回归方程,探讨了各因素对木聚糖酶比酶活力的影响。确定了最优的发酵培养条件:种龄为31 h,诱导时间104 h,甲醇诱导浓度1%,发酵起始p H4.0,诱导温度为30℃,在此条件下对实验结果进行验证,得到木聚糖酶比酶活力为43526.3 U/mg。      

毕赤酵母工程菌产植酸酶补料分批发酵研究

对毕赤酵母工程菌PP-MS-NPm-4-16进行了补料分批发酵条件的研究,经摇瓶试验确定了发酵条件,即接种量为4%,生长阶段最适pH值为5.0,诱导阶段最适pH值为5.5,甲醇诱导浓度为30g/L,生长阶段添加豆油浓度为1.3%,诱导阶段豆油浓度为3%。在高密度发酵阶段,恒溶氧流加为最佳甘油补料方式,经过12h甘油补料,菌体密度OD600达145;甲醇诱导96h,酶活可达306.9kU/mL。     

毕赤酵母表面展示磷脂酶D高密度发酵优化

利用基因工程手段构建获得的一株细胞表面展示表达磷脂酶D的毕赤酵母工程菌株GS115/pKFS-pld,通过摇瓶单因素筛选进行发酵条件优化,确定了最佳发酵条件为:诱导产酶阶段28℃,初始pH6.5,甲醇浓度1.5%,装液量为30 mL/250 mL,250 r/min摇床培养144 h。在此优化条件下菌体量为19.6 g/L,酶活达17.8×10-7kat/g,分别是是优化前的1.38及1.44倍。同时进行了5 L规模发酵罐分批补料培养,结果表明15 mL(/L.h)速率流加甘油补料培养基6 h后,采用溶氧恒定流加法流加甲醇,诱导132 h后,菌体量及PLD活力分别达到67.4 g/L及27.3×10-7kat/g,是摇瓶发酵水平的3.44倍及1.53倍。     

产木聚糖酶毕赤酵母工程菌株构建及表达条件优化研究

将黑曲霉XZ-3S木聚糖酶Xyn43A成熟肽基因插入表达载体p PIC9K,重组质粒SalⅠ线性化后分别电击转化2种毕赤酵母GS115和KM71,转化液经MD平板、G418浓度梯度平板和摇瓶复筛,获得两株重组菌GS115/Xyn43A（Mut⁺）和KM71/Xyn43A（Mut^s）。其中GS115/Xyn43A菌株最优表达条件为:甲醇浓度2.0%,接种时间24 h,诱导时间108 h,诱导温度30℃、诱导培养基初始p H6.3;KM71/Xyn43A菌株最优表达条件为:甲醇浓度1.75%,接种时间26 h,诱导时间132 h,诱导温度30℃、诱导培养基初始p H6.5。在最优表达条件下两重组菌GS115/Xyn43A和KM71/Xyn43A比酶活力分别可达139.36、143.29 U/mg。      

一株木薯纤维素分解菌的发酵条件和产酶特性研究

从土壤中筛选出的一株纤维素分解菌为实验菌,以木薯粉为原料发酵,研究此菌的最佳产酶条件及其酶的性质。通过正交实验得到最佳产酶条件为初始pH为4.0,木薯粉添加量为25g/L培养液,接种量为1.5%(V/V),在33℃下恒温振荡发酵56h,此时CMC酶活高达16.982U/mL。菌体在肉汤培养基上培养24h菌体浓度最大。此菌所产酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为5.0,最适反应时间为60min。      

嗜糖假单胞菌麦芽四糖酶基因在地衣芽孢杆菌中的异源表达

为了考察重组地衣芽孢杆菌的异源表达特性,进一步提高麦芽四糖酶的发酵水平,以适用于工业化生产,研究构建了木糖诱导型的重组地衣芽孢表达系统,表达了来源于嗜糖假单胞菌的麦芽四糖酶基因,并进行了初步发酵优化。结果显示,构建的表达系统经过核酸电泳以及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)鉴定均正确,该系统在发酵过程中经过木糖诱导,重组酶能够成功地分泌至发酵液中,然后通过对诱导剂添加时间、诱导温度和发酵时间优化后,摇瓶水平的最大酶活力可达(168. 2±9. 41) U/m L。最佳的发酵条件为,在24 h添加诱导剂,诱导温度30℃,发酵至稳定期结束停止发酵。该研究为重组地衣芽孢杆菌的异源表达研究以及麦芽四糖酶的工业化应用提供了参考。