高温大曲中高产四甲基吡嗪芽孢杆菌的分离鉴定及发酵条件优化

该研究从高温大曲中分离筛选产四甲基吡嗪（TTMP）芽孢杆菌,采用细胞形态学观察、生理生化试验及分子生物学技术对高产四甲基吡嗪菌株进行鉴定,并优化四甲基吡嗪产量最高菌株的发酵条件。结果表明,经初筛从高温大曲中分离出20株产四甲基吡嗪芽孢杆菌（编号为WH1～WH20）,经过复筛得到四甲基吡嗪产量较高的菌株WH7、WH10和WH20。其中菌株WH7和WH20被鉴定为副淀粉芽孢杆菌（Bacillus paramycoides）,菌株WH10被鉴定贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。菌株WH10的最佳发酵条件为：前发酵温度37℃、前发酵时间72 h,后发酵温度60℃,后发酵时间20 h,初始pH值6.5,铵盐添加量4 g/L。在此优化条件下,四甲基吡嗪产量为728.38 mg/L,比优化前提高了167%。     

高温大曲中产四甲基吡嗪细菌的筛选及鉴定

四甲基吡嗪是中国白酒中的重要香气化合物。该研究从高温大曲中分离纯化获得26株菌株,通过V-P实验初筛,其中10株为四甲基吡嗪前体物3-羟基丁酮高产菌株。进一步通过液态发酵复筛,结合气相-质谱联用（GC-MS）仪分析测定,最终筛选出2株高产四甲基吡嗪的菌株A7和A18,其四甲基吡嗪产量分别为350.98 mg/L、163.49 mg/L。根据菌落形态特征和16S rRNA序列分析,菌株A7和A18分别被鉴定为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）和蛋白水解芽孢杆菌（Bacillus proteolyticus）。菌株A7发酵产物GC-MS结果显示,吡嗪类化合物相对含量最高,达到了47.05%,其中以四甲基吡嗪为主,相对含量为45.30%。菌株A7和A18均可应用于白酒酿造工艺改进,提升原酒中四甲基吡嗪的含量,增加白酒保健功能。     

高温大曲中高产吡嗪类物质芽孢杆菌的筛选与应用

采用高温培养和固态发酵,从高温大曲中筛选高产吡嗪菌株,并通过顶空固相微萃取及气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）技术检测菌株代谢产物。将高产吡嗪菌株应用于大曲生产,使用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）检测强化大曲中吡嗪类物质含量。结果表明,共筛选出6株高产吡嗪菌株（编号为X1、X2、X4、X6、X8、X9）,均被鉴定为芽孢杆菌（Bacillus）,其代谢产物共检出33种挥发性香气化合物,其中菌株X1代谢的吡嗪类物质含量最高为9 049.45 μg/kg;高产吡嗪菌株发酵主要对大曲贡献酱香、烘焙香以及花果香气;菌株X1强化大曲吡嗪类物质含量提升效果最好,其中四甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪含量相比对照大曲分别提升2.36倍、2.56倍、2.33倍,并且液态菌剂的效果要普遍优于固态菌剂。     

汾酒曲醅中产高温蛋白酶芽孢杆菌的分离

从汾酒厂的酒醅、酒糟、曲粉、曲块和湿曲5种样品中,分离纯化出42株芽孢杆菌.通过在酪蛋白平板上测定透明圈筛选得到1株在高温下产蛋白酶能力很强的菌株,编号为W20.W20的产酶最适温度为55℃,产酶能力随pH值的升高先增大后减小,在pH值为7时产酶能力最强.蛋白酶标准测定法结果也证明W20是1株高产高温蛋白酶芽孢杆菌菌株.55℃时测得的蛋白酶活力高达708.33U/mL.     

高温大曲中产耐热性蛋白酶芽孢杆菌的筛选和鉴定

从高温大曲样品中通过分离纯化,在牛奶琼脂平板上初筛得到产耐热性蛋白酶的菌株,然后液体发酵培养测定蛋白酶酶活挑选出产酶较强的菌株A1。在经过菌株形态特征、生化鉴定、16SrDNA分子生物学鉴定为芽孢杆菌属苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。选择三个主要影响因子葡萄糖、酵母浸出粉和pH,运用响应面法优化发酵培养基,最佳产酶培养基为pH为8.4,葡萄糖添加量为1.092%,酵母浸出粉添加量为0.902%,最佳酶活力为142.81u/mL。测定蛋白酶酶作用的最适温度是61℃,且在55～70℃之间有较高的酶活力,60℃相对酶活为97.63%。      

偏高温大曲发酵过程中芽孢杆菌的演替

采用经典微生物学方法和16S rRNA基因系统发育分析的方法,对偏高温大曲发酵过程中的芽孢杆菌类群及其演替情况进行了分析。结果表明,在偏高温大曲发酵过程中,芽孢杆菌数量从拌料的6.0×105个/g曲快速上升到最大值3.2×107个/g曲（第一次翻曲,4 d）,最后降低到1.1×106个/g曲;芽孢杆菌类群从最初的3种增加到10种后减少至第一次翻曲时（4 d）的9种,随后多样性持续下降,到收曲时仅检测到6种。同时发现,在整个发酵过程中Bacillus licheniformis为绝对优势种,在整个发酵环节中均存在。Bacillus产芽孢的特性保证了其种群的延续性。     

高温大曲中芽孢杆菌菌群多样性解析及其分离株鉴定

为探究湖北襄阳地区高温大曲中芽孢杆菌（Bacillus）菌群多样性,该研究通过下载并筛选高温大曲样品芽孢杆菌相对含量>2.0%的测序数据,采用Illumina Mi Seq高通量测序技术和传统纯培养技术相结合的方法对大曲样品中芽孢杆菌多样性进行解析。结果表明,高温大曲中芽孢杆菌相对含量>2.0%的样品共有12份,包括8份白色大曲样品和4份黄色大曲样品,所有样品共获得77 825条代表性序列,1 197个操作分类单元（OTUs）。多样性分析结果表明,较之黄色大曲,白色大曲样品中芽孢杆菌的超1指数和发现物种数显著偏高（P<0.05）。OTU分析结果表明,OTU5321和OTU5291在所有样品中均存在,其在白色大曲和黄色大曲中累积包含序列分别占总序列数的49.43%和41.32%。传统纯培养技术分析结果表明,解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）为高温大曲中芽孢杆菌的主要可培养菌种。由此可知,白色大曲芽孢杆菌群落结构的丰富度更高,且解淀粉芽孢杆菌为高温大曲中芽孢杆菌的主要可培养菌种,为后续高温大曲中芽孢杆菌的应用及菌种选育具有指导作用。     

大曲中产酱香芽孢杆菌的筛选及其代谢产香探析

对茅台酒生产各环节所采集的28个样品进行了初步分析,从高温大曲制作过程的不同环节筛选出芽孢杆菌104株,用麦曲模仿升温发酵筛选产香的菌株,经鉴定分别为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等,其中产酱香优良的菌株25株,分为多种香味,与不产香型的细菌对比,产酱香的25株均能产生二乙酰、乙偶姻、蛋白酶、淀粉酶等,结合茅台的生产流程分析了其产香的可能机制,得到结论：芽孢杆菌在大曲发酵过程中产生蛋白酶和淀粉酶等多种酶类和代谢物质,进而在高温、偏酸环境下通过美拉德反应产生吡嗪等多种茅台酒特征香味物质。     

中高温大曲中芽孢杆菌多样性及代谢特征研究

为探究大曲中芽孢杆菌的代谢特征和功能性,首先采用传统培养法结合分子生物学技术从中高温大曲中分离、鉴定芽孢杆菌,对其微生物多样性进行分析;然后通过耐受性分析从中筛选优势菌,最后利用代谢组学方法分析其代谢特性。结果表明,共分离、鉴定得到49株芽孢杆菌,其中3株芽孢杆菌耐受性较好,分别为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）BA-5、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS-7和贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）BV-10。从单菌株及混合菌株发酵后的发酵液中共检测到23种挥发性代谢物和52种非挥发性代谢物,其中,愈创木酚以菌株BS-7单独培养时含量最高,为8.56 mg/L。同时芽孢杆菌混合发酵会增加4-乙烯基愈创木酚的生成量,在菌株BV-10和BA-5混合培养后,达到104.47 mg/L,说明芽孢杆菌单菌株及种间协同作用对白酒酿造中的特征物质形成具有重要影响。     

高温大曲中一株酱香功能菌的分离鉴定及验证

从不同类型的高温大曲中筛选出31株芽孢杆菌,通过对各菌株的理化特性及产香实验,认定1株菌为产酱香的功能菌。经生理生化及其分子生物学鉴定为腊样芽孢杆菌。     

酱香型大曲中产淀粉酶菌的分离鉴定及发酵特性研究

对酱香型大曲中高产淀粉酶菌株进行分离鉴定,并对其产酶条件和代谢产物进行研究。结合形态学指标和16S rDNA同源序列分析对筛选获得的酱香型大曲中高产淀粉酶菌株进行鉴定,以小麦、麸皮浸提液为液体发酵培养基,研究培养温度、培养基pH值、摇床转速对其产淀粉酶能力的影响。结果显示,该分离菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）,产酶最适条件为：培养温度50 ℃、初始pH值6.0、摇床转速为180 r/min,其酶活力达8 667.79 U/mL。     

襄阳地区高温大曲和中高温大曲真菌多样性解析

采用Illumina MiSeq高通量测序技术对采集自湖北省襄阳市某酒厂的高温大曲和中高温大曲的真菌群落结构进行解析。结果表明,高温大曲真菌类群以嗜热真菌属（Thermomyces）（57.43%）和嗜热子囊菌属（Thermoascus）（30.73%）为主,而中高温大曲真菌类群以嗜热真菌属（Thermomyces）（48.05%）、嗜热子囊菌属（Thermoascus）（17.72%）和曲霉菌属（Aspergillus）（14.56%）为主。虽然两类大曲共有核心操作分类单元（OUT）包含的序列数占总序列数的64.21%,但经主坐标分析（PCoA）和聚类分析（CA）发现两类大曲在空间排布上呈现明显分离趋势。经线性判别分析效应量（LEfSe）分析发现,导致两类大曲真菌群落结构存在差异的菌属为嗜热真菌属（Thermomyces）。一些真菌类群在高温大曲和中高温大曲中均存在,但两类大曲亦具有各自较为独特的真菌类群。     

高温大曲曲房空气中可培养细菌的分离鉴定及产酶特性

以高温大曲曲房空气中可培养细菌为研究对象,对其进行分离鉴定及产酶特性研究;将得到的优势功能细菌进行高粱汁液态发酵,利用气相色谱—质谱联用法分析其代谢产物。结果表明：从高温大曲曲房空气中共分离出8种菌株,分别为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、Pedobacter suwonensis、血红鞘氨醇单孢菌（Sphingomonas sanguinis）、Massilia sp.、Delftia sp.和 Sphingobacterium sp.;经产酶试验筛选得到3株优势功能菌：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）,均具有纤维素分解能力、淀粉和蛋白水解能力;3株菌的生长曲线表明液体培养4 h达到对数生长期,在高粱汁液态发酵48 h后,优势代谢产物为3-羟基-2-丁酮,且四甲基吡嗪含量也较高,并代谢产生少量高级醇、酚类、酯类等芳香物质。     

酱香大曲中产四甲基吡嗪细菌的分离鉴定及其功能性研究

采用稀释平板涂布法从酱香型白酒大曲中分离筛选出细菌菌株19株,模拟酱香型白酒生产发酵工艺,获得2株固态发酵产物具有浓郁酱香气味的菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201。结合菌株形态学观察、生理生化实验和分子生物学方法,鉴定其为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。研究发现,菌株FBKL1.0199具有高产蛋白酶的特性,其中性蛋白酶活力达3 925. 80 U/g,酸性蛋白酶活力也相对较高,达139.27 U/g。同时,利用固相微萃取-气质联用技术对菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201模拟白酒固态发酵的挥发性香味物质进行分析,发现其中吡嗪类物质相对含量较高,分别为46.01%和48.32%,且均以四甲基吡嗪为主,含量分别为44.11%和47.41%。分离得到的菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201可以作为产四甲基吡嗪的功能菌。     

一株芝麻香型白酒高温大曲细菌Q2B1的鉴定及其产酶活性研究

大曲细菌关系到白酒酿造的品质,其中酶的含量与活性与白酒的风味紧密关联。以芝麻香型白酒高温大曲优势细菌代表菌株Q2B1为研究对象,利用分子生物学技术对其分类学地位进行研究,并通过全基因组研究技术对产酶相关功能基因与代谢通路进行研究。结果表明,菌株Q2B1被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。利用传统的培养技术定性定量地检测其酶活力,发现菌株Q2B1可产淀粉酶和蛋白酶,活力分别为5.852 U/mL和26.770 U/mL;其产酶相关功能基因组长度为3 475 602 bp,包括蛋白酶编码基因以及淀粉酶编码基因,在基因水平上初步揭示了Q2B1菌株合成蛋白酶和淀粉酶的分子机理,为进一步合理开发白酒大曲微生物奠定理论基础,为提高白酒品质提供科学依据。     

中高温大曲中产香细菌的筛选鉴定及培养条件初步研究

以洋河中高温大曲为原料,采用热处理平板涂布法分离、纯化出耐高温细菌,通过液体发酵筛选出产香细菌,选择产香效果最佳菌株进行生理生化分析与16SrDNA同源性分析,并对其固体培养条件进行优化.结果 表明:从洋河中高温大曲中分离筛选出8株产香细菌,其中编号B4菌株产香最浓郁.经鉴定B4菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus s...