浓香型白酒不同窖龄窖池窖泥中古菌群落结构分析

用高通量测序技术对浓香型白酒不同窖龄窖池窖泥中古菌群落结构进行研究,找出其差异性,并利用古菌群落结构信息对不同窖龄窖泥进行聚类分析,同时分析环境因子对各个窖龄段窖泥古菌的影响。结果表明,窖泥中的古菌群落主要分布于Euryarchaeota(占99%OTU数目),分布于7个属;窖泥中古菌的多样性与窖龄呈负相关,Methanobacterium和Methanocorpusculum的优势度与窖龄呈正相关,Thermoplasmatales的优势度与窖龄呈负相关;5 a窖龄的不同窖池窖泥和100 a窖龄不同窖池窖泥微生物群落相似性较高,30 a窖龄的不同窖池窖泥微生物群落差异性较大,对各窖龄段窖泥中古菌群落影响最大的环境因子各不相同。浓香型白酒不同窖龄窖池窖泥古菌群落结构差异性明显,这可能是不同窖龄窖池发酵产酒存在差异性的重要原因之一。     

基于高通量测序的宋河浓香型白酒不同窖龄窖泥细菌群落结构分析

以宋河浓香型白酒不同窖龄窖泥为研究对象,采用Illumina Miseq高通量测序技术和典范对应分析（CCA）等方法探究细菌菌群结构变化特征及其环境影响因素。结果表明,16年窖龄窖泥的细菌群落结构多样性高于6年窖龄窖泥,相同窖龄、同一窖池的窖底泥高于窖壁泥。6年窖壁泥与窖底泥的细菌群落结构相似,绝对优势细菌属均为乳酸菌属（Lactobacillus）。16年窖壁泥与窖底泥的细菌群落结构差异较大,共有绝对优势细菌属为梭菌属（Clostridium）、氨基酸杆菌（Aminobacterium）、理研菌属（Petrimonas）、互营单胞菌属（Syntrophomonas）和Sedimentibacter。特有绝对优势细菌属中Lactobacillus相对丰度的降低以及Clostridium和Aminobacterium相对丰度的迅速增长均表明16年窖池已成为趋于老熟化的优质窖池。CCA分析结果推测,pH和有机物可能是影响16年窖池细菌群落结构改变的主要环境因子。     

浓香型白酒窖池空间位置及窖龄对窖泥原核微生物群落的影响

采用高通量测序技术解析4年和40年窖龄窖池不同部位窖泥原核微生物群落组成,并分析窖泥理化性质差异以及其对原核微生物的影响。结果表明,除总酸外,4年窖龄窖池窖泥样品的平均含水量、pH值、铵态氮含量、有效磷含量和α-多样性指数均低于40年窖龄窖池窖泥,40年窖龄上、中、下、底层窖泥理化性质及α-多样性均相对稳定,且4年和40年窖龄窖池窖泥理化指标的差异主要体现在上层和中层。从门和属水平组成上分析,40年窖龄窖池窖泥样品微生物群落结构相对稳定,且与4年窖龄窖池下层和底层窖泥样品更为相似。冗余分析（RDA）结果表明,总酸、有效磷和pH是影响不同窖龄和不同窖池位置窖泥中优势微生物菌群分布的主要理化因子。     

基于磷脂脂肪酸剖析不同老熟方法的窖泥微生物群落结构

针对白酒发酵过程中窖泥微生物群落结构的特殊性,采用磷脂脂肪酸（PLFA）指纹图谱法对不同老熟方法制备的窖泥的微生物群落特征进行研究。结果表明,使用方法C制得的窖泥经三轮次酿酒生产后,其中的微生物多样性较方法A与方法B丰富,且特征PLFA的种类与50年以上窖龄窖池窖泥相同;使用方法C制得的窖泥微生物含量高于方法A与方法B,并接近于50年以上窖龄窖池窖泥;使用方法C制得的窖泥微生物群落结构特征与50年以上窖龄窖池的相似度最高。使用方法C的窖池所生产的浓香型白酒出酒率最高,为（36.52±0.67）%,窖香浓郁、酒体丰满、入口醇甜、味长、尾净。因此,使用方法C所制得的窖泥优于方法A与方法B。     

不同窖龄及位置浓香型白酒窖泥中细菌群落结构的差异性分析

采用高通量测序技术对金徽酒不同窖龄及窖池位置的窖泥细菌群落进行研究,通过聚类分析探寻细菌菌群的时空分布特点,并对窖泥微生物的功能基因进行注释分析。结果表明,14个窖泥样品中,厚壁菌(Firmicutes)是细菌群落的绝对优势菌门,平均相对丰度达73.39%。乳杆菌(Lactobacillus)是5年和7年窖龄窖泥(84.48%)的第一优势菌属。随着窖龄的增加,优势菌属由单一Lactobacillus占优势演变为己酸菌(Caproiciproducens,4.61%)、拟杆菌(Bacteroides,3.16%)等11个细菌属共存的复杂微生态环境。窖泥细菌菌群多样性与窖龄呈显著正相关(P<0.01),且池底窖泥的细菌菌群多样性高于池壁泥。30年和50年窖龄的窖泥细菌群落相似性较高,且细菌菌群之间大多呈正相关关系。同现网络中共出现9个枢纽,各枢纽均与Lactobacillus呈负相关关系。KEGG功能注释图说明影响白酒产量和质量的主要功能基因在窖泥主体特征代谢分类上。该研究为解析甘肃金徽酒窖泥中的细菌群落结构及其时空分布规律奠定了基础。     

基于高通量测序的窖泥原核微生物群落结构及其理化因子相关性分析

为揭示各项理化特性对窖泥细菌群落结构的影响,分析不同年份窖泥的理化因子差异及与其原核微生物群落的相关性。结果表明：20 a窖池池壁和池底窖泥中的水分、pH值、铵态氮及有效磷和速效钾的含量均显著高于2 a窖泥,但其钙含量却显著低于2 a窖泥。30 a池壁和池底窖泥与2 a相比,除水分含量和腐殖质外,其他指标均存在显著差异。理化因子与菌群的相关性分析发现,水分含量、pH值和铵态氮对菌群的影响最为显著,与Lactobacillus呈极显著负相关（P＜0.01）,与Aminobacterium、Syntrophomonas和Sedimentibacter等6 个菌属呈显著正相关（P＜0.05）。新窖泥中不同的微生物菌群在长期往复的发酵过程中相互作用,优势菌属逐步占据主导低位并达到动态平衡,形成优质窖泥。本实验系统研究窖泥原核微生物群落多样性在窖泥老熟及退化过程中的变化趋势,借助微生物和理化因子之间的相关性分析,为窖池的养护机制及优质窖泥的制作提供一定理论依据。     

基于高通量测序的浓香型窖泥原核微生物群落的窖池空间分布

利用Illumina Miseq高通量测序技术解析河南某酒企6年和12年窖泥微生物群落多样性和组成。结果表明,两类窖龄窖池中窖泥原核微生物群落组成具有相似的空间分布特征,且物种丰度（Chao1指数）和多样性（Shannon指数）均分别在窖壁中层和下层窖泥最高;乳杆菌属（Lactobacillus）、产己酸菌属（Caproiciproducens）、嗜蛋白菌属（Proteiniphilum）及甲烷囊菌属（Methanoculleus）等14个属为窖泥优势属,其中78.6%优势属在两类窖龄窖池下部（下层和窖底）窖泥中含量均高于窖池上部（上层和中层）窖泥,且主要隶属于梭状芽胞杆菌纲（Clostridia）和拟杆菌纲（Bacteroidia）;57.6%（19/33）Top10属的空间分布特征与窖龄无关;随窖龄增加,Top10属产生了132个变化,其中75.6%的变化均较小（＜1%）;冗余分析（RDA）结果推测,铵态氮和有效磷可能是影响供试窖泥原核微生物菌群空间分布的主要环境因子。     

陶融型白酒正常和退化窖泥细菌群落多样性解析及其理化影响因素

利用高通量测序技术解析陶融型白酒正常窖池和退化窖池窖泥细菌群落多样性及其在窖池中的空间异质性,并通过冗余分析（RDA）影响微生物群落的主要理化因素。结果表明,退化窖池窖泥的含水量（36.78%）、pH值（5.50）及铵态氮含量（23.48 mg/100 g）均低于正常窖池窖泥,而总酸含量（13.00 mg/g）和有效磷含量（27.32 mg/100 g）与之相反。窖泥中细菌群落存在明显的空间异质性。与正常窖池窖泥相比,退化窖池窖泥中主要优势细菌门厚壁菌门（Firmicutes）（64.32%）、拟杆菌门（Bacteroidetes）（12.58%）以及主要优势细菌属己酸菌属（Caproiciproducens）（3.03%）、嗜蛋白菌属（Proteiniphilum）（6.60%）、棒状杆菌属（Caldicoprobacter）（1.06%）的平均相对丰度较低。有效磷、总酸和铵态氮含量可能是影响不同质量窖泥细菌菌群空间分布的主要理化因子。     

基于荧光定量PCR技术分析不同窖龄窖泥的细菌含量

窖泥中的微生物主要是细菌,窖池中细菌的含量对产酒质量有着很大影响。本研究采用荧光定量PCR技术对不同窖龄窖泥进行分析,发现不同窖龄窖泥细菌含量差别很大,10年窖龄的窖泥中细菌含量是10~(8)Copies/g的级别,20年窖龄窖泥细菌含量在10~9Copies/g级别,而50年窖龄的细菌含量达到了10~(11)Copies/g级别,窖泥中细菌含量随着窖龄增加而增加。而同一窖龄不同窖池的窖泥细菌含量则非常接近。     

窖泥微生物、窖泥酶活性与窖泥养分相关性研究

对泸州老窖4种不同窖龄的窖泥进行研究,结果表明,窖泥中微生物数量规律、窖泥土壤水解N、速效K、有机质含量均为400余年窖龄>100余年窖龄>40余年窖龄>20余年窖龄。窖泥中土壤微生物与土壤酶活性间均呈正相关。通过各因子对窖泥中土壤微生物总数、土壤酶活性的通径分析发现:速效P、水解N、蔗糖酶和过氧化氢酶是影响微生物总数量的主要因子。     

Microbial community structure of pit mud in a Chinese strong aromatic liquor fermentation pit

Pits are necessary solid bioreactors for the production of Chinese strong aromatic liquor, and the microbial community in these pits significantly affects the quality and yield of the liquor. In this study, the microbial community structures of different aged pit muds were evaluated by phospholipid fatty acid analysis. The results indicated that the microbial community was composed of bacteria, actinomycetes and fungi, with Gram‐positive (G⁺) bacteria and anaerobic bacteria being dominant. The biomass of the pit mud increased and the microbial community shifted to G⁺ bacteria as the pit age increased. Principal component analysis showed that PC1 consisted mainly of fatty acids of saturated (15:0, 16:0 and 18:0), methyl‐branched (a15:0, i16:0, a16:0, i17:0 and 8Me18:0), polyunsaturated (16:1ω7c, 16:1ω9) and cyclopropane (cy17:0 and cy19:0), and PC2 mainly of 18:1ω9, 18:1ω10 and a14:0, The characteristics of the microbial community structure in the pit mud resulted from the stress effects of low oxygen concentration, low pH and a high alcohol concentration. Copyright © 2013 The Institute of Brewing & Distilling     

Illumina高通量测序技术分析中周羌稞养生酒窖泥细菌多样性

以不同窖龄（5年、10年、20年和30年）的中周羌稞养生酒窖泥为研究对象,利用Illumina高通量测序技术对窖泥细菌16S rRNA V4～V5区进行测序,分析其细菌多样性。结果表明,窖泥中细菌多样性（Shannon指数）和丰富度（Chao指数）随着窖龄的增加而显著提高（P＜0.05）。不同窖龄窖泥的细菌群落组成存在差异,盐扁菌科（Haloplasmataceae）、乳酸杆菌科（Lactobacillaceae）,瘤胃球菌属（Ruminococcaceae）和梭菌属（Clostridium）为不同窖龄窖泥的共有细菌;类芽孢杆菌属（Paemibacillus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、消化球菌科（Peptococcaceae）、喜盐芽孢杆菌属（Haloballus）和链球菌属（Streptococcus）只出现在30年窖龄窖泥中;PCA结果分析表明,相同窖龄窖泥中的细菌具有更高的相似性,说明窖龄是影响窖泥细菌群落组成的重要因素之一。     

宋河浓香型白酒不同窖龄窖壁泥与窖底泥真菌菌群结构分析

采用Illumina Miseq高通量测序技术分析宋河浓香型白酒不同窖龄（6年、16年）窖池窖壁泥和窖底泥真菌菌群结构变化。结果表明,老窖池窖泥中真菌菌群物种丰富度高于新窖池,窖底泥多样性高于新窖池,但窖壁泥低于新窖池;窖壁泥中真菌菌群物种多样性和丰富度均高于窖底泥。在门水平上,新老窖池窖泥的绝对优势菌门均为子囊菌门（Ascomycota）,相对丰度为68.7%～86.2%。在属水平上,相同窖龄窖池窖壁泥和窖底泥真菌菌群结构分布接近,不同窖龄窖池窖泥真菌菌群在优势物种组成上发生了改变,新窖池窖泥的优势真菌群（相对丰度≥1%）主要有青霉属（Penicillium）、毡盘菌属（Byssonectria）和被孢霉属（Mortierella）等,老窖池窖泥的优势真菌主要有嗜热真菌属（Thermomyces）、曲霉菌属（Aspergillus）和根毛霉属（Rhizomucor）等,表明窖龄及窖泥位置均可不同程度的影响真菌菌群结构分布,窖龄可能是影响的主导因素。     

文王浓香型白酒不同深度新老窖泥理化性质与微生物演替分析

目的:本研究分析了新窖（3年）和老窖（30年）不同深度窖泥（Pit Mud, PM）的有机酸和微生物群落结构关联度,以期了解窖泥在垂直维度的老化成熟规律。方法:基于Illumina MiSeq高通量测序分析窖泥微生物群落结构演替规律,结合相关性分析有机酸与微生物的作用规律。结果:垂直维度窖泥深层（4~10 cm）和浅层（0~4 cm）存在明显差异,老窖池浅层窖泥中的主要微生物属是Caproiciproducens,深层窖泥中Fastidiosipila和Hydrogenispora占据主导;而在新窖泥中,浅层和深层窖泥中占据主导的均是Lactobacillus、Bacillus和Clostridium sensu stricto 12,且相对丰度随窖泥深度的增加而增加。理化因子方面,新老窖池浅层窖泥与水分、己酸、丁酸、乳酸、乙酸和腐殖质的含量呈正相关,深层窖泥与氨态氮、有效磷和pH的含量呈正相关。有机酸和微生物的相关性分析发现,老窖池中Caloramatoraceae与有机酸含量呈正相关,新窖池中Lactobacillus和Hydrogenispora与有机酸含量呈正相关,Caproiciproducens与新老窖池有机酸含量均呈正相关。结论:本文探究了新老窖泥垂直维度的原核生物群落结构演替及其与理化因子的关联,为窖泥养护和窖池微生物群落的成熟和稳定提供了参考。     

甲烷囊菌属特异性引物的设计及其在古井贡酒窖泥质量评价中的初步应用

甲烷囊菌（Methanoculleus）作为优势甲烷菌存在于浓香型白酒的窖泥中,该研究对古井贡酒窖泥中含量最多的30个属的 16S rDNA全长代表序列进行傅里叶转换多序列比对（MAFFT）,得到114个可能的甲烷囊菌特异性单核苷酸多态性（SNP）位点。 对 SNP位点在甲烷囊菌属内和属外5 000多条序列进一步甄别,找出了3个效果最好的SNP位点,利用其中1个位点和半随机引物-聚合 酶链反应（SAP-PCR）技术原理设计了两对特异性引物。 以窖泥宏基因组为模板,成功扩增出了甲烷囊菌的相应序列。 将引物应用于18个 古井窖泥样本的实时定量聚合酶链反应（RT-QPCR）分析,结果表明,老厂优质窖泥中甲烷囊菌的相对含量远远高于新厂普通窖泥（最高达4 000多倍）。 利用本研究的方法原则上可以设计任意其他菌属在复杂菌群背景下的特异性引物。     

水井坊窖底泥微生物群落结构的DGGE分析

为了补充和验证研究浓香型白酒不同窖泥的微生物群落特征分析,该研究采用DGGE技术对水井坊酒厂窖龄分别为50及150年相同窖池不同部位窖底泥（三点取样法）进行细菌、古菌和真菌微生物群落特征分析。研究结果显示：50年和150年窖龄窖泥的微生物群落的演替特征和分布特征具有一定相似性,进一步验证了50年可能是窖池微生态发生较大变化的一个分界线这一推测的准确性;不同部位的窖底泥的微生物群落结构具有一定的差异性,因此在今后对窖底泥的实验研究中,采用多点取样法进行分析。     

利用DGGE分析窖泥复合功能菌液的细菌群落结构

采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析窖泥复合功能菌液中各原料(窖泥、酒糟、大曲粉、黄水、己酸菌)对其细菌群落结构的影响。群落结构相似性分析结果显示,从窖泥复合功能菌液原配方中去除酒糟、己酸菌和黄水后进行培养,菌液细菌群落结构与窖泥复合功能菌液的相似性指数(Sc)仅为0.34;多样性指数分析结果显示,去除酒糟或己酸菌,细菌多样性指数(H)显著下降(p＜0.05),去除己酸菌的窖泥复合功能菌液多样性指数(H)下降最为明显。结果表明,窖泥复合功能菌液中各组分对菌液的细菌群落结构存在一定影响,其中以己酸菌的影响最大。该研究为改良优化窖泥复合功能菌液的配方提供理论依据。