基于紫外诱变原生质体法选育高活力蛋白酶产生菌

以米曲霉沪酿3·042为出发菌株,在适宜条件下制备原生质体,并进行紫外线诱变提高蛋白酶活力。经过原生质体紫外诱变的处理和遗传稳定性实验,最终得到一株高产菌株,其蛋白酶活力的产量达1700U/g以上,约是出发菌株的1·8倍。      

基于紫外诱变原生质体法选育高活力蛋白酶产生菌

以米曲霉沪酿3·042为出发菌株,在适宜条件下制备原生质体,并进行紫外线诱变提高蛋白酶活力。经过原生质体紫外诱变的处理和遗传稳定性实验,最终得到一株高产菌株,其蛋白酶活力的产量达1700U/g以上,约是出发菌株的1·8倍。     

米曲霉制备高蛋白酶活力酱曲工艺探讨

通过对米曲霉发酵所得曲料中蛋白酶活力变化分析,探讨了制曲时间、浸豆时间、蒸豆时间、接菌量、制曲温度等条件对酱曲中蛋白酶活力的影响.结果表明,浸豆时间3 h、制曲时间84h、制曲温度32℃、121℃蒸煮25 min、每100 g大豆接入5×108 cfu/mL的米曲霉菌液1 mL效果最佳.此时,所得成曲中干基蛋白酶活力可达到839.87U/g.     

发酵鸡蛋酱制曲菌种、原料配方及工艺参数优化

以感官评价结果为依据,采用单因素实验初步确定发酵鸡蛋酱制曲菌种及原料配方。结果表明:当制曲菌种为米曲霉与酿酒酵母、蛋坯原料为80%的全蛋液+20%的黑豆粉时,酱曲的风味最好,具有橄榄菜味及淡淡的咸蛋黄味。选择蒸坯时间、蛋坯中的水分含量、制曲时间3个因素为自变量,以蛋白酶活力为指标,利用响应面法优化的制曲工艺条件是:蒸坯时间41 min、蛋坯中水分含量66.1%、制曲时间50 h,酱曲中蛋白酶的活力最高为5 797 U/g。本研究结果为鸡蛋酱产品的开发提供可行的方案。     

一株蛋白酶产生菌的分离鉴定

从郑州奶牛场土壤样品中分离到一株芽孢杆菌,命名为A—19菌株。该菌株有较高的蛋白酶活性,37℃、pH7．0培养48h后,其蛋白酶活力可达63．5U/mL。菌体生长专性需氧,有运动性,粗糙型菌落,氧化酶试验阳性,DNA（G＋C）的摩尔分数为47％。该菌株的16SrDNA序列与芽孢杆菌属有很高的同源性,Bacillus vallismortis（99．61％）,B．subtilis（98．81％）,B．amyloliquefaciens（98．95％）,B．licheniformis（97．93％）。通过其生理生化特征和16S rDNA序列相似性的系统发育分析,确定A—19菌株属于芽孢杆菌属。该菌的16S rDNA序列已被GenBank收录,序列登陆号为EU561347。     

弹性蛋白酶产生菌的分离鉴定和发酵条件研究

从污水河的土壤中采集样品,分离得到一株产胞外弹性蛋白酶活性较高且稳定的细菌。经初步鉴定属枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis B1),其酶活力为74.25U/ml。对其进行物理诱变,诱变后的菌株(B9)产酶活性有较大的提高。B9酶活力为120.00U/ml,较原菌株提高了1.62倍。同时研究了其产酶最适条件,产酶最适碳源为蔗糖,最适氮源为干酪素,并对碳源、氮源和生长因子进行了正交试验,研究发现氮源对产酶的影响最大。当蔗糖的用量为4%、干酪素为3%、玉米提取液为0.1%时具有较高的产酶水平。最适发酵初始pH为8.0、300ml最适摇瓶装量为40ml、最适接种量为3%。经发酵条件的优化后,B9酶活达到311.54U/ml、提高了2.59倍;较以往国内报道的酶活要高。     

双水相萃取分离米曲霉中性蛋白酶

采用聚乙二醇(PEG)/盐双水相体系萃取分离米曲霉中性蛋白酶。探讨了不同成相盐及其浓度、成相聚合物PEG及其浓度、pH和NaCl浓度对中性蛋白酶萃取的影响。结果表明,适宜的双水相萃取体系为20%PEG1000/25%(NH4)2SO4(m/m)、pH8.0、不添加NaCl,此条件下中性蛋白酶上相酶活回收率和纯化倍数分别为99.88%和2.32。     

高产蛋白酶米曲霉的选育

以实验室的米曲霉A.oryzae-Ⅰ_6为出发菌株,通过紫外线、高温、亚硝酸单独或复合处理,从800多株突变株中选出了一株蛋白酶活力提高的菌株A.oryzae-V_5,其生长速度更快,产蛋白酶活力比原始菌株提高了33.12％。     

硫酸铵和氯化钠混合盐析米曲霉蛋白酶的研究

硫酸铵和氯化钠是目前两种常用的蛋白酶盐析溶液,实验尝试以其混合液作为米曲霉蛋白酶盐析溶液,与单种盐析溶液提取效果进行比较,混合液盐析得到的酶活力最高133.116U/mL,硫酸铵溶液盐析得到的酶活力最高62.912U/mL,氯化钠溶液盐析得到酶活力最高65.722U/mL,即混合液盐析效果明显优于单种溶液。另外,进一步选取提取时间、提取温度、硫酸铵浓度、氯化钠浓度四个因素做L9(34)正交实验,并且在已有成果基础上改变了正交实验提取时间的水平值,最后经方差分析得到四个因素对酶活力都有显著影响,米曲霉的最佳提取条件组合为:在40℃下抽提60min后用0.2mol/L的氯化钠和0.03mol/L硫酸铵混合盐析。以该条件组合做验证实验得到的酶活力为140.011U/mL。      

硫酸铵和氯化钠混合盐析米曲霉蛋白酶的研究

硫酸铵和氯化钠是目前两种常用的蛋白酶盐析溶液,实验尝试以其混合液作为米曲霉蛋白酶盐析溶液,与单种盐析溶液提取效果进行比较,混合液盐析得到的酶活力最高133.116U/mL,硫酸铵溶液盐析得到的酶活力最高62.912U/mL,氯化钠溶液盐析得到酶活力最高65.722U/mL,即混合液盐析效果明显优于单种溶液.另外,进一步选取提取时间、提取温度、硫酸铵浓度、氯化钠浓度四个因素做L9(34)正交实验,并且在已有成果基础上改变了正交实验提取时间的水平值,最后经方差分析得到四个因素对酶活力都有显著影响,米曲霉的最佳提取条件组合为:在40℃下抽提60min后用0.2mol/L的氯化钠和0.03mol/L硫酸铵混合盐析.以该条件组合做验证实验得到的酶活力为140.011U/mL.     

1株酸浆豆腐中产蛋白酶菌种的分离与鉴定

以市售酸浆豆腐为样品,首先筛选样液适宜的稀释倍数,将样品稀释液接种于马铃薯葡萄糖平板和MRS平板进行纯培养,然后接种于脱脂牛奶培养基,以产透明圈为指标,再以酪蛋白为底物测定酶活,筛选分离产蛋白酶菌种,继而通过肉眼观察菌落形态、光学显微镜和电镜、显微镜观察菌体形态,进一步通过各种生理生化反应、ITS测序方法进行菌种鉴定。结果表明:25 g样品稀释至10^-5浓度适宜,在脱脂牛奶培养基中,温度28 ℃、有氧培养72 h后产生透明圈,酶活为9.6 U/mL;肉眼观察菌落为乳白色,呈绒毛状,有同心圈并呈放射线状,显微镜下节孢子呈单个或链状,扫描电镜观察菌丝体宽4~5.5 μm,孢子大小多数为(3.3~5.7) μm×(7.0~17.1) μm;根据生理生化反应结果,查阅《真菌鉴定手册》,鉴定为白地霉(Geotrichum candidum);ITS测序显示与白地霉同源性达100%。根据生长曲线可知,0~8 h,菌株处于延迟期;8~40 h,菌株处于对数期;40~68 h,菌株处于稳定期;68 h以后,菌株处于衰亡期。     

米曲霉M3产蛋白酶特性研究

对比了本课题组从自然发酵的豆酱中分离的三株蛋白酶活力较高的菌株，对其中蛋白酶活力最高的菌株M3的菌丝和孢子形态进行了观察，初步判断为米曲霉，并对其培养条件进行了探索。结果表明：M3在培养基组成为麸皮：葡萄糖：水=9：1：5的条件下，接种3mL孢子菌悬液，28℃培养72h时酶活最高。     

传统发酵豆酱中产蛋白酶菌株的筛选

该研究从东三省各地采集家庭自制豆酱254份,通过分离培养,获得纯培养真菌菌株389株。采用脱脂牛奶平板初筛获得具有蛋白酶活性的菌株31株,其中曲霉属真菌12株、青霉5株、毛霉4株、镰孢菌3株、帚霉1株、芽枝孢3株、犁头霉1株、红曲2株。通过发酵复筛提取其粗酶液,用福林酚法测定粗酶液的蛋白酶活性,筛选出了两株具有较高蛋白酶活性的米曲霉。     

脱苦蛋白酶霉菌菌株的选育

从自然发酵的豆酱中分离得N3株蛋白酶高产菌株M1、M2、M3和供试的安全菌株毛霉、黑曲霉、栖土曲霉在各自的固、液体发酵培养基中培养，从中筛选出蛋白酶活力最高且蛋白酶液能脱除苦味肽苦味的菌株M3。根据M3菌株的菌落形态和菌体形态确定属于曲霉属。     

Xi-3米曲霉菌株的保藏与复壮

介绍了Xi-3米曲霉菌株的保藏与复壮的具体做法。采用麸皮保藏法可以使Xi-3米曲霉保藏18年之久且菌种优良性状不变；行之有效的复壮措施，提高了保藏菌株的优良性状和生产性能，为种质资源的可持续发展作出了贡献。     

上海临港海域产蛋白酶海洋细菌的筛选及鉴定

从上海临港海域采集海水及海泥样品,分离得到170株海洋细菌,经酪蛋白点种法初筛及福林酚显色法复筛筛选到一株高产蛋白酶菌株SE2011。通过形态学观察、生理生化鉴定及16SrDNA鉴定和系统发育分析,鉴定为鳗利斯顿氏菌。生长特性研究表明,该菌在15～30℃范围内生长良好,最适生长温度为30℃;生长盐度范围为0～7%(W/V),最适生长盐度为1%(W/V)。酶学性质研究表明,该菌所产蛋白酶在30～90℃范围内有活性,最适温度为55℃;在pH6.0～10.0之间有活性,最适pH为8.0,属碱性蛋白酶范畴。      

酱香型大曲中产蛋白酶放线菌的分离及产酶条件研究

对酱香型大曲中高产蛋白酶的放线菌进行分离鉴定,并对其产酶特性进行研究。通过稀释涂布划线法和平皿生化反应法对目的菌株进行分离纯化,并运用形态学特征和遗传学特征对目的菌株进行鉴定。并对目的菌株的产酶条件进行优化。结果显示,分离出的菌株经分子生物学鉴定为娄彻氏链霉菌（Streptomyces rochei）,经单因素与正交试验优化得出的最佳发酵条件为pH值9.0,发酵温度35 ℃,转速180 r/min,此时酶活力最高为28.62 U/mL。     

米曲霉种内原生质体融合选育优良菌株

米曲霉HL和L5是来自酱油酿造企业的生产菌株。HL的生长速度快,而L5的中性蛋白酶活力高。以HL和L5为亲本,进行原生质体融合,筛选得到一株融合株R6。融合株比亲本株生长速度更快,孢子成熟时间快3h,中性蛋白酶活力分别比2株亲本菌株提高25.6%和19.9%,酱醅氨基氮值也比亲本菌株提高8%和5.6%。     

Construction of the mutant strain in Aspergillus oryzae 3.042 for abundant proteinase production by the N+ ion implantation mutagenesis

Because of secreting large amounts of enzymes, Aspergillus oryzae was widely used in the fermentation of soy sauce in many Asian countries. Here, N⁺ ion implantation mutagenesis was applied to improve the ability of A. oryzae to secrete acid protease. Several mutants were screened using three kinds of plates (Casein medium, Czapek’s medium and carboxymethyl cellulose medium agar plates). Compared with the other mutants, the mutant A100‐8 could secrete the most protease. Acid protease activity of A100‐8 was enhanced about 44.1% at 36 h by koji fermentation test. In addition, A100‐8 was stable by periodically subculturing and maintaining on the agar slant. The mRNA expression levels of two kinds of acid protease (serine carboxypeptidase and aspartyl protease) were measured by RT‐PCR at different periods. Serine carboxypeptidase and some kinds of aspartyl protease of A100‐8 were significantly (P < 0.01) expressed higher than the control at all times.     

粟米酱米曲霉菌的分离、筛选与鉴定

反复纯化培养自然发酵的粟米酱中分离的野生丝状真菌，经形态学鉴定，确认其为米曲霉菌群的米曲霉菌。用福林-酚法测定其蛋白酶活力，并确定活力最高的菌株。实验表明选育优良的米曲霉菌株不仅要考察菌株的蛋白酶活力，也要考虑菌株孢子的比生长速率。