口蹄疫病毒WFL株2C-P3-3′NCR片段的克隆及适于设计siRNA的序列分析

目的筛选出口蹄疫病毒(FMDV)基因组上适于设计siRNA的基因片段。方法以FMDV WFL株RNA为模板,用3′RACE法扩增出2C-P3-3′NCR序列,将PCR扩增片段克隆到pMD18-T载体上,转化E.coli DH5α,筛选阳性重组子,进行序列测定,并与参考毒株序列比较。结果扩增的基因片段大小为4033bp,其2C、P3和3′NCR序列的核苷酸序列与参考毒株的同源性分别为87·11%～94·23%、84·91%～96·66%和66·98%～82·35%,2C和P3与参考毒株的氨基酸同源性分别为94·97%～99·39%和91·84%～98·55%,WFL株P3基因的第1150～1270、1680～1840和2080～2490bp以及2C基因的第354～470bp范围内与参考毒株具有高度保守的特性。因此,可以依据siRNA设计原则,在这4个区域内筛选抑制效果好的siRNA。结论成功克隆了FMDV WFL株2C-P3-3′NCR基因的序列,并筛选出4个适于设计siRNA的基因区段。     

口蹄疫病毒衣壳蛋自前体P1基因和蛋白酶3C基因的克隆及序列分析

［摘 要］目的 对口蹄疫病毒（FMDV）衣壳蛋白前体P1基因和蛋白酶3C基因进行PCR扩增、克隆和序列分析，了解FMDV基因型与血清型的相关性及分子免疫机理，便于疫苗株的选择。方法 应用RT－PCR方法扩增了 CC－1毒株的衣壳蛋白前体 P1基因和蛋白酶 3C基因，并将其克隆到pGEM-T easy载体上，分别构建含有P1基因和3C基因的两个重组质粒pGEMP1和pGEM3C，并进行核苷酸序列分析。结果CC-1株与相同血清型毒株P1基因核苷酸序列和氨基酸序列存在较高的同源性，与不同血清型毒株P1基因氨基酸序列的同源性差异显著，而不同血清型毒株的蛋白酶3C基因氨基酸序列的同源性均在 90％以上。结论 成功地克隆了 FMDV P1区基因和蛋白酶3C基因，为选择口蹄疫病毒疫苗株提供了背景材料。     

鹅细小病毒VP3基因的克隆及序列分析

目的克隆鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)黑龙江各分离株和疫苗株的VP3基因,并进行序列分析,为小鹅瘟的诊断与防治奠定理论基础。方法根据GenBank中登录的GPV B株全基因序列设计1对特异性引物,PCR扩增、克隆VP3基因,并进行测序和同源性分析。结果克隆的VP3基因大小699 bp,编码233个氨基酸;7个分离株的VP3基因核苷酸序列同源性为99.4%～100%,各分离株与疫苗株的核苷酸序列同源性为98.7%～99.3%,与标准B株的核苷酸序列同源性为97.6%～97.7%,与MDPV核苷酸序列的同源性为80.8%～81.7%;各分离株之间亲缘关系较近,其中QTH分离株与疫苗株亲缘关系最近,氨基酸序列同源性为97.8%,其他分离株与疫苗株的亲缘关系相对较远,氨基酸序列同源性为96.6%～97.4%;所有分离株和疫苗株与标准B株亲缘关系相对较远,与MDPV的亲缘关系最远。结论黑龙江省各分离株与疫苗株的核苷酸和氨基酸序列存在一定的差异。     

口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1基因和蛋白酶3C基因的克隆及序列分析

目的 对口蹄疫病毒（FMDV）衣壳蛋白前体P1基因和蛋白酶3C基因进行PCR扩增、克隆和序列分析，了解FMDV基因型与血清型的相关性及分子免疫机理，便于疫苗株的选择。方法 应用RT-PCR方法扩增了CC-1毒株的衣壳蛋白前体P1基因和蛋白酶3C基因，并将其克隆到pGEM-T easy载体上，分别构建含有P1基因和3C基因的两个重组质粒pGEMP1和pGEM3C，并进行核苷酸序列分析。结果 CC-1株与相同血清型毒株P1基因核苷酸序列和氨基酸序列存在较高的同源性，与不同血清型毒株P1基因氨基酸序列的同源性差异显著，而不同血清型毒株的蛋白酶3C基因氨基酸序列的同源性均在90%以上。结论 成功地克隆了FMDV P1区基因和蛋白酶3C基因，为选择口蹄疫病毒疫苗株提供了背景材料。     

传染性法氏囊病病毒疫苗株B87基因组A节段的克隆和序列分析

目的获得传染性法氏囊病病毒疫苗株B87 A节段全长cDNA,并对其进行序列分析。方法使用蛋白酶K、酚/氯仿抽提法提取病毒基因组,用LiCl分级沉淀方法纯化病毒基因组dsRNA,通过RT-PCR一步扩增获得A节段的全长cD-NA。将其克隆至pGEM-T载体上,测序,并用DNAStar软件进行序列分析。结果测序结果表明,克隆的B87株A节段全长为3 260 bp,与Gt株的同源性最高为99.5%,与其他毒株的核苷酸同源性介于95.2%~99.4%之间,与Ⅱ型毒株OH仅为84.0%。结论通过对20株IBDV编码氨基酸序列的分析、比较,推测A片段上7个独特的氨基酸位点可能与毒力相关。     

水痘-带状疱疹病毒Oka株gC基因的克隆及序列分析

目的对水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)Oka株gC基因进行克隆及序列分析。方法取第40代Oka VZV疫苗株,反复冻融3次后,收集上清,提取病毒DNA,根据NCBI登录的Dumas株VZV序列,设计引物,扩增gC基因,与pMD19-T Vector连接后,热转化至E.coli Competent Cells JM109中,挑选阳性菌落进行测序;将得到的序列与Gen Bank中登录的其他12株VZV毒株的gC基因序列,进行核苷酸序列和氨基酸水平分析。结果 13株VZV-gC基因开放阅读框(ORF)的核苷酸长度为1 557~1 776 bp,编码的蛋白由519~592个氨基酸组成。核苷酸序列同源性在94.8%~100%之间,氨基酸序列同源性在93.9%~100%之间。R2重复拷贝数为7,Dumas、SVETA和Ellen重复拷贝数为6,LAX1为4。结论 VZV Oka株gC蛋白具有高度的保守性,与其功能的发挥密切相关。     

人呼吸道合胞病毒兰州株全基因组序列测定及分析

目的为了解人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytium virus,HRSV)兰州株(HRSV LZ01/09)的遗传特征及分子进化规律,进一步丰富RSV基因组数据库,对HRSV LZ01/09的全基因组序列进行测定及分析。方法通过RT-PCR法对HRSV LZ01/09全基因组片段进行扩增及序列测定,利用分子生物学软件对测序结果进行拼接,并与GenBank登录的RSV实验参比株和各基因型代表株进行分子进化分析。结果 HRSV LZ01/09全基因组全长为15 204 bp,基因组的结构为NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-1-M2-2-L,与报道的RSV实验参比株相同;全基因组序列比对分析表明,HRSV LZ01/09兰州株基因组序列与RSV RSS2株的同源性最高,为96. 7%,与其他RSV-A亚型毒株同源性次之,为94. 9%～95. 2%,与RSV-B亚型9320株同源性最低,为80. 9%;依据RSV-G基因的第2个可变区进行系统进化树分析,HRSV LZ01/09兰州株基因组与NA1病毒分离株属于同一个分支。结论 HRSV LZ01/09兰州株病毒基因组具有RSV的遗传特征,属于RSV-A亚型,基因型属于NA1型。     

传染性法氏囊病病毒疫苗B87株基因组B节段的克隆和序列分析

目的获得传染性法氏囊病病毒(IBDV)疫苗B87株B节段全长cDNA,并对其序列进行分析,为进一步在分子水平上研究病毒基因组的功能、抗原变异和毒力变异奠定基础。方法使用蛋白酶K和酚/氯仿抽提法提取病毒基因组RNA,用LiCl分级沉淀方法纯化病毒基因组dsRNA,通过RT-PCR一步扩增获得B节段的全长cDNA。将其克隆到pGEM-T载体上,然后测序,并用DNAStar软件进行序列分析。结果测序结果表明,克隆的B87株基因组B节段全长为2827bp,与超强毒参考株UK661和HK46的同源性分别为89.8%和89.3%,与强毒参考株Harbin-1和ZJ2000的同源性分别为90.2%和89.5%;与变异毒株GLS的同源性为97.8%;与弱毒参考株CEF94和Gt株的同源性均为99.8%,与P2株的同源性达100%。结论通过对9株IBDV编码氨基酸序列进行分析、比较,推测B节段上10个独特的氨基酸位点可能与毒力相关。     

水泡性口炎病毒核蛋白基因的克隆和序列分析

目的　对水泡性口炎病毒编码群特异性抗原的N基因进行PCR扩增、克隆和序列分析。方法　将水泡性口炎病毒编码群特异性抗原的N基因片段克隆至pMD18 T载体中 ,构建N基因重组质粒载体。进行PCR及限制性内切酶分析 ,筛选获得N基因插入的阳性克隆。经核苷酸序列分析 ,并与Genbank中的VSV编码核衣壳蛋白N基因序列进行比较。结果　该序列与VSVNewJersey型的 0 9/ 82 HD B株同源性最高 ,核苷酸和推测氨基酸的同源性分别为 98.9%和 98.8% ,有 13个核苷酸差异 ,伴有 5个氨基酸改变 ,第 72位的酪氨酸变为组氨酸 ,第 89位的缬氨酸变为异亮氨酸 ,第 183位的天冬氨酸变为天冬酰胺 ,第 2 0 5位的苯丙氨酸变为亮氨酸 ,第 4 18位的丙氨酸变为缬氨酸 ;与In diana型各株的同源性较低 ,与Glasgow株相比 ,核苷酸和氨基酸的同源性分别为 6 7.9%和 71.6 %。结论　已成功地克隆了水泡性口炎病毒N基因 ,为水泡性口炎免疫血清学诊断试剂的制备和分子生物学研究打下了坚实基础     

基于口蹄疫病毒2A片段的多基因共表达质粒的构建及表达

目的构建基于口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)2A片段的多基因共表达质粒,并在293T细胞中共表达HBx、人Sox2及人c-Myc基因。方法以FMDV 2A自剪切片段连接HBx、Sox2和c-Myc基因编码序列,克隆至载体pEGFP-C1,构建多基因共表达质粒pEGFP-XSM;在脂质体LipofectamineTM2000的介导下,将重组质粒pEGFP-XSM转染293T细胞,同时设空载体组(转染空载体pEGFP-C1)和空白对照组(未转染),转染48 h后,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达;Real-time PCR和Western blot法分别检测各组293T细胞中HBx、Sox2和c-Myc基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平。结果多基因共表达质粒pEGFP-XSM经酶切和测序鉴定构建正确;空载体组和pEGFP-XSM转染组细胞荧光镜下均可见GFP的表达;pEGFP-XSM转染组中HBx、Sox2和c-Myc基因mRNA的转录水平较空白对照组及空载体组均明显升高(P﹤0.001);pEGFP-XSM转染组可见相对分子质量约48 000的GFP-HBx-2A融合蛋白条带和约38 000的HA-Sox2-2A融合蛋白条带,各组均可见相对分子质量约49 000的c-Myc蛋白条带,pEGFP-XSM转染组c-Myc蛋白的表达水平明显高于空白对照组及空载体组(P﹤0.01)。结论成功构建了多基因共表达质粒pEGFP-XSM,并在293T细胞中实现了HBx、Sox2和c-Myc蛋白的共表达,为进一步深入研究该共表达蛋白在肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发生发展中的生物学机制奠定了基础。     

乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS3基因的克隆及原核表达

目的克隆并表达乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS3编码区的基因片段,为重组蛋白进一步的功能研究奠定基础。方法提取乙脑病毒SA14-14-2株总RNA,用RT-PCR法扩增NS3-1、NS3-2基因片段,克隆入原核表达载体pET15bTAT中,构建重组原核表达质粒,转化大肠杆菌Rosetta2,IPTG诱导表达。表达产物经Ni2+亲和层析柱纯化后,进行Western blot鉴定。结果重组原核表达质粒pET15bTAT-NS3-1和pET15bTAT-NS3-2经酶切证明构建正确。表达的重组蛋白相对分子质量约为27000和20000,主要以包涵体的形式表达。重组蛋白纯化后纯度可达80%以上,并可被小鼠抗乙型脑炎病毒SA14-14-2株血清识别。结论已成功克隆了乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS3-1和NS3-2基因,并在大肠杆菌Rosetta2中获得表达。     

新城疫病毒TL1株L基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的对新城疫病毒TL1株L基因进行克隆、序列分析及真核表达载体构建。方法根据GenBank登录的新城疫病毒L基因序列,设计了一对引物,用RT-PCR对内蒙古分离株TL1的L基因进行整体扩增。将扩增产物提纯后,克隆入pGEM-Teasy载体,再亚克隆至真核表达载体pCI-neo上,通过酶切、PCR鉴定及测序进行验证。结果测序拼接得出L基因的全序列长度为6704bp,该基因的ORF总长为6615bp,编码2204个氨基酸。与GenBank登陆的12株参考毒株比较L基因编码区全核苷酸序列和氨基酸序列,发现TL1株与鹅源新城疫NA-1株、ZJ1株和SF02株的同源性极高,说明四者亲缘关系较近。结论已成功构建L基因真核表达载体,为对该株病毒进行反向遗传操作以及有关功能基因组研究奠定了基础。     

丙型肝炎病毒非结构区NS5基因片段的克隆和表达

从抗 HCV和HCVRNA均为阳性的病人血清中 ,采用RT PCR技术扩增得到HCVNS5基因片段。用含此基因片段的重组质粒pET 2 8a转化大肠杆菌BL2 1(DE3)后可高效表达NS5蛋白。该蛋白可用固定化金属离子螯合层析法 (IMAC)纯化。经Westernblot和ELISA检测结果表明 ,纯化的NS5蛋白可与丙型肝炎患者血清发生特异反应 ,在HCV感染的诊断中可能具有良好的应用前景。     

C型口蹄疫病毒VP1基因的串联与原核表达

目的构建C型口蹄疫病毒VP1基因原核表达系统,并鉴定其表达产物的免疫反应性。方法首先合成C型口蹄疫病毒C-S8C1株VP1基因的3个抗原表位,并克隆到pMD18-T载体上,再按设计的酶切位点酶切后连接,构建出C型VP1双拷贝基因片段(VP1C)。将VP1C基因连接到原核表达载体pET-CKS上,构建重组质粒pETCKS-VP1C,转入BL21菌中进行原核表达。采用SDS-PAGE和Western blot检测其表达产物,并利用包涵体洗涤法对表达产物进行初步纯化。结果VP1C基因在大肠杆菌中获得表达,产量占沉淀蛋白的45%,且表达产物可以被C型口蹄疫病毒标准血清所识别。VP1C重组蛋白纯度达84.1%。结论已成功构建了C型口蹄疫病毒VP1基因原核表达系统,所表达的VP1C有良好的免疫反应性,可以作为检测C型口蹄疫病毒的候选基因。     

Phage Display Screening of Bovine Antibodies to Foot-and-Mouth Disease Virus and Their Application in a Competitive ELISA for Serodiagnosis

For serodiagnosis of foot-and-mouth disease virus (FMDV), monoclonal antibody (MAb)-based competitive ELISA (cELISA) is commonly used since it allows simple and reproducible detection of antibody response to FMDV. However, the use of mouse-origin MAb as a detection reagent is questionable, as antibody responses to FMDV in mice may differ in epitope structure and preference from those in natural hosts such as cattle and pigs. To take advantage of natural host-derived antibodies, a phage-displayed scFv library was constructed from FMDV-immune cattle and subjected to two separate pannings against inactivated FMDV type O and A. Subsequent ELISA screening revealed high-affinity scFv antibodies specific to a serotype (O or A) as well as those with pan-serotype specificity. When BvO17, an scFv antibody specific to FMDV type O, was tested as a detection reagent in cELISA, it successfully detected FMDV type O antibodies for both serum samples from vaccinated cattle and virus-challenged pigs with even higher sensitivity than a mouse MAb-based commercial FMDV type O antibody detection kit. These results demonstrate the feasibility of using natural host-derived antibodies such as bovine scFv instead of mouse MAb in cELISA for serological detection of antibody response to FMDV in the susceptible animals.     

共表达口蹄疫病毒O型P1-2A-IL-18基因和Asia I型P1-2A-3C基因重组鸡痘病毒的构建

目的构建共表达口蹄疫病毒(FWDV)O型P1-2A-IL-18基因和AsiaI型P1-2A-3C基因的重组鸡痘病毒。方法将酶切得到的FWDVO型P1-2A-IL-18基因和AsiaI型P1-2A-3C基因克隆至鸡痘病毒表达载体pUTAL上,构建重组鸡痘病毒转移质粒pUTAL-P1-2A-3C-P1-2A-IL-18,与鸡痘病毒(FPV)282E4株共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过BrdU3次加压筛选,挑选出单克隆重组病毒株,进行RT-PCR及间接免疫荧光(IFA)鉴定。结果重组鸡痘病毒转移质粒pUTAL-P1-2A-3C-P1-2A-IL-18经双酶切鉴定证明构建正确。经RT-PCR和IFA鉴定,证明所筛选的重组鸡痘病毒在CEF中能正确表达P1-2A-3C-P1-2A-IL-18基因盒。结论已成功构建了共表达FMDVO型P1-2A-IL-18基因和AsiaI型P1-2A-3C基因的重组鸡痘病毒。     

百日咳丝状血凝素分子中强免疫原性片段的筛选、克隆与表达

目的筛选百日咳丝状血凝素分子中强免疫原性的片段,并对其进行克隆及表达。方法采用生物信息学软件对丝状血凝素分子的结构进行预测,从中筛选出具有强免疫原性的片段FHAs。经PCR扩增,T-A克隆后,构建表达质粒pET-22b(+)-FHAs,酶切鉴定正确后测序。将测序正确的质粒转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白的表达,并对表达产物进行Tricine-SDS-PAGE分析及Western blot鉴定。结果从丝状血凝素分子中筛选出具有138个氨基酸的肽段FHAs,经PCR扩增,得到约400bp的目的基因片段,构建的重组质粒经双酶切和测序鉴定,证明质粒构建正确,重组工程菌pET-22b(+)-FHAs/BL21经IPTG诱导,目的蛋白的表达量在50%以上,主要以包涵体形式存在。Western blot分析证实该蛋白能与抗FHA单抗发生反应。结论筛选出的肽段FHAs具有强的免疫原性和免疫反应特异性,为百日咳基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

生产用流感病毒H3N2型疫苗株血凝素蛋白HA1的基因分析

目的分析生产用流感病毒H3N2型疫苗株血凝素蛋白HA1基因变异对病毒特性的影响。方法比较2005～2008年间上海生物制品研究所流感病毒H3N2型各疫苗株的生产数据,并对H3N2型各疫苗株的HA1基因序列数据进行分析。结果各疫苗株中,A/NewYork/55/2004(NYMCX-157)的血凝素得率最高,A/Brisbane/10/2007(IVR-147)最低;2006～2007年度疫苗候选株A/Wisconsin/67/2005(NYMCX-161B)的病毒复制能力优于A/Hiroshima/52/2005(IVR-142);各疫苗株的氨基酸差异均未直接涉及到HA1蛋白二硫键组成位点,直接涉及到HA1蛋白抗原决定簇位点、HA1蛋白糖基化位点和HA蛋白受体结合位点的变异分别有3处(140、156和193位)、1处(165位)和1处(225位)。结论2005～2008年间各流感病毒疫苗株血凝素得率因株而异,HA1蛋白抗原决定簇位点变异属于正常的不同毒株间的差异;糖基化位点、二硫键组成位点和受体结合位点基本保守;还需进一步研究部分位点氨基酸变异是否与病毒复制能力密切相关,并探讨改善复制能力的可能性。     

新城疫病毒F基因与传染性法氏囊病毒VP0基因在鸡痘病毒中共表达

目的 新城疫病毒（NDV）F基因和传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP0基因在鸡痘病毒中表达,以便研制新城疫和传染性法氏囊多价重组疫苗。方法 利用鸡痘病毒282E4株非必需区TK基因构建的表达载体PU-TA2,在已存在的复合启动子p7.5ATI下游同向插入F基因,反向插入复合启动子P7.5ATI,并在其下游反向插入VP0基因,构建由2个相同的复合启动子在相反方向分别表达F和VP0蛋白的PATI2-F-VP0表达载体。使其与鸡痘病毒282E4株共转染CEF细胞后,用BUDR法筛选重组病毒,通过间接免疫荧光法检测阳性重组病毒。用Western blot法检测F和VP0蛋白。结果 在重组病毒株中,用Western blot法可检测到F和VP0蛋白。结论 已成功地获得可同时表达F蛋白和VP0蛋白的重组鸡痘病毒。