SARS病毒刺突蛋白片段在大肠杆菌中的表达和纯化

目的获得SARS病毒表面刺突蛋白片段。方法用PCR方法克隆SARSS2片段基因,并在大肠杆菌中进行表达。表达产物经SDSPAGE及Westernblot鉴定,阴离子交换层析纯化。结果SARS病毒S2片段基因在大肠杆菌中获得了高表达,表达量占总蛋白的50%以上;得到纯度大于90%的SARS蛋白样品。结论获得了能够应用于SARS疫苗研究的SARS蛋白样品。     

抗SARS冠状病毒单克隆抗体的制备和鉴定

目的建立能稳定分泌抗SARS-CoV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。方法用SARS-CoV灭活全病毒液免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术建立6株稳定分泌抗SARS-CoV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并进行全面鉴定。结果免疫双扩散证实1C6细胞株分泌的单抗为IgG2a亚类,其余5株细胞分泌的单抗为IgG1亚类;腹水效价均达到10-6以上;6株细胞分泌的单抗均不与麻疹病毒等其它5种呼吸道病毒发生交叉反应;Westernblot证实6株细胞分泌的单抗均识别相对分子质量约150000的S蛋白及其相对分子质量为120000的裂解片段;相加指数证实6株细胞分泌的单抗识别相关的抗原表位;用硫氰酸铵洗脱法比较了6株细胞分泌的单抗的相对亲和力大小,依次为1A4>4F6>1C6>1B10>2H2>1F3;中和试验证实单抗4F6和1F3具有中和活性,中和效价均为1∶10;杂交瘤细胞株连续培养3个月以上及冻存半年后复苏,细胞生长良好,效价稳定。结论已获得抗SARS冠状病毒的单克隆抗体,为SARS的早期诊断及进一步研究奠定了基础。     

抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheities virus,IBRV)gD蛋白单克隆抗体,并鉴定其生物学特性。方法采用超速离心纯化的IBRV全病毒免疫BALB/c小鼠,取免疫后血清抗体呈阳性的小鼠脾细胞,通过融合剂PEG与骨髓瘤细胞SP2/0融合,采用间接免疫荧光法(IFA)筛选杂交瘤细胞,并制备腹水,分析单抗的生物学特性。结果筛选出1株稳定分泌抗IBRV gD蛋白单抗的杂交瘤细胞,命名为3C1。单抗的重链为IgG1亚类,轻链为kappa链;上清和腹水效价分别为1∶40和1∶12 800;单抗可与IBRV及gD重组蛋白分别在相对分子质量71 000和96 000处发生特异性反应,可与感染IBRV的MDBK细胞发生特异性结合,产生荧光。结论成功制备了抗IBRV gD蛋白的单克隆抗体,为深入研究gD蛋白功能及IBR的临床诊断方法筛选等提供了数据材料。     

抗猪呼吸与生殖综合征病毒Nsp9蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备抗猪呼吸与生殖综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Nsp9蛋白单克隆抗体,并进行初步鉴定。方法用纯化的重组Nsp9蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV Nsp9蛋白单克隆抗体,采用Western blot和间接免疫荧光试验分析单抗的特异性;使用免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒鉴定单抗的亚类;将杂交瘤细胞分别保存1、2、3、4个月后复苏,采用间接ELISA法检测细胞分泌抗体的能力。结果共获得3株可稳定分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为2D6、3C11和4E6,其细胞培养上清的ELISA效价分别为1∶6 400、1∶3 200和1∶1 600,腹水的ELISA效价分别为1∶640 000、1∶512 000和1∶256 000。3株单抗均可与Nsp9蛋白和PRRSV特异性结合;2D6和3C11株单抗的Ig亚型为IgG1,4E6株单抗为IgM亚类抗体;3株杂交瘤细胞保存4个月均能稳定分泌单抗。结论已制备抗PRRSVNsp9蛋白单克隆抗体,其特异性高,稳定性良好,为建立鉴别自然感染与注射疫苗感染PRRSV的诊断方法提供了材料。     

牛传染性鼻气管炎病毒gE蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheities virus,IBRV)g E蛋白的单克隆抗体,并进行鉴定。方法将扩增的IBRV gE基因插入至载体p ET-32a(+),转化感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白IBRV gE,通过Ni-NTA Agarous Kit纯化后,免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠脾细胞,与SP2/0细胞融合,间接免疫荧光法筛选阳性杂交瘤细胞。经小鼠腹腔注射杂交瘤细胞,3×10~6个/只,待小鼠腹腔膨大后,采集腹水,硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体,并进行亚类、浓度、染色体数目、Western blot及间接免疫荧光检测。结果重组蛋白IBRV gE相对分子质量约35 000,纯化后浓度为1.2 mg/mL。小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后,筛选出1株稳定分泌IBRV单抗的杂交瘤细胞(命名为3G9),获得相应抗体浓度为1.46 mg/m L;为IgG1亚类,轻链为kappa链;染色体数目为95~105;可与IBRV发生特异性反应;可与接种IBRV毒株的MDBK细胞发生特异性结合,产生特异性荧光。结论采用原核表达系统表达并纯化了IBRV gE蛋白,成功制备了抗IBRV gE的单克隆抗体,为建立特异性的IBRV诊断方法及致病机理的研究奠定了基础。     

牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)gD蛋白单克隆抗体,并进行鉴定。方法将扩增的IBRV gD基因插入原核表达载体p ET-28a(+),构建重组质粒gD-pET-28a,转化至感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白gD,通过Ni-NTA Agarous Kit纯化后,免疫BALB/c小鼠。取小鼠脾细胞,与SP2/0细胞融合,筛选阳性杂交瘤细胞,经小鼠腹腔注射,待小鼠腹腔膨胀时抽取腹水,用Hi Trap Protein G HP试剂盒纯化单抗,进行Western blot及间接免疫荧光检测。结果重组蛋白gD相对分子质量为48 000,纯化后浓度为4.19 mg/ml。小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后筛选出1株阳性杂交瘤细胞株,获得相应单克隆抗体的蛋白含量为1.81 mg/ml,且可与IBRV发生特异性反应,可与接种IBRV的MDBK细胞发生反应,产生特异性荧光。结论本研究利用原核表达系统表达纯化了IBRV gD蛋白,成功制备了IBRV gD单克隆抗体,为下一步表位鉴定及致病机理的研究奠定了基础。     

鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)S1蛋白单克隆抗体,并进行鉴定。方法用差速离心纯化的IBV四川分离株Sczy3免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。利用IBV鼠高免血清建立间接ELISA,筛选杂交瘤细胞。强阳性孔经有限稀释法亚克隆,获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并制备腹水。用鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定单抗的亚型,Western blot法分析单抗的反应原性,ELISA法分析单抗的特异性及其与不同IBV毒株的交叉反应性。结果经连续4次亚克隆,获得2株能稳定传代并分泌抗IBV Sczy3株单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C8C1和2C10E7,其腹水效价分别为1∶12 800和1∶25 600。2株杂交瘤细胞分泌的单抗均为IgM亚型;均可特异性识别S1蛋白;2株单抗只与IBV发生特异性反应,与新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)H9亚型和AIV H5抗原均不反应,与其他5种基因型的10株IBV毒株均可产生交叉反应。结论成功制备了2株IBV S1蛋白单克隆抗体,为IBV的检测、抗原表位筛选及致病机理的研究等提供了材料。     

利用单个B细胞制备人源SARS-CoV-2刺突蛋白单克隆抗体

目的 利用单个B细胞制备人源严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)刺突蛋白(S蛋白)单克隆抗体,并检测其中和活性。方法 采集经2次SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)免疫,且抗体水平较高的人静脉血,用人外周血淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),经偶联S蛋白的磁珠分选表达S蛋白抗体的单个B细胞。将单个B细胞反转录后,用套式PCR法扩增IgG重链、轻链可变区基因;通过重叠PCR法将可变区基因与CMV启动子及IgG leader序列DNA片段、IgG恒定区及PolyA序列DNA片段连接,构建抗体线性表达盒。将同一B细胞的重链、轻链线性表达盒转染HEK293T细胞,表达人源SARS-CoV-2 S蛋白单克隆抗体。免疫荧光法检测抗体免疫反应活性,假病毒中和试验检测抗体中和活性。结果 共表达了26株SARS-CoV-2 S蛋白单克隆抗体,经Western blot检测,于相对分子质量约55 000和25 ...     

鸡传染性支气管炎病毒M蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)M蛋白单克隆抗体,并进行鉴定。方法利用IBV Sczy3株免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA法筛选杂交瘤细胞,强阳性孔经有限稀释法亚克隆,制备抗IBV M蛋白单克隆抗体。对制备的单抗进行单抗亚型、腹水ELISA效价、特异性、交叉反应性鉴定及Western blot分析。结果获得2株能稳定分泌抗IBV M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为2C10和7H6,单抗亚型分别为IgM和IgG1;腹水ELISA效价分别为1∶25 600和1∶12 800;2株单抗均只与IBV发生特异性反应,而与新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)H9亚型、AIV H5抗原和鸡传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)均不反应;2株单抗与5种基因型的其他10株IBV均有良好的反应性。结论制备出2株针对IBV M蛋白的单抗,为今后更深入地研究该蛋白的分子生物学功能、抗原表位的鉴定及抗原捕获ELISA方法的建立等提供了有力的工具。     

具有中和活性抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的制备及鉴定

目的　制备具有中和活性抗呼吸道合胞病毒的单克隆抗体。方法　采用杂交瘤技术制备单克隆抗体 ,并以ELISA结合免疫组化技术进行筛选。结果　获得 8株分泌抗呼吸道合胞病毒的特异性单克隆抗体的细胞株 ,其中 2株分泌的单抗具有中和活性 ,效价 1∶16 0和 1∶32 0。结论　成功制备出具有中和活性的呼吸道合胞病毒的单抗     

GⅡ.4型人诺如病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗GⅡ.4型人诺如病毒(human norovirus,HuNoV)衣壳蛋白VP1单克隆抗体,并鉴定其生物学特性。方法 PCR扩增GⅡ.4型HuNoV VP1基因序列,将其插入至原核表达载体pGEX-5X-1中,构建重组质粒p GEX-5X-1-VP1,转化至E.coli BL21,经IPTG诱导表达,并通过亲和层析纯化获得重组蛋白GST-VP1。利用杂交瘤技术将小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与经GST-VP1抗原免疫的BALB/c小鼠的脾细胞进行融合,通过间接ELISA法筛选出阳性杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体,并进行纯化。采用间接ELISA法、Biacore法和Western blot法分别检测单克隆抗体的效价、亲和力及特异性。结果经菌落PCR及测序鉴定,重组质粒pGEX-5X-1-VP1构建正确。重组蛋白GST-VP1相对分子质量约85 000,大部分以可溶形式存在,纯化后浓度为1.100 mg/mL。筛选获得3株能分泌GⅡ.4型HuNoV VP1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为NoV C1、NoV D9和NoV H6,效价均可达1∶10⁷以上,亲和力常数K...     

抗人GPA~N单克隆抗体的制备及鉴定

目的　制备抗GPA单克隆抗体以建立“GPA体细胞突变分析法”。方法　用O ,N型人红细胞 ,以及纯化人GPAN 免疫BALB/c小鼠 ,经杂交瘤技术制备 ,用细胞凝集、间接免疫荧光筛选 ,用ELISA、Westernblot、酶处理红细胞的间接免疫荧光标记鉴定。结果　获得抗GPAN 单克隆抗体 6A8杂交瘤细胞系。其单抗属lgG3亚类 ,λ型轻链 ,识别和结合GPAN 氨基端 1～ 8位决定位点 ,对糖链依赖。流式细胞分选结果显示 6A8特异结合二甲亚胺固定的人MN和N型红细胞。结论　对分析由于基因突变和糖基化变异所致N ,MN红细胞GPAN 突变有理论研究和应用价值。     

抗细粒棘球绦虫EdiagA864单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗细粒棘球绦虫Ediag A864单克隆抗体,并进行鉴定。方法以细粒棘球绦虫Ediag A864蛋白为抗原,经皮下多点免疫BALB/c小鼠,共免疫4次。末次免疫3 d后制备小鼠脾细胞,在聚乙二醇(PEG)的作用下与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,间接ELISA法筛选出阳性杂交瘤细胞株进行克隆,检测其染色体数及分泌的单克隆抗体亚型。采用体内培养法大量制备抗细粒棘球绦虫Ediag A864单克隆抗体,并经正辛酸-饱和硫酸铵法和Hi Trap Protein G HP亲和层析结合法纯化。结果经筛选克隆共获得4株可产生细粒棘球绦虫Ediag A864单克隆抗体的杂交瘤细胞株:2D12、3H4、4A6和6E5,细胞染色体数分别为97、101、98和96,重链亚型均为Ig G1,轻链亚型均为Kappa。2D12、3H4腹水效价为2×105,4A6和6E5腹水效价为1×105。纯化后的2D12抗体可见相对分子质量为46 000和26 000的重链和轻链条带。结论本实验获得的2D12是一株稳定的杂交瘤细胞株,且可产生高效价细粒棘球绦虫Ediag A864单克隆抗体,为细粒棘球绦虫病的免疫诊断奠定了基础。     

抗β-淀粉样蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及初步鉴定

目的建立抗β-淀粉样蛋白(Aβ)单克隆抗体杂交瘤细胞系,并鉴定Aβ单抗的免疫学特性,以便用于阿尔茨海默病(AD)的防治研究。方法用戊二醛法将半抗原Aβ1-42偶联于载体蛋白BSA,形成结合抗原BSA-Aβ。用常规腹腔注射法和微量足垫注射法分别免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术建立分泌Aβ单抗的细胞株,体内诱生腹水法制备Aβ单抗。硫酸铵盐析法提纯,常规免疫学法检测鉴定Aβ单抗的免疫学特性。结果筛选出A-B7、A-D11、A-E93株高特异性杂交瘤细胞株,亚型均为IgM型,单抗的ELISA间接效价分别为2×10-5、2×10-5和1×10-5。杂交瘤细胞染色体数目在80~90之间,纯化后单抗腹水蛋白回收率在20%左右。结论已成功建立了分泌抗Aβ单抗的细胞系,并制备出半抗原Aβ的单抗,可用于AD的进一步研究。     

抗肠道病毒71型单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备肠道病毒71型(EV71)单克隆抗体,并进行初步鉴定。方法将RD细胞和Vero细胞培养的EV71原液通过氯化铯超速离心纯化,分别作为免疫抗原和检测抗原,制备单克隆抗体。通过Westernblot分析、间接免疫荧光试验和ELISA法鉴定单抗的特异性。采用间接ELISA法测定单抗的酶标效价,微量细胞培养中和试验测定单抗的中和效价。结果获得1株可稳定分泌抗EV71单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌的单抗可与EV71特异性结合,酶标效价为1∶204800,中和效价为1∶28。结论已成功筛选出1株分泌抗EV71的单抗细胞株,为建立EV71疫苗抗原含量测定方法奠定了基础。     

肾综合征出血热病毒84-Fli株单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndromes,HFRS)病毒特异性单克隆抗体。方法以汉坦病毒84-Fli株抗原纯化液免疫BALB/c小鼠,采用细胞融合技术获得单克隆抗体,利用IFA、SDS-PAGE和Western blot法鉴定其生物学特性。结果成功筛选出阳性杂交瘤细胞株4F6,能稳定且持续分泌抗HFRS病毒的单克隆抗体,亚类鉴定结果为IgM,可与HFRS病毒蛋白在相对分子质量约50 000处发生特异性反应,具有较好的专属性。结论成功制备了1株抗HFRS病毒的单克隆抗体,为进一步研究该病毒感染的诊断、治疗及其预防方法奠定了基础。     

分泌抗-HBe和抗-HBc单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立和鉴定

应用具有 HBeAg 和 HBcAg 双抗原活性的基因工程菌表达产物的粗提物免疫 BALB/c小鼠后,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系 SP~2/0融合,分别筛选出4株抗 HBe 单克隆抗体杂交瘤细胞株(WHBe_1,WHBe_2,WHBe_3,WHBe_4)和4株抗 HBc 单克隆抗体杂交瘤细胞株( WH-Bc_1,WHBc_2,WHBC_3,WHBc_4)。经3个月连续培养,能稳定分泌效价高、特异性强的单克隆抗体。     

抗SARS-CoV-2刺突糖蛋白受体结合域单链抗体的筛选及鉴定

目的 构建抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-Co V-2)刺突糖蛋白(spike protein,S)受体结合域(receptor-binding domain,RBD)的单链抗体(single-chain fragment variable,scFv)噬菌体展示文库,筛选特异性scFv,并进行功能鉴定。方法 提取RBD蛋白免疫小鼠的脾细胞m RNA,逆转录为c DNA,以其为模板扩增scFv的重链可变区(hight chain fragment of variable,VH)和轻链可变区(light chain fragment of variable,VL)基因,经过重叠延伸PCR扩增(splicing overlap extension PCR,SOE-PCR)组装为scFv基因片段。将scFv基因片段插入噬菌体载体,构建scFv噬菌体展示文库。经4轮生物淘洗,筛选出与RBD结合能力较强的scFv基因,进行重组表达、纯化和生物活性鉴定。结果 构建的scFv噬菌体文库滴度为6.0...     

SARS病毒核衣壳蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

目的在大肠杆菌中高效表达SARS核衣壳蛋白。方法将已合成的SARS-CoV N蛋白基因片段,克隆至pUC-18载体,与pET28质粒连接,转化大肠杆菌,进行SARS-CoV核衣壳融合蛋白表达。用SARS患者恢复期血清进行表达产物鉴定。用色谱方法进行表达产物的层析纯化。结果SARS病毒N基因在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量占总蛋白的30%以上;经三步纯化后纯度达90%以上。结论已获得了SARS核衣壳蛋白样品。     

单纯疱疹病毒单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备单纯疱疹病毒的单克隆抗体。方法 用纯化的单纯疱疹病毒（HSV）抗原免疫雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合。经ELISA间接法筛选和克隆化培养,获得两株分泌抗单纯疱疹病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞,纯化其腹水获得单抗,检测该单抗的特异性。结果 这两种单抗与其他相关的病毒抗原无交叉反应,Western blot表明单抗均识别单纯疱疹病毒中相对分子质量50000的蛋白。结论 该单抗为单纯疱疹病毒的单克隆抗体。