秸秆碱预处理液脱毒及其在丁醇发酵中的应用

秸秆的碱预处理液可造成严重的环境污染。该研究基于源头控制的理念,对碱预处理液进行脱毒工艺研究并回收进行丁醇发酵研究。通过加酸去除碱预处理液中的木质素,用活性炭将去除木质素的预处理液脱毒并用于水解和发酵过程。优化获得沉淀碱溶性木质素的最佳pH 3. 8;不同加量活性炭脱毒后的碱预处理液对秸秆水解的影响不明显,然而活性炭的添加量对丁醇发酵影响较大,当活性炭添加量为15 g/L时,发酵72 h达到最高丁醇质量浓度10. 2 g/L。该秸秆碱预处理液脱毒工艺对利用秸秆进行无废生产生物燃料有一定参考价值。     

高浓玉米秸秆碱法预处理及半同步糖化发酵生产乙醇的工艺研究

为实现玉米秸秆高效转化可发酵糖,提升玉米秸秆生产纤维素乙醇竞争力,对碱过氧化氢法预处理后高浓玉米秸秆半同步糖化发酵生产燃料乙醇的工艺进行了研究。建立底物浓度与酶解糖得率关系模型,以确定适宜的底物浓度。向预处理后的玉米秸秆中添加吐温20,考察其酶解过程特性,确定吐温20最适添加量。结果表明,酶解最适条件为:底物质量浓度200 g/L,吐温20添加量8%(ω)。在该条件基础上,对酵母种龄、吐温20对酵母发酵影响、半同步糖化发酵预酶解时间、半同步糖化发酵的时间、发酵温度进行了研究,确定了半同步糖化发酵的工艺条件为:种龄16 h,吐温20添加量5%(ω),预酶解时间9 h,半同步糖化发酵时间7 d,温度34℃。在最佳条件下,发酵7 d后,乙醇浓度达到23. 64 g/L,乙醇转化率达到76. 54%,较对照组(不添加吐温20)转化率提升3. 41%。该工艺条件下能实现高浓玉米秸秆高效转化可发酵糖及乙醇的目的。     

硬毛粗盖孔菌预处理对玉米秸秆酶水解及组分变化的影响

以硬毛粗盖孔菌（Funalia trogii）为研究对象,比较其在不同预处理时间的产酶特征、预处理前后玉米秸秆酶解产糖量及其组分变化。结果表明,硬毛粗盖孔菌对木质素的降解以漆酶和锰过氧化物酶的协同作用为主导,漆酶和锰过氧化物酶活最高分别为341 IU/g和33 IU/g。经生物预处理14 d后的玉米秸秆酶解产糖量可达到350.74 mg/g秸秆,较原料提升184%。玉米秸秆组分的变化与其酶解增效密切相关,F. trogii预处理14 d后木质素和半纤维素含量分别降低了33.99%和36.61%,而纤维素仅降解8.77%,木质素和半纤维素的选择性降解,可显著降低玉米秸秆酶解抗性屏障,提升其酶解糖化效率。硬毛粗盖孔菌预处理玉米秸秆可实现木质纤维素的高效转化,缩短预处理时间,降低处理成本。     

Coriolus versicolor菌丝球用于造纸废水脱色的探讨

对白腐真菌(Coriolus versicolor)产生漆酶进行了研究,探讨了培养因子对漆酶产量的影响,结果发现该菌产漆酶的最适初始PH值为4.5.提高微量元素浓度或添加藜芦醇都可使C.versicolor的产酶能力增加,添加Tween80会有一定的促进作用.采C.versicolor菌丝球进行重复分批产酶试验,结果表明菌丝球的稳定性很好,同一批菌丝球可连续利用10次,平均每批酶活力可保持在9.6IU/ml,产酶能力优于聚氨酯泡沫固定化菌丝.将粗酶液和少量ABTS用于造纸废水脱色试验,在酶活力为5IU/ml、色度浓度186倍条件下,经过24h反应,脱色率达到80%.     

多拷贝脂肪酶基因在黑曲霉中表达研究

前期通过分泌蛋白质谱分析和转录组测序,确定了一株高产漆酶的白腐菌为灵芝,其分泌漆酶的编码基因为lcc1。本研究PCR扩增lcc1基因的基因组序列（lcc1-D）和cDNA序列（lcc1-C）,分别构建表达载体（pSZH6R-lcc1-D、pSZH6R-lcc1-C）。通过农杆菌介导法转化黑曲霉TH-2,筛选出在糖化酶基因glaA位点发生同源重组的纯合黑曲霉转化子。摇瓶发酵后取发酵液上清进行Native-PAGE检测和酶活测定,结果表明,重组菌株lcc1-C的漆酶表达量和酶活力高于lcc1-D,酶活力最高值分别为431.94 U/L和218.06 U/L。Real-time PCR结果表明,lcc1-C中的漆酶mRNA水平是lcc1-D的3.38倍。对重组漆酶进行酶学性质分析,发现其最适反应温度为60 ℃、最适pH为3.5。在染料脱色实验中发现重组漆酶对孔雀石绿、中性红、甲基橙具有明显脱色作用,介体存在时能增强漆酶对染料的脱色效果,对中性红脱色效率最强,48 h脱色率可达到91.21%。为改善重组漆酶的折叠,向重组菌株lcc1-C的发酵培养基中添加渗透调节剂,结果显示,在添加0.4 mol/L TMAO时酶活力达到1301.67 U/L,提高了1.97倍;在添加0.5 mol/L脯氨酸时酶活力达到2037.22 U/L,提高了3.64倍;在添加0.5 mol/L甘氨酸时酶活力达到1434.03 U/L,酶活力提高了2.27倍。     

白腐菌Panus conchatus产漆酶的诱导、纯化及酶学特性研究

铜离子对贝壳状革耳菌(Panus conchatus)胞外漆酶有明显的诱导作用,其最适诱导浓度为3mmol/L。在培养基中添加铜离子,发酵14 d后漆酶活性提高11倍,达196 IU/mL。发酵液经硫酸铵盐析,离子交换色谱和凝胶过滤色谱等分离纯化后,漆酶的比活力为912IU/mg,纯化倍数为6.77,酶活得率为74%;SDS-PAGE和Native-PAGE显示出单条蛋白条带,其分子量约是65kDa;以ABTS为底物时Km为0.0057mmol/L;反应最适温度和pH分别为60℃和2.5;漆酶在4℃和pH 8.0时具有较高的稳定性;K+,Na+,Cu2+,Mg2+等金属离子和乙醇,乙腈对酶活影响较小;而SDS、半胱氨酸和NaN3等对酶活影响较大,几乎完全抑制漆酶活性。     

碱预处理秸秆同步糖化发酵生产丁二酸

研究了碱预处理秸秆及用琥珀酸放线杆菌Actinobacillus sucinogenes同步糖化发酵秸秆生产丁二酸。结果表明:用1.0%NaOH溶液于120℃分别预处理玉米、小麦和水稻3种秸秆2 h,其木质素的脱除率、纤维素与半纤维素的总保留率均在85%以上。以3种碱预处理后的秸秆为原料,在补加纤维素酶与纤维二糖酶的条件下,A.sucinogenes F3-21摇瓶厌氧发酵72 h,产丁二酸浓度分别为30.74 g/L、24.98 g/L和26.57 g/L;在7 L罐中厌氧发酵72 h,丁二酸浓度分别达到40.21 g/L,30.06 g/L和39.07 g/L,每克预处理秸秆产丁二酸分别为0.50g、0.38 g和0.49 g。并用钙盐法对玉米秸秆同步糖化发酵液进行提取,得到纯度为99.98%的丁二酸结晶。说明了玉米、小麦和水稻3种秸杆为原料进行同步糖化发酵生产丁二酸的可行性。     

里氏木霉与黑曲霉混合发酵产纤维素酶的条件优化

为提高纤维素酶酶解秸秆产糖效果,以碱性双氧水处理过的玉米秸秆为发酵基质,进行里氏木霉与黑曲霉混合发酵的研究。通过单因素试验确定黑曲霉延迟接种时间、里氏木霉与黑曲霉接种比例 、发酵时间和固液比4个因素的最优水平。在此基础上,采用Box-Behnken响应面设计对混合发酵产酶条件进行优化,获得最佳产酶条件：黑曲霉延迟接种时间 36h,里氏木霉与黑曲霉接种比例 5:1、发酵时间7d、固液比2:50(m/V)、吐温-80体积分数0.4%、pH 5.0和装液量50mL/250mL。此时,滤纸酶力(FPA)可达1.224 IU/mL,β-葡萄糖苷酶活力(β-GA)可达0.315 IU/mL。采用高效液相色谱法,对最佳条件下的纤维素酶酶解秸秆的水解液进行检测。结果表明,两菌株混合发酵较单菌株发酵的纤维素酶系更加完整,且降解木质纤维素类原料产可发酵性糖的能力增强。     

杂色云芝漆酶基因在甲醇毕赤酵母中表达条件研究

重组甲醇毕赤酵母（Pichia methanolica）工程菌PMADl6／pMETA-Lccl能分泌表达杂色云芝重组漆酶。本文通过对其发酵条件的研究，找出摇瓶发酵表达漆酶的最适培养条件：在BMMY培养基中添加0．2mmol／L的Cu^2＋．装液量为25mL／250mL三角瓶，接种量体积之比为45：25，0．5％甲醇诱导，20℃条件下摇瓶培养5d，漆酶最高酶活力达1192U／L。     

酶法降解甘蔗渣木质素的条件研究

研究木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶降解蔗渣中木质素的酶解作用条件,得到优化后的酶解木质素条件:酶解液最适pH值为4.0、温度为40℃、酶解时间48h,酶解液中木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、葡萄糖氧化酶活力分别为1.26、1.45、2U/mL,葡萄糖和乙酰丙酮浓度分别为0.01mol/L和0.05mol/L,此时木质素的降解率为18.46%,提高纤维素酶水解率28.67%。     

漆酶产生菌的原生质体诱变选育

利用紫外线对杂色云芝原生质体进行诱变,经原生质体再生培养和筛选再生菌株,获得一株高产漆酶突变株,突变株比出发菌株的漆酶酶活提高了54.32%.而且,突变株继代遗传稳定,说明利用原生质体紫外诱变育种是获得漆酶高产菌的一种有效方法.     

木质纤维素类生物质生物预处理菌种筛选

以生物质的转化率(TR)、糖化率(SR)为评价标准,在竹粉、稻草和玉米秸秆3种生物质上筛选了33株采自神农架自然保护区的白腐菌菌株,发现针对不同生物质,适用于生物预处理的菌株不同:竹粉基质为杂色云芝,稻草基质为侧耳属菌株,玉米秸秆基质为乳白耙菌。所筛出白腐菌预处理时间显著缩短,以相应菌株处理竹粉、稻草和玉米秸秆15d,其生物质TR分别提高25.8%、47.0%和136.3%,SR依次达到14.1%、39.4%和37.5%。3种生物质中木质素含量与其糖化率关系密切。     

云芝糖肽的液体发酵研究

通过液体培养和HPGFC测定,筛选获得有效成分和糖肽产量均较高的发酵生产菌株LS,然后优化其发酵培养基,并在30L发酵罐中进行放大实验。结果表明,在30L发酵罐中,发酵96h,菌体干重为24.29g/L,糖肽产量可达1.63g/L,经测定,提取所得的胞内糖肽其出峰时间与对照品基本一致,其蛋白质含量、总糖含量和单糖含量均符合国家药品标准WS-XG-021-2002要求,为云芝糖肽的工业化发酵生产奠定了基础。     

云芝菌固态发酵产漆酶及其对二氯酚脱氯作用的研究

利用云芝菌固态发酵产漆酶,当玉米皮和麸皮的比例为6:4,培养基含水量65%,接种量10%,培养温度30℃时,发酵10 d,漆酶活力可达到1.51×10~5U/g(干曲)。利用云芝漆酶对2,4-二氯酚进行脱氯反应,其适宜温度为35℃,pH 6.0,当底物浓度为1 mmol/L时,反应8 h,2,4-二氯酚的去除率达到95%以上。     

响应面法优化Coriolus versicolor ZZH-2产漆酶培养基

采用响应面法对Coriolus versicolor ZZH-2产漆酶培养基进行优化,首先用Plackett-Burman（PB）法筛选出3个影响较大的重要因素,分别为酵母膏、羧甲基纤维素钠和L-天冬氨酸。在此基础上,用最陡爬坡实验逼近最大响应区域,并利用中心组合实验以及响应面分析确定了主要影响因素的最佳条件,即酵母膏13.82g/L、羧甲基纤维素钠13.29g/L和L-天冬氨酸1.44g/L,在优化培养基后漆酶酶活达到9693U/mL,比优化前提高了1.7倍,其实验值与理论值基本相符。      

不同Cu离子浓度和pH值对云芝降解秸秆中木质素和纤维素的影响

云芝(Coriolus versicolor)对秸秆中木质素与纤维素的降解情况受不同Cu2+浓度和pH值条件的影响,设定不同条件可以提高木质素的降解率,降低纤维素的降解率,以更好地保存纤维素的完整性,实现秸秆中主要成分的分离。通过均匀设计法,设定不同的Cu2+浓度环境X1(0、1.0、2.0、4.0、6.0mmol/L)和不同pH值条件X2(2.2、2.8、3.4、4.0、4.6),测定相应条件下云芝的菌丝生长情况、木质素酶活力、纤维素酶活力以及秸秆中木质素和纤维素的降解率。结果表明：木质素的降解率与Cu2+浓度呈正相关,与pH值呈负相关;纤维素的降解率与pH值呈正相关,与Cu2+ 浓度呈负相关。通过试验所得方程预测得知,Cu2+浓度6mmol/L、pH2.2是优化的云芝降解、分离秸秆中主要成分的条件,在该条件下,由所得方程可知秸秆中木质素的降解率为16.1%,纤维素的降解率为27.7%。     

产云芝胞外多糖发酵工艺优化及抗氧化活性研究

试验对云芝发酵生产胞外多糖的培养基进行优化并对其抗氧化活性进行研究,通过单因素试验和中心组合设计并用Design-Expert 7.0软件对实验结果进行分析,确定培养最优条件为氮源5.870 g/L多价胨,碳源53.120 g/L麦芽糖,起始pH值为5,温度28℃,搅拌发酵转速150r/min,多糖得率为10.098 2 g/L;对发酵多糖进行提取分离和脱蛋白处理得到EPS,然后用邻二氮菲法和DPPH法测定了EPS的抗氧化活性,结果表明,EPS对·OH自由基和DPPH·自由基均具有较高的清除率,且具有较好的量效关系,说明云芝EPS具有较强的抗氧化活性.     

白腐菌发酵培养及诱导剂对漆酶合成的影响

研究了碳源、氮源及诱导剂添加方式对白腐菌P.conchatus液体培养产漆酶的影响。结果表明,当碳源为葡萄糖,氮源为酵母膏,C/N比为15∶1时,P.conchatus合成漆酶酶活达到8795U·L-1;在初始培养基中,添加1.5%麦麸与1mmol/LCu2+共同诱导漆酶合成,酶活可达到51004U·L-1;将Cu2+的添加时间改在发酵后第4d,添加量为3mmol/L,其他条件不变,漆酶酶活达到101968U·L-1,比在初始培养基中添加1mmol/LCu2+所达到的酶活高了近两倍。