卷烟烟气暴露下AA549和BEAS-22B细胞促炎性因子的释放变化

为比较不同类型细胞对卷烟烟气诱导的促炎症反应的应答差异,采用中性红细胞毒性试验测试了卷烟烟气总粒相物(TPM)和全烟气(WS)对人肺腺癌细胞A549和人支气管上皮细胞BEAS-2B的细胞毒性效应;采用酶联免疫法(ELISA)分析了TPM和WS暴露后,A549和BEAS-2B促炎性细胞因子白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-8(IL-8)的释放水平。结果表明:BEAS-2B细胞较A549细胞对卷烟烟气的细胞毒性效应敏感。卷烟烟气暴露下A549细胞没有增加促炎性细胞因子IL-6和IL-8的释放;而BEAS-2B细胞在TPM和WS暴露下其IL-6和IL-8的释放显著增加。卷烟烟气诱导的促炎症反应存在细胞类型的差异。     

杏鲍菇提取物对小鼠巨噬细胞免疫活性的研究

本文中以杏鲍菇子实体为原料,将杏鲍菇不同极性的提取物(PEs)对小鼠巨噬细胞Ana-1进行了免疫活性研究。将PEs作用于小鼠巨噬细胞Ana-1,通过MTT法测定其对Ana-1细胞增殖活性的影响,Elisa法测定Ana-1细胞肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)在不同提取物浓度和不同作用时间的分泌量变化情况,中性红法检测对细胞吞噬活性的影响,Elisa法测定Ana-1细胞表面膜蛋白Toll样受体(TLR2、TLR4)的表达量的变化情况。结果显示:杏鲍菇4种提取物(PEs)对小鼠巨噬细胞Ana-1有不同程度上的免疫刺激作用,甲醇提取物(PEM)表现出了最强的促进细胞增殖和促进细胞因子分泌的活性,在PEM质量浓度为12.5μg/m L的条件下,能够促进Ana-1细胞增殖作用最强,细胞因子TNF-α和IL-6均出现分泌高峰;但PEM对细胞因子分泌的作用时间不同,PEM作用于Ana-1细胞后,在12 h时出现TNF-α分泌高峰,而IL-6在24 h时出现分泌高峰。此外,PEM可以激活Ana-1,提高细胞吞噬活性,促进细胞表面膜蛋白受体TLR2、TLR4的表达。本研究结果表明了PEM能够通过促进巨噬细胞增殖、诱导细胞因子分泌和提高吞噬活性的方式实现免疫增强功能。     

卷烟烟气总粒相物诱导A549细胞的氧化应激研究

为研究卷烟烟气总粒相物(TPM)对人肺腺癌细胞(A549)的氧化损伤,捕集3R4F参比卷烟主流烟气的TPM,对A549细胞进行染毒,采用中性红细胞毒性法测试TPM与A549细胞存活率的剂量-效应关系,检测了细胞内谷胱甘肽(GSH)和细胞外超氧化物歧化酶(EC-SOD)两种氧化应激指标。结果表明:①TPM与A549细胞存活率之间存在良好的剂量-效应关系。②细胞发生氧化应激时,细胞内还原态谷胱甘肽和氧化态谷胱甘肽比值(GSH/GSSG)相对于阴性对照组有显著降低,且不随染毒时间的增加而变化;EC-SOD在染毒4 h后没有显著增加,但24 h后有显著增加。      

杏鲍菇菌丝体多肽的免疫活性及抗肿瘤作用

为研究杏鲍菇菌丝体多肽的免疫活性及抗肿瘤作用,以杏鲍菇菌丝体多肽为原料,通过对小鼠巨噬细胞Ana-1细胞存活率、细胞因子TNF-α和IL-6分泌量、膜表面蛋白TLR2和TLR4表达量、吞噬中性红活性以及刺激巨噬细胞产生NO和H_2O_2的能力测定来研究杏鲍菇菌丝体多肽的免疫活性;通过对人体乳腺癌细胞BT-549细胞、宫颈癌细胞Hela-229和胃癌细胞HGC-27细胞增殖的抑制来研究杏鲍菇菌丝体多肽的抗肿瘤作用。实验显示,多肽浓度在0.05~2 mg/mL范围时,在一定程度上能够促进巨噬细胞的增殖,提高膜表面蛋白TLR2、TLR4表达量,提高细胞因子TNF-α和IL-6分泌量,增强巨噬细胞吞噬中性红活性能力,并且促进巨噬细胞分泌NO和H_2O_2;对人体乳腺癌细胞、宫颈癌细胞和胃癌细胞这三种癌细胞具有较强的抑制作用,表明杏鲍菇菌丝体多肽具有较好的免疫活性和抗肿瘤活性,且活性与浓度呈现量效关系。     

花脸香蘑菌丝体多糖提取条件优化及其体外免疫活性

为探讨花脸香蘑菌丝体多糖提取工艺及其免疫活性,以花脸香蘑菌丝体为原料,在单因素试验的基础上采用正交试验优化多糖提取条件;将不同质量浓度的花脸香蘑菌丝体多糖溶液作用于小鼠巨噬细胞Ana-1,通过对其细胞存活率、细胞因子TNF-α和IL-6分泌量、中性红吞噬能力以及膜表面蛋白Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)TLR2和TLR4表达量能力的测定,研究花脸香蘑菌丝体多糖的免疫活性。结果表明,花脸香蘑菌丝体多糖最佳提取条件为浸提温度65℃、浸提时间2.5 h、液料比40∶1(m L/g),提取率最高为15.88%;在0.05~1.6 mg/m L的有效剂量范围内,花脸香蘑菌丝体多糖能够不同程度地促进小鼠巨噬细胞Ana-1的增殖,提高细胞因子TNF-α和IL-6分泌量,增强中性红吞噬能力、膜表面蛋白TLR2和TLR4表达量能力,其中以1.6 mg/m L效果最佳。表明花脸香蘑菌丝体多糖具有优良的免疫活性。     

不同抽吸模式下烟气冷凝物对人口腔细胞体外生长增殖的影响

为考察卷烟烟气暴露对人口腔细胞体外生长增殖的影响,以肯塔基参比卷烟3R4F 为试验卷烟,人口腔表皮样癌细胞为实验模型,分别在ISO 和加拿大深度抽吸(HCI)模式下制备烟气冷凝物并对细胞进行染毒暴露,评估了两种抽吸模式下烟气暴露对人口腔细胞代谢活性及核酸复制活性的影响,并结合主流烟气总粒相物(TPM)中主要有害成分的释放水平进行了分析。结果表明:①烟气冷凝物暴露对人口腔细胞体外增殖有抑制作用,对人口腔细胞代谢活性以及核酸的复制活性有一定的毒性作用。②HCI 抽吸模式下3R4F 卷烟单位TPM 和单位烟碱中有害成分的释放量低于ISO 模式,HCI 抽吸模式下制备的烟气冷凝物含水率高于ISO 模式,这两种因素是导致3R4F 卷烟HCI 模式下烟气冷凝物细胞毒性弱于ISO模式的主要原因。      

γ-亚麻酸对小鼠免疫系统的调节作用

目的：分析γ-亚麻酸3种不同作用途径对小鼠血清中24种细胞因子的影响,进而探索γ-亚麻酸对小鼠免疫系统的调节作用。方法：将γ-亚麻酸以口服灌胃、腹腔注射、耳静脉注射3种方式作用于小鼠,分别在3、2、2h后眼球取血,分离血清。采用液体芯片检测技术测定小鼠血清中24种细胞因子含量的变化。结果：口服灌胃组中,G-CSF、MCP-1、MIP-1α、VEGF、IL-1α、IL-3、IL-10、IL-13,8种细胞因子显著变化;腹腔注射组中有IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-5、IL-6、IL-10,6种细胞因子显著变化;耳静脉注射组中G-CSF、KC、IP-10、IL-1α、IL-4、IL-12(p40)、IL-17 7种细胞因子显著变化。根据每种作用途径显著变化的细胞因子的产生及作用靶细胞,分别构建γ-亚麻酸作用后机体细胞通讯网络的变化。结论：γ-亚麻酸能通过小鼠胃肠黏膜系统和血液系统传递信号,调节机体的免疫,其作用的信号途径涉及NF-κB、P38/JNK/MAPK、JAK-STAT等途径。γ-亚麻酸不仅具有必需脂肪酸的作用,而且具有显著的免疫调节作用,不仅具有刺激炎症作用,同时还可以发挥抗炎症作用。     

杏鲍菇副产物免疫活性物质追踪与结构鉴定

以杏鲍菇副产物为试验材料,采用不同极性部位分段萃取、硅胶柱层析2个步骤对甲醇提取物中的活性物质进行分离纯化,并对每步中得到的提取物进行免疫活性研究,观察其对小鼠巨噬细胞的免疫刺激作用,以此对其中的免疫活性物质进行筛选、活性追踪。利用液相串联四级杆飞行时间质谱对主要活性成分进行结构表征。结论显示:对杏鲍菇甲醇提取物进行系统溶剂法分段萃取,其中正丁醇部位表现出最强的促进细胞增殖活性、吞噬活性和细胞因子分泌活性。当正丁醇部位提取物质量浓度为25μg/m L时,促进Ana-1细胞的增殖和吞噬活性作用最强,细胞因子TNF-α和IL-6均出现分泌量高峰。通过硅胶柱层析对正丁醇部位萃取物进行分离,得到7个洗脱组分,其中Fr.2表现出最强的促进细胞增殖活性、吞噬活性和细胞因子分泌活性。当Fr.2质量浓度为12.5μg/m L时,促进Ana-1细胞增殖作用,吞噬活性最强,细胞因子TNF-α和IL-6出现分泌量高峰。通过液相质谱对Fr.2中主要成分进行结构表征,确定Fr.2中主要成分为腺苷,化学分子式为C10H13N5O4。     

三维细胞支架的制备及在卷烟烟气细胞毒性评价中的应用

为开发用于卷烟烟气体外毒理学评价的三维细胞支架,采用高内相乳液法制备材料,以其为载体进行人肺腺癌细胞A549的三维培养,评价3R4F和CM8两种参比卷烟烟气总粒相物(TPM)的细胞毒性,并与二维平板培养细胞的实验结果进行了对比。结果表明:(1)A549细胞在三维细胞支架上可以吸附、增殖并融合形成细胞层,且在亲水改性支架上增殖更快;(2)培养21d后,三维细胞支架上A549细胞的吸光度(OD值)为3.601,高于二维平板上细胞长满(培养7 d)时的OD值(3.055);(3)3R4F和CM8卷烟烟气TPM浓度与二维平板和三维细胞支架培养的A549细胞存活率均具有良好的剂量-反应关系,且在高TPM浓度时,三维细胞体系下的细胞存活率高于二维细胞体系。该研究为卷烟烟气体外毒理学评价提供了一种新的三维细胞培养方法。     

卷烟安全性毒理学评价体系的建立

针对卷烟烟气复杂体系安全性毒理学评价的难题,在国内首次研制了卷烟烟气动物染毒装置和卷烟体外毒理学主流烟气暴露装置,建立了包括动物吸烟急性毒性实验、鼠伤寒沙门氏菌诱变性试验(Ames试验)、细胞毒性试验、微核试验、细胞恶性转化试验、细胞氧化损伤试验等1项体内毒理学试验方法和5项体外毒理学试验方法的卷烟安全性毒理学评价体系,为定量评价卷烟烟气对机体损伤程度提供了完善的研究平台.     

3种不同焦油卷烟烟气的细胞毒性比较

采用中性红法测定了K2R4F参比卷烟和15、8和3mg/支焦油市售国产混合型卷烟烟气的细胞毒性。即卷烟主流烟气经洁净空气稀释后直接导入BALB/c3T3细胞培养瓶中染毒,而后采用中性红法测定细胞毒性,并计算出基于烟气总粒相物的相对细胞死亡率和LC50。结果表明:4种卷烟的细胞毒性依次为15mg/支焦油卷烟>>8mg/支焦油卷烟≈K2R4F>3mg/支焦油卷烟,与这3种国产卷烟样品烟气气相自由基、烟草特有N-亚硝胺和稠环芳烃的降低一致。说明卷烟减害降焦,可以降低其烟气的细胞毒性,降低吸烟对健康的危害。     

香菇超细粉对人体细胞因子的调节作用

通过青年志愿者服用香菇超细粉,使用Millipore Human Kit和液体芯片扫描仪检测服用前后血清中39种细胞因子浓度的变化,研究香菇对人体细胞因子的调节作用。结果表明:食用5g香菇后EGF浓度显著升高、IP-10浓度显著降低,食用10g香菇后G-CSF、IL-12(p70)、IP-10、MCP-1 4种细胞因子浓度显著降低,食用15g香菇后Eotaxin、G-CSF、IL-12(p70)、MCP-1、MIP-1β、TGF-α6种细胞因子浓度显著降低。根据显著变化的细胞因子进行信息检索,按照其合成与分泌细胞及其作用的靶细胞数据,构建食用3种剂量香菇后人体细胞通讯网络图。从细胞通讯网络图可以看出,食用5g香菇具有对人体免疫的双向调节作用,食用10g和15g香菇均具有下调免疫的作用;不同剂量组显著变化的细胞因子不同,细胞通讯规律也不同,高剂量香菇对免疫系统的调节作用较强;推断香菇超细粉具有抑制炎症发生、抗过敏、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤的功能。     

蒲公英糖蛋白体外抗炎作用及对NF-κB信号通路的调控

探讨蒲公英糖蛋白(glycoprotein from Taraxacum,TG)对由脂多糖引起的RAW264.7细胞炎症的抗炎效果,并阐明其活性的基本分子机制。利用脂多糖刺激RAW264.7细胞,建立体外炎症模型,采用噻唑蓝比色法检测TG对RAW264.7细胞的增殖毒性,Griess试剂法检测了一氧化氮(nitric oxide,NO)的分泌情况,反转录聚合酶链式反应检测炎症细胞因子——白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)m RNA以及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)m RNA的表达水平,酶联免疫吸附测定法测定IL-6和TNF-α的分泌量,Western blot检测P-IκB-α蛋白的表达水平,用以研究TG对核转录因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号转导通路的抑制作用。结果表明:TG能够显著甚至极显著地抑制NO的分泌,IL-6、TNF-α、i NOS的m RNA的表达,IL-6和TNF-α的分泌(P0.05、P0.01)。TG高度显著上调了IκB-α的蛋白表达(P0.001),并显著下调了P-IκB-α的蛋白表达(P0.05),且与TG质量浓度成正比。其中在TG质量浓度为250、500、1 000μg/m L时对TNF-α分泌量的抑制率分别为28.6%、65.4%、89.3%,对IL-6分泌量的抑制率分别为32.3%、54.1%、85.7%。TG间接抑制了NF-κB信号转导途径,有显著的体外抗炎效果且抗炎效果与TG的质量浓度呈剂量依赖性。     

皮蛋蛋白水提物在肠道系统中的抗炎作用研究

皮蛋是我国独创的一种传统大宗蛋制品,也是一种良好的"清热去火"食品。以"去大肠火"为导向,运用TNF-α诱导的Caco-2细胞炎症反应模型和DSS诱导的小鼠结肠炎模型考察皮蛋蛋白水提物的体内、外抗肠炎活性。结果表明:皮蛋蛋白水提物(5和10 mg/mL)显著抑制Caco-2细胞IL-8的分泌,下调促炎细胞因子IL-8、TNF-α、IL-6和IL-1β基因的表达,并上调抗炎因子IL-10基因的表达。皮蛋蛋白水提物(150或300 mg/kg BW)可以有效缓解DSS诱导的结肠炎小鼠体重减轻和炎症临床症状,降低促炎细胞因子TNF-α和IL-6的分泌,并下调结肠中促炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ、MCP-1和IL-17A基因的表达。体内、外试验结果说明皮蛋蛋白水提物具有抗肠炎活性,可有效保护肠道健康。     

MAPK信号通路调节卷烟烟气诱导的炎症因子的释放

为评估卷烟烟气对人支气管上皮细胞(BEAS-2B)的毒性效应,使用细胞计数试剂盒(CCK-8)对BEAS-2B细胞进行检测,使用光学显微镜对细胞形态进行观察,采用Western Blot实验检测丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶1/2(JNK1/2)和p38的磷酸化水平的变化,采用酶联免疫吸附实验检测炎症因子白介素-1β(IL-1β)、IL-6和IL-8的释放水平。结果表明:①卷烟烟气染毒会显著降低BEAS-2B细胞的存活率。②卷烟烟气染毒会激活磷酸化的ERK1/2、JNK1/2和p38信号通路,并且会诱导炎症因子IL-1β、IL-6和IL-8释放水平升高。③特异性抑制剂分别抑制ERK1/2、JNK1/2和p38信号通路后,炎症因子释放水平显著下降。卷烟烟气诱导的炎症受MAPK信号通路的调节,该结果可为卷烟烟气诱导的肺部炎症相关疾病的机制研究提供参考。     

部分国产烤烟型卷烟烟气冷凝物的中性红细胞毒性试验

采用中性红法检测了20个牌号的国产烤烟型卷烟烟气冷凝物(TPM)对中国仓鼠肺上皮细胞(CHL)的细胞毒性,结果表明:①阳性对照化合物氯喹的IC50为15.0±0.23μg/mL,而20个牌号卷烟TPM的IC50为119.5±13.6~218.4±15.9μg/mL;②盒标焦油15mg/支卷烟TPM对CHL的细胞毒性显著高于11mg/支卷烟,极显著高于10、9、8、5mg/支卷烟;③卷烟的TPM与其对CHL的IC50负相关。     

阿魏侧耳胞外多糖对小鼠巨噬细胞的激活作用

利用巨噬细胞体外培养体系,研究阿魏侧耳胞外多糖对小鼠巨噬细胞的激活作用。无菌获得小鼠腹腔巨噬细胞,中性红吞噬实验检测细胞吞噬活性;荧光探针标记和Griess反应分别检测细胞内外NO的含量,酶联免疫吸附法检测细胞内一氧化氮合成酶(NOS)、培养上清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)和白细胞介素12(IL-12)的含量。结果表明,与空白组相比,25~200 mg/L阿魏侧耳胞外多糖可显著增强巨噬细胞的吞噬活性(p0.05),增加细胞因子IL-1(p0.05)和IL-12(p0.05)的分泌量;50~200 mg/L阿魏侧耳胞外多糖可显著提高细胞NOS(p0.05)和NO(p0.05)的含量以及TNF-α的分泌量(p0.05)。因此,一定浓度阿魏侧耳胞外多糖对体外培养的小鼠巨噬细胞具有激活作用。     

费菜粗多糖对小鼠免疫活性的研究

目的 :研究费菜(Sedum aizoon L.)粗多糖对小鼠免疫活性的研究 方法 :首先采用水提醇沉法以及Sevage法去蛋白等工艺提取费菜粗多糖。体外实验需将配置成不同浓度的多糖提取液分别与脾脏细胞,RAW 264.7共培养,采用ELISA法检测细胞上清中细胞因子IL-2,IFN-γ, IL-6,TNF-α浓度的变化。采用cck-8法,研究费菜粗多糖对RAW 264.7增殖的影响。Griess法测定细胞上清液中NO的含量变化。结果 :与正常组相比,费菜粗多糖组显著增加IL-2,IFN-γ,IL-6,TNF-α,NO的分泌量,差异具有统计学意义(p0.01)。促进RAW 264.7增殖,差异具有统计学意义(p0.05)。结论 :费菜多糖轮增加脾淋巴细胞与RAW264.7分泌IL-2、IFN-γ、 IL-6、TNF-α、NO,促进RAW 264.7增殖.     

不同焦油释放量卷烟烟气的细胞毒性和基因毒性研究

采用体外细胞微核试验方法测定对照卷烟和2种不同焦油释放量卷烟的基因毒性.将3T3细胞暴露于ISO标准抽吸条件下产生的卷烟烟气环境中,首先测试烟气的细胞毒性来决定微核试验的烟气暴露浓度,再通过测定暴露于烟气的细胞微核的增加量来测试卷烟烟气的基因毒性.结果显示随着烟气暴露浓度的增大,3种卷烟烟气引起细胞微核的机率显著增大;加入S 9匀浆液不会增加细胞微核的产生机率,相反,+S 9组的3种卷烟烟气引起的细胞微核的增加比例较-S 9组显著降低.此外3种卷烟相比,1号测试卷烟烟气的基因毒性明显高于2号测试卷烟和K2R4F对照卷烟,2号卷烟烟气的基因毒性最低.     

不同焦油释放量卷烟烟气的细胞毒性和基因毒性研究

采用体外细胞微核试验方法测定对照卷烟和2种不同焦油释放量卷烟的基因毒性。将3T3细胞暴露于ISO标准抽吸条件下产生的卷烟烟气环境中,首先测试烟气的细胞毒性来决定微核试验的烟气暴露浓度,再通过测定暴露于烟气的细胞微核的增加量来测试卷烟烟气的基因毒性。结果显示随着烟气暴露浓度的增大,3种卷烟烟气引起细胞微核的机率显著增大;加入S 9匀浆液不会增加细胞微核的产生机率,相反,+S 9组的3种卷烟烟气引起的细胞微核的增加比例较-S 9组显著降低。此外3种卷烟相比,1号测试卷烟烟气的基因毒性明显高于2号测试卷烟和K2R4F对照卷烟,2号卷烟烟气的基因毒性最低。