苯并噻二唑(BTH)诱导烟草抗青枯病活性与抗病机理研究

利用离体叶片注射感病的方法.测定了BTH在100、50、25、12.5、6.25μg/mL浓度下,诱导烟草抗烟草青枯病的活性.结果表明:经BTH处理的烟叶病情指数均显著低于对照处理.处理14 d后,50 μg/mL BTH处理的烟叶相对诱导活性达到50%以上.检测与抗性相关的防御酶系活性的动态变化发现,在25 μg/mL的BTH浓度下,处理叶片的4种防御酶:苯并氨酸解氨酶(PAL),过氧化物酶(POD),多酚氧化酶(PPO)及超氧化物歧化酶(SOD)活性都有所提高,与对照比提高率分别达127.5%,54.9%,47.1%和70.3%.表明BTH诱导烟草抗青枯病的机理与激活植物体内防御酶活性有关.     

橙皮素对烟草青枯病的诱导抗性研究

为探究类黄酮诱导烟草抗青枯病的生理机制,从12种类黄酮化合物中筛选出对烟草青枯病防治效果最好的橙皮素,并对橙皮素处理后烟草叶片过氧化氢沉积、防御酶活性以及相关基因的表达量等进行了分析。结果表明,1mmol/L橙皮素对青枯菌无直接的抑菌作用,但对青枯病具有较明显的防控效果。橙皮素灌根处理诱发接种青枯菌烟草叶片过氧化氢的积累,显著提高叶片过氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性以及烟株次生代谢产物中酚类和类黄酮含量,上调表达Nt PR1a、Nt NPR1、Nt PAL抗性基因,从而提高烟株对青枯病的抗性。由此可知,橙皮素可作为诱抗剂有效防控青枯病的发生。     

苯并噻二唑（BTH）诱导烟草抗青枯病活性与抗病机理研究

摘要: 利用离体叶片注射感病的方法,测定了BTH在100、50、25、12.5、6.25μg/mL浓度下,诱导烟草抗烟草青枯病的活性。结果表明:经BTH处理的烟叶病情指数均显著低于对照处理。处理14d后,50μg/mL BTH处理的烟叶相对诱导活性达到50%以上。检测与抗性相关的防御酶系活性的动态变化发现,在25 μg/mL的BTH浓度下,处理叶片的4种防御酶:苯并氨酸解氨酶（PAL）, 过氧化物酶（POD）, 多酚氧化酶（PPO）及超氧化物化物歧化酶（SOD）活性都有所提高,与对照比提高率分别达127.5%,54.9%,47.1%和70.3%。表明BTH诱导烟草抗青枯病的机理与激活植物体内防御酶活性有关。      

硅酸钠对烟草青枯病的控病效果及烟叶膜脂过氧化的影响

为明确硅肥对烟草青枯病的抗性效果及其作用机理,采用田间试验研究了烟草云烟87品种施用硅酸钠对青枯病发病率、病情指数和烟叶膜脂过氧化的影响。结果表明,施用硅酸钠可降低烟草青枯病的发病率和病情指数。烟科所试点烟苗移栽后90 d和100 d,硅酸钠处理的烟株发病率分别较不施用硅肥的对照(CK)下降13.14%和12.08%,病情指数分别下降23.34%和21.26%,与CK间差异均达到极显著水平。随着青枯病发病时间的延长和发病程度的提高,烟草叶片中H_2O_2和丙二醛(MDA)含量增加,细胞膜透性和K~+外渗量增加。施用硅酸钠可显著降低烟草H_2O_2累积和MDA含量,减轻青枯病胁迫对烟草叶片的膜伤害,同时显著降低烟草超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性,提高过氧化氢酶(CAT)的活性。     

烟草倍半萜合酶基因NtTPS21的克隆及功能鉴定

萜类化合物在植物生长发育、胁迫响应以及抵御病原菌侵染过程中发挥重要作用,克隆烟草倍半萜合酶基因并研究其功能可为烟草萜烯合酶的功能鉴定及抗病育种提供理论依据。本研究从普通烟草红花大金元中克隆获得了一个倍半萜合酶基因 NtTPS21,通过生物信息学分析、表达模式分析、酶学性质分析以及NtTPS21代谢产物的体外抑菌试验等方法,鉴定NtTPS21的生物学功能。结果表明,NtTPS21开放阅读框为 1671 bp,编码556个氨基酸,具有典型的萜类合酶催化活性位点,与拟南芥倍半萜合酶AtTPS21具有较高同源性。NtTPS21定位于核质中,能够被烟草青枯病菌感染诱导,且在青枯病抗病品种“岩烟 97”中的表达水平显著高于感病品种“长脖黄”。NtTPS21能够以法尼基焦磷酸（FPP）为底物,催化合成倍半萜类化合物 β-石竹烯,其代谢产物对烟草青枯病菌的生长具有显著抑制效果,以上结果说明NtTPS21基因及其代谢产物可能与烟草青枯病抗性相关。     

采后BTH处理对苹果果实苯丙烷代谢和病程相关蛋白积累的增强作用

本文探讨采后苯丙噻重氮(BTH)处理对苹果果实苯丙烷代谢和病程相关蛋白产生的增强作用。以"国光"苹果为试材,采后用100mg/L BTH浸泡处理10min,测定处理对果实苯丙烷代谢相关酶活性、产物积累和病程相关蛋白产生的影响。结果表明,BTH处理显著提高了苹果果实体内苯丙氨酸解氨酶(PAL)、4-香豆素辅酶A连接酶(4CL)的活性,增加了总酚、类黄酮及木质素含量,同时提高了β-1,3葡聚糖酶(GLU)、几丁质酶(CHT)和过氧化物酶(POD)的活性。由此表明,采后BTH处理可通过诱导果实苯丙烷代谢和促进病程相关蛋白的产生来增强果实对采后病害的抗性。     

生物有机肥对烟株和土壤酶活性以及烟草超微结构的影响

将拮抗烟草青枯病菌株L-25和L-9接种有机肥底物载体（菜粕与牛粪有机肥1:1（w:w））,发酵后制成生物有机肥（BOF）,在安徽进行2年生物防控烟草青枯病的田间试验。结果表明,第一年和第二年施用BOF,移栽105天后烟草青枯病的生物防控率分别达到75.2 %和95.4 %;与对照相比,BOF处理烟叶和根系的过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和多酚氧化酶都显著减少（p＜0.05）,土壤过氧化物酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶和脲酶显著高于对照处理;扫描电镜结果显示,发病烟株的维管束导管中有大量粘性物质堵塞于其中,而且维管束严重变形,而健康烟株和施用BOF后未发病烟株的维管束形态较正常,未有严重变形。抑制烟草青枯病型生物有机肥的施用可以提高烟草青枯病的生防率,显著降低烟叶和根系的抗性酶活,增加土壤氧化还原酶和脲酶的活性,减少烟草维管束堵塞、变形的发生。      

β-氨基丁酸对烟草黑胫病的抗性诱导

为明确β-氨基丁酸(β-aminobutyric acid, BABA)对烟草由寄生疫霉(Phytophthora parasitica)引起的黑胫病抗性的诱导效果, 对BABA处理后的烟草进行了病害调查, 并检测了生理生化指标和抗性相关基因表达量。结果表明:①BABA诱导烟草产生超敏反应(Hypersensitive response, HR), 且诱导与产生超敏反应相关的HIN1基因表达量增加。②BABA可诱导过氧化物酶(Peroxidase, POD)、多酚氧化酶(Polyphenol oxidase, PPO)和过氧化氢酶(Catalase, CAT)活性提高;在烟草未接种P. parasitica时, BABA不仅诱导O₂-含量增加了142.2%, 还导致丙二醛(Malondialdehyde, MDA)的积累;烟草接种P. parasitica后, BABA使与活性氧产生相关的NtrbohD基因表达量降低56.9%。③5 mmol/L BABA处理对烟草的黑胫病抗性具有诱导作用, 处理后烟草黑胫病的防治效果达56.3%。      

试验土壤中烟草青枯病菌的RT-qPCR检测分析

为有效防治烟草青枯病,利用实时荧光定量PCR(Real-time quantity PCR,RT-qPCR)技术,对土壤中烟草青枯病菌进行了定量检测,并建立了土壤中烟草青枯病菌的RT-qPCR检测方法。结果表明,该方法对试验土壤青枯菌的最低检测浓度为5×10~2cfu/g土壤,RT-qPCR检测技术对土壤中烟草青枯病菌的灵敏度比常规PCR检测技术提高了10倍。     

顺-冷杉醇诱导烟草抗青枯病的效果及作用机制研究

为探究顺-冷杉醇诱导烟草抗青枯病的适宜处理条件和作用机制，采用盆栽接种方法，研究了顺-冷杉醇灌根施用的适宜浓度、时间间隔和次数，测定了顺-冷杉醇处理后烟草根部主要防御酶活性、植保素和植物激素含量的变化，利用高通量测序技术测定了顺-冷杉醇对烟草根系转录水平的影响。结果表明，顺-冷杉醇施用浓度60～80mg/L对烟草青枯病的防效为54.50%～57.10%，与阳性对照中生菌素相当，其适宜施用时间间隔为3～6 d，连续施用2～3次；顺-冷杉醇处理后1～6 d烟草根部过氧化氢酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性显著提高，1～10d过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性显著提高，处理后3～6 d多酚类物质和木质素含量显著增加，1～3 d茉莉酸（JA）和水杨酸（SA）含量显著增加，引起烟草根部抗性基因NtSIPK、NtMEK2、Nt MAPK、NtPAL和NtC4H上调表达，提高烟株对青枯病的抗性。由此可知，顺-冷杉醇可作为诱抗剂有效防控烟草青枯病的发生。     

两株防治烟草青枯病的烟草根际拮抗菌

  目的  进一步丰富烟草青枯病的生防资源。  方法  采用抑菌圈法和盆栽试验测定分离自烟草根际的细菌菌株GZYCT-4和GZYCT-9对青枯病菌的拮抗活性;运用PCR技术检测拮抗细菌的生防标记基因,利用趋化性试验研究烟草根系分泌物及其所含的各种有机酸对拮抗菌根部定殖的影响。  结果  （1）GZYCT-4和GZYCT-9对烟草青枯病菌均具有较好的抑菌效果,培养48 h的抑菌圈直径分别为16.64 mm和18.90 mm,盆栽试验表明灌根接种施用GZYCT-4和GZYCT-9可有效防治烟草青枯病。（2）GZYCT-4和GZYCT-9菌株均检测到8个枯草芽孢杆菌生防标记基因,其脂肽类粗提物对烟草青枯病菌的抑菌圈直径分别达到16.24 mm和20.71 mm。（3）GZYCT-4对红花大金元根系分泌物有较强的趋化反应,且红花大金元根系分泌物含有的草酸对GZYCT-4吸引作用较大,而GZYCT-9则对K326根系分泌物有较好的趋化反应,K326根系分泌物所含的柠檬酸对GZYCT-9有较好的吸引作用。  结论  GZYCT-4和GZYCT-9菌株均可有效地防控烟草青枯病,且对不同品种的烟草根系分泌物及其所含的各种有机酸有趋化差异。      

接种丛枝菌根真菌对烟草青枯病抗性的影响

为探讨丛枝菌根真菌(Glomus intraradices和Glomus mosseae)对烟草青枯病抗病性的影响,采用盆栽试验研究了接种丛枝菌根真菌对烟草青枯病发病情况、抗病相关酶活性及丙二醛含量的影响。结果显示,接种Glomus intraradices和Glomus mosseae可促进烟草植株生长,烟株地上部和根系的干质量和磷含量以及地上部的氮含量显著增加,同时烟草青枯病的病情指数及发病率降低;在接种青枯菌条件下,与对照(烟株接种病原菌,但不接种丛枝菌根真菌)相比,接种Glomus intraradices和Glomus mosseae后,烟草叶片过氧化物酶活性分别增加22.9%和26.9%,同时丙二醛含量呈下降趋势。表明接种丛枝菌根真菌能提高烟株对烟草青枯病的抗性。     

一个受青枯病菌诱导的烟草功能基因NtCNGC1的克隆与表达分析

前期转录组研究发现1个环核苷酸门控离子通道（CNGC）基因在抗青枯病烟草品种DB101中上调表达,推测可能参与抵抗烟草青枯病菌侵染的防卫反应。为进一步研究该基因在烟草诱导防御反应中的作用,本研究采用PCR扩增法从DB101中获得烟草CNGC基因的cDNA和基因组序列,命名为NtCNGC1基因。生物信息学和基因表达分析表明,该基因含有8个外显子和7个内含子,编码区（CDS）全长2154 bp,编码717个氨基酸,蛋白分子量为83 kD,理论等电点为9.35。在NtCNGC1基因起始密码子上游1500 bp的核苷酸序列区间预测到防御与应激反应、病原菌应答、水杨酸响应、真菌激发子响应及伤口响应等应答元件。NtCNGC1基因在烟草根中表达最高、茎中其次、叶中最低。受青枯病菌诱导后,NtCNGC1基因在抗病品种（DB101）中的表达量明显高于感病品种（红花大金元）。初步证实NtCNGC1为烟草青枯病抗性相关基因。      

邻苯二甲酸二丁酯降解菌对烟草青枯病的抑制作用

为有效防治烟草青枯病,采用细胞培养和毛细管法研究了烟草化感自毒物质邻苯二甲酸二丁酯对青枯菌的影响及趋化诱导效应,同时采用梯度训化法筛选邻苯二甲酸二丁酯降解菌,并通过盆栽试验测定了邻苯二甲酸二丁酯降解菌处理后的烟草青枯病发病率。结果表明,邻苯二甲酸二丁酯对青枯菌具有趋化诱导作用,并且在低浓度条件下能促进青枯菌生长;筛选的邻苯二甲酸二丁酯降解菌(Acinetobacter sp. Ed2)在土壤中对邻苯二甲酸二丁酯降解效率为51.17%;土壤中添加邻苯二甲酸二丁酯的处理(T1),与对照(CK)相比青枯菌数量显著提高59.89%;经邻苯二甲酸二丁酯降解菌Ed2处理(T2)后,与对照和T1处理相比,土壤中青枯菌数量分别降低84.63%和90.38%,青枯病发病率分别降低52.23%和136.42%。因此,利用邻苯二甲酸二丁酯降解菌消耗土壤中的邻苯二甲酸二丁酯,既减少青枯菌的营养供给,又截断邻苯二甲酸二丁酯对青枯菌的趋化诱导作用,从而显著降低了青枯病发病率。     

酸碱度对烟草青枯菌生长特性的影响

为探究酸碱度对烟草青枯菌生长特性的影响,在混合青枯菌的不同酸碱度土壤中测定烟草青枯病的发病情况。应用qRT-PCR方法测定不同酸碱度条件下烟草青枯菌的消长动态,通过结晶紫法和半固体培养基法分别测定青枯菌的生物膜和运动性在不同酸碱度条件下的变化。结果表明:烟草青枯病在弱酸性和中性(pH 6.0~7.0)土壤中发病严重。烟草青枯菌的消长动态结果显示,青枯菌数量在pH 6.5的土壤中最多,为9.1×108cfu·g~(-1) FW。烟草青枯菌生物膜成膜能力在pH 5.5时最强,pH 7.0时最弱。pH6.5时烟草青枯菌的运动性最强,pH 8.0时最弱。土壤酸碱度通过影响青枯病菌的消长、成膜能力和运动性进而影响烟草青枯菌对烟株的侵染。     

温度、湿度、接菌量及pH对烟草青枯病菌致病力的影响

烟草青枯病菌是土传病原细菌,其致病力易受多种因素影响。采用穿刺法接种离体叶片,系统性地研究了温度、湿度、接菌量和pH对烟草青枯病菌致病力的影响。试验范围内青枯病菌可致病的病原菌数量为1.3~1.3×108 cfu,1.3×108 cfu病斑面积最大;致病的温度范围为20~35℃,最适为30~35℃,病害潜伏期随着温度升高而变短;40%~100%的相对湿度范围内均可发病;致病pH范围为5.0~8.0,最适发病pH为6.0。影响青枯病菌致病力的关键因子为温度和pH,湿度不是青枯病发生的关键因素,结果为研究烟草青枯病发生机制提供了科学依据。     

福建烟草青枯菌演化型及生化变种鉴定研究

本研究尝试采用国际上新兴的青枯菌演化型分类框架并结合传统的生化变种鉴定方法,旨在探究福建省烟草青枯病菌系的构成,从而揭示青枯病的流行规律,为指导烟草青枯病的抗病育种提供理论依据。2008~2009年,分别于福建省南平、三明以及龙岩地区田间烟草病株上分离获得了45个烟草青枯病菌株。经青枯菌演化型复合PCR检测,45个菌株均能够扩增得到片段大小分别为144 bp和280 bp的两条特异性扩增条带,从而表明全部分离菌株均系青枯菌演化型I型即亚洲分支菌株。继而基于45个分离菌株对3种双糖和3种己醇氧化利用能力的检测结果,鉴定出其中43个菌株属于青枯菌生化变种III,1个菌株属于生化变种IV,1个菌株属于非标准型生化变种（能利用山梨醇和甜醇,不能利用3种双糖和甘露醇）。该研究结果部分揭示了造成国外引进的烟草品种青枯病抗性水平下降或丧失的可能原因。      

烟草抗青枯病的药剂诱导效应与抑菌增效作用

采用离体与活体叶脉注射染病法,比较了几种诱导剂对烟草抗青枯病的效果.结果表明,苯并噻二唑(BTH)对烟草诱导抗病具有显著效应,在50μg/mL浓度处理下,离体和活体诱导抗痛效率分别为60.96%和52.76%.以100,50,25,12.5,6.25μg/mL BTH浓度处理后5至15 d的测定结果,50μg/mL以上浓度离体和活体的诱导效率均达到50%以上.离体病原菌抑茵活性测定结果显示BTH对病原菌没有抑制活性,而分别以12.5 μg/mL BTH和25 μg/mL的农用硫酸链霉素混配,离体和活体相对防效分别达到75.31%和73.98%,增效系数在20以上,表现出显著的联合增效作用.     

不同烟草青枯病抗性品种的蛋白质组学比较

为探讨烟草品种对青枯菌的抗病性及抗性机理,应用蛋白质双向电泳联用质谱技术,对青枯病抗病品种DB101 和易感品种红花大金元叶片的蛋白质组成进行了比较分析。结果表明,26 个蛋白质在2 个不同抗性品种中发生了差异变化, 其中在DB101 表达量上升的有12 个,在红花大金元表达量上升的有14 个。用MALDI-TOF/OF MS 分析和数据库检索共鉴定出其中的22 个蛋白质。根据这22 个鉴定出来的蛋白质所参与的代谢途径和生化功能将它们分为6 类,即光合作用、代谢和能量、过氧化物平衡、表达调控、防卫相关蛋白和推测蛋白。研究表明,烟草对青枯病病原菌的侵染存在一个复杂的抗病信号应答和代谢调控网络。在这22 个鉴定出的蛋白中,有2 个在抗病品种DB101 中显著上调的蛋白谷氨酸-1-半醛2,1-氨基变位酶和二氨基庚二酸脱羧酶在以往的研究中还未见报道,可能与烟草对青枯病的抗病性密切相关。本研究为进一步揭示烟草对青枯病的抗性机理及相关抗病基因的功能克隆提供了依据。     

烟草青枯病拮抗菌的筛选及发酵条件试验

为了筛选对烟草青枯病有拮抗作用的生防菌株,有效防治该病害,从青枯病发病较重田块的健康烟草根系周围土壤中取样,采用点接法筛选出6株对烟草青枯病有较强拮抗作用的菌株,其抑菌圈直径均8 mm,其中菌株XC4抑菌活性较强且拮抗效果稳定。通过单因素试验进行了发酵条件的初步研究,结果表明,当发酵时间48 h,发酵温度30℃,p H值7,接种量2%,转速190 r/min,碳源为牛肉膏,氮源为胰蛋白胨时,菌株XC4发酵效果最好。发酵条件经初步优化,菌株XC4对青枯病菌的拮抗效果由原来的抑菌圈直径12.5 mm增至21.5 mm,比优化前提高了72%。