福寿螺(Ampullaria crossean)mfc 基因的分子克隆和序列分析

目的:从福寿螺胃组织细胞中扩增多功能纤维素酶基因,与pGEM T-easy载体连接,转化大肠杆菌删DH5 a.结果:该基因全长为1 225 bp,上游5'端非翻译区19 bp,3'端非编码区21 bp,开放阅读框(0pen reading frame,ORF)1 185bp,编码395个氨基酸,推测等电点pI为6.57,分子质量45.8k Da.推测的多功能纤维素酶具有糖苷水解酶保守的氨基酸序列,属于糖苷水解酶第10家族.同源性比对结果显示,该基因及推测的氨基酸序列与egx(GenBank Accession No.AAP 31 839)的同源性分别为99.3%和99.8%,在8个位点出现核苷酸差异.在1个位点出现氨基酸差异.通过软件分析并预测,该基因编码的蛋白共存在14个丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点.没有信号肽序列.结论:成功克隆出福寿螺多功能纤维素酶基因.     

烟草钾离子通道基因NKT5的克隆和序列分析

本研究运用已经获得的1条490bp的普通烟草钾离子(K~+)通道基因的中间片段来设计特异性引物,应用RACE方法获得其3'和5'末端cDNA序列。通过三段cDNA序列拼接结合全长克隆测序验证,获得一个未报道的普通烟草K~+通道基因,并将其命名为NKT5(NCBI登录号为HM010922)。NKT5的cDNA全长为2365bp,其中5'端非编码区190bp、3'端非编码区249bp、编码区1926bp,编码641AA。对该基因进行了序列分析及功能预测,为进一步阐明其在烟草吸钾及抗逆过程中的功能及分子机制奠定了基础。     

皮状丝孢酵母脂肪酸CoA连接酶 (Facl)基因的克隆与分析

从皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)中克隆了Facl基因及其5'-上游序列,并对Facl基因及其5'-上游序列进行了分析。根据前期的基因组文库测序结果,获得了898 bp DNA序列。以此为基础,2次使用染色体步移(Genome walking)方法,分别获得了854 bp和1 236 bp 5'-DNA序列。根据获得的5'和3'端序列,合成引物用于扩增Facl基因的全长DNA和c DNA序列。分析发现,皮状丝孢酵母Facl基因c DNA包含一个1 662 bp的开放读码框,DNA不含内含子序列。同时获得了482 bp的5'-上游序列。在5'-上游序列区域存在一系列预测的顺式作用元件。相似性分析的结果表明T.cutaneum和Rhodococcus erythropolis的Facl氨基酸序列相似性最高。该研究旨在为后继的Facl基因的功能和表达的研究、油脂代谢的遗传改造奠定基础。     

烟草NtRAX基因的克隆和序列分析

根据GenBank中拟南芥RAX基因序列, 在烟草EST数据库中进行Blastp检索, 获得与之同源性较高的蛋白质序列, 选取同源性最高的蛋白质序列所对应的核酸序列, 设计引物, 获得中间片段, 再运用中间片段设计引物, 应用RACE方法获得其5′和3′末端cDNA序列, 将获得的3段序列拼接, 结合全长克隆测序验证, 获得一个新的普通烟草基因, 将其命名为NtRAX(NCBI登录号为JQ228591)。NtRAX的cDNA全长为1112 bp, 5′端非编码区96 bp, 3′端非编码区62 bp, 编码区长度为954 bp, 编码317个氨基酸, 预测的分子量是35.42 KDa。对该基因进行序列分析和功能预测, 得出该基因属于MYB基因家族, 是具有转录激活活性的烟草腋芽分生组织形成的调控基因。     

巴氏杜氏藻ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆与分析

ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)基因是胡萝卜素生物合成途径中的一个关键酶之一。根据实验室已获得的巴氏杜氏藻ZDS基因的cDNA序列,设计引物,通过分段PCR的方法,获得ZDS基因的编码区序列。然后根据获得编码区序列,利用染色体步移的方法获得其两端侧翼序列:启动子和终止子,并利用生物信息学工具对获得序列进行分析。实验获得的完整ZDS基因全长11896 bp,其中编码区序列(从"ATG"到"TAA")长度为6435,编码区上游序列4091 bp(包括33 bp的5’UTR序列),编码区下游序列1370 bp(包括411 bp的3’UTR序列)。将编码序列与cDNA(开放阅读框)进行比对,发现整个编码区序列含有12个外显子和11个内含子,其中内含子长度达4686 bp,约为外显子长度的2.68倍,内含子均以GT开始,AG收尾,属于最常见的内含子类型。通过生物信息学分,发现ZDS启动子中具有多种转录因子结合位点,包括与光调控有关的GAGAbox,ASF1;与植物黄化反应有光的ACGTbox等。     

甘蓝型油菜KCS13基因克隆与组织表达特异性分析

通过巢式PCR和基因组步移方法,从油菜的基因组中获得一段长度为3 356bp的序列。分析显示,该序列包含了KCS13基因的编码序列和启动子,命名为甘蓝型油菜KCS13基因,其转录区全长为1 587bp,编码区长1 389bp,无内含子,编码一条长462个氨基酸的多肽链。在甘蓝型油菜A、C基因组中都有KCS13基因存在。该基因主要在花蕾中表达,茎、叶和种子中表达稍弱,根中未检测到该基因表达。     

烟草橙蛋白基因的克隆与生物信息学分析

为了获得烟草OR(NtOR)基因的全长序列和进一步揭示其在特色烟叶形成中的作用,采用同源克隆法从烟草品种K326中克隆了NtOR的全长cDNA和基因组DNA序列,GenBank登录号为JN379458和JN375578.生物信息学分析表明,NtOR基因组DNA全长5027bp,cDNA为1188 bp,编码317个氨基酸残基.NtOR蛋白具有2个跨膜域、1个信号肽剪切位点、5个糖基化位点和11个磷酸激酶修饰位点,二级结构包含12个α-螺旋和20个β-折叠,亚细胞定位于质膜上.系统进化与BLAST分析表明,NtOR是SlOR和ViOR的垂直同源基因.GENEVESTIGATOR数据库的芯片结果显示,NtOR基因在子叶中的表达量最高,其次是成熟叶片、幼茎和花,其他组织器官的表达相对较弱.     

巴氏杜氏藻八氢番茄红素脱氢酶基因的克隆与分析

八氢番茄红素脱氢酶(PDS)是巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)类胡萝卜素生物合成途径中的上游关键酶。本研究根据NCBI上已发布的巴氏杜氏藻mRNA序列(GenBank:Y14807),设计特异性引物,通过基因组步移法及半巢式PCR的方法,获得PDS编码区序列。在编码区序列获取过程中,发现5’端编码区有325 bp序列与NCBI上公布的cDNA序列有所不同,故采用了5’RACE技术进行验证,经过比对发现结果与本实验基因组步移所获得序列相匹配,推测NCBI公布mRNA序列的PDS与本实验获取的PDS可能为同工酶。然后根据获得的序列,再利用基因组步移PCR的方法获得其两端侧翼序列:启动子和终止子,并利用生物信息学工具对其进行分析。实验获得的完整PDS基因全长12678 bp,其中编码区序列长度为8113 bp,编码区上游序列3010 bp,编码区下游序列1555 bp,编码区序列含有12个外显子和11个内含子。通过生物信息学分,发现PDS启动子中具有多种转录因子结合位点。     

油茶甘油二酯激酶基因（CoDGK3）的克隆与表达分析

以油茶转录组数据为基础,采用RT-PCR和RACE技术,根据Unigene序列设计油茶甘油二酯激酶基因(Co DGK)RACE引物,分离克隆了DGK基因全长c DNA序列,命名为Co DGK3(Gene Bank登录号:KM068056),基因全长1 568 bp,开放阅读框1 455 bp,编码485个氨基酸;氨基酸同源比对及序列分析表明油茶与其它物种的DGK氨基酸序列具有较高的相似性,其中与麻风树和毛果杨相似性最高,达到78%;利用生物学软件对蛋白质进行生物信息学分析,获得其结构特点及理化性质;分析转录组数据中DGK相关的Unigene序列RTKM值和对Co DGK3基因实施实时荧光定量PCR,结果表明Co DGK3在油茶种子发育各时期表达量变化差异不大,并且发现转录组数据分析和实时荧光定量分析的结果变化规律一致,证明了转录组测序的有效性。     

产毒红曲菌中生物合成桔霉素基因——pksCT基因的保守性分析

选用7种14株产桔霉素红曲菌,运用基因组PCR分析方法,从它们的基因组中分别扩增到两条大小分别为669bp和591bp的pksCT基因翻译起始区部分序列和终止密码子区部分序列片段.扩增产物的测序结果通过NCBI进行BLAST同源性分析.结果显示扩增产物序列之间具有高度同源性,且分别与Genbank中公布的紫色红曲菌中pksCT基因翻译起始区部分序列和终止密码子区部分序列一致.pksCT基因是红曲菌中普遍存在的生物合成桔霉素基因.运用基因组PCR分析pksCT基因,是鉴别红曲菌产毒株的有效方法之一.