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1.
目的优化重组人成骨蛋白-1(rhOP-1)包涵体蛋白的复性条件。方法将表达rhOP-1的大肠杆菌菌体在冰浴下超声裂解,分离提取包涵体,用8mol/L尿素溶解,纯化后进行梯度透析复性。利用TotalLab软件分析目的蛋白二聚体的含量,用体内法和体外法测定其生物学活性。结果经纯化后,目的蛋白纯度达97%以上。最佳复性条件为4℃,pH9.0,蛋白浓度为0.4~0.8mg/ml,尿素浓度为2mol/L,L-Arg浓度为0.4mol/L;目的蛋白复性率达75%以上,复性后蛋白具有较高的生物学活性。结论已确定了rhOP-1包涵体梯度透析复性的最佳条件。 相似文献
2.
目的优化重组HIV-1跨膜蛋白Gp41包涵体的纯化条件。方法将表达Gp41的大肠杆菌菌体高压匀浆破碎、洗涤分离提取包涵体,以不同pH值的低浓度变性剂溶解包涵体,稀释复性并用离子交换层析纯化目的蛋白,纯化产物经West-ernblot进行鉴定。结果以50mmol/LTris buffer、2mol/L,pH11.5尿素溶解的包涵体蛋白得到很好的溶解,目的蛋白复性得率大于40%。经纯化后,目的蛋白的纯度大于90%,且具有良好的反应原性。结论优化了重组HIV-1跨膜蛋白Gp41包涵体的纯化条件,为HIV-1Gp41抗原纯化工艺的放大提供了依据。 相似文献
3.
目的 建立重组羧肽酶原B复性方法及活性羧肽酶B的纯化方法。方法 重组大肠杆菌发酵后 ,表达的羧肽酶原B包涵体经洗涤、变性 ,采用凝胶过滤的方法对其进行复性及纯化。所得的复性液经Trypsin酶解后 ,采用DEAE FF阴离子交换层析进行羧肽酶B的分离纯化 ,并采用SDS PAGE检测纯度。结果 经凝胶过滤后得到了复性和纯化的羧肽酶原B包涵体 ,在蛋白终浓度相同的情况下 ,复性效率比稀释复性提高了 5 0 % ,经DEAE离子交换柱一步纯化 ,得到了活性羧肽酶B ,纯度达到 90 %以上。以Hippuryl -L arg为底物测活 ,得到的活性酶的比活为 15 0u mg。结论 所建立复性方法及纯化方法为进一步的研究奠定了基础。 相似文献
4.
《中国生物制品学杂志》2010,(11)
目的原核表达、纯化重组结核杆菌Ag85a-ESAT6融合蛋白,并检测其生物活性。方法将Ag85a-ESAT6融合基因片段插入pET-28a(+)载体中,构建重组质粒pET-28a-Ag85a-ESAT6,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物在变性条件下经Ni-琼脂糖凝胶层析柱纯化复性后,在体外对经5种不同类型的表达结核杆菌Ag85a和ESAT6的重组痘苗病毒免疫的小鼠脾淋巴细胞进行刺激,以MTT法检测脾淋巴细胞的增殖反应。结果重组质粒pET-28a-Ag85a-ESAT6经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量约41000,主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的55.65%;纯化复性的重组融合蛋白纯度达95%以上,表达量约为1.2g/L发酵液,且具有良好的反应原性;与空痘苗病毒或生理盐水免疫的小鼠相比,5种重组痘苗病毒免疫的小鼠脾淋巴细胞与Ag85a-ESAT6融合蛋白共培养后,增殖活性明显升高(P<0.01)。结论成功利用原核系统表达了结核杆菌Ag85a-ESAT6融合蛋白,纯化复性的Ag85a-ESAT6融合蛋白具有生物学活性。 相似文献
5.
目的确定重组人ECSOD包涵体体外稀释复性和复性后蛋白纯化的适宜方法。方法通过对pH、温度、包涵体蛋白浓度、尿素和精氨酸浓度及氧化还原对比率的定性定量分析,研究重组人ECSOD包涵体体外稀释复性的基本条件。采用金属离子亲和柱(IMAC)和肝素亲和柱(Heparinsepharose)对复性蛋白进行纯化,比较纯化效率的差异。结果最佳复性条件为pH8.5,尿素浓度为1.5molL,精氨酸浓度大于0.3molL,GSH∶GSSG=4∶1;复性温度及包涵体蛋白终浓度越高,复性效率越低。IMAC和Heparinsepharose亲和柱均可用来纯化复性蛋白溶液,但Heparinsepharose纯化效率较高。结论确定了重组人ECSOD包涵体体外稀释复性的最佳条件及复性后蛋白纯化的方法。 相似文献
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从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位 总被引:3,自引:0,他引:3
目的 建立一种有效的方法,从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(rUreB)。方法重组大肠杆菌发酵后,表达的rUreB包涵体经洗涤、变性、复性,采用Q Sepharose Performance阴离子交换层析和Pheny1 Sepharose High Performance疏水层析分离纯化。使用 SDS-PAGE和HPLC检测纯度,选用 ELISA和 Western-bloning对纯化蛋白的生物学活性进行鉴定。结果 rUreB包涵体经洗涤和溶解后,rUreB的纯度>70%。包涵体溶解液经阴离子交换层析和疏水层析后纯度超过95%。rUreB纯品具有良好的生物学活性。结论 建立了从包涵体中获得高纯度的rUreB的工艺,为进一步的研究打下了基础。 相似文献
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目的 从大肠杆菌中获得载脂蛋白A I(米兰变体 ) 的包涵体 ,对包涵体进行复性、纯化 ,最终获得具有生物活性的载脂蛋白A I(米兰变体 ) 。方法 包涵体以尿素溶解后 ,以疏水层析法复性重组蛋白 ;以离子交换层析对其进一步纯化 ,并对所得的蛋白进行生物活性分析。结果 经复性纯化的蛋白纯度达 95 % ,体外生物活性检测显示其具有生物活性。结论 本法能快速有效地对目的蛋白进行复性、纯化 ,并且有望放大至工业生产规模 相似文献
8.
本文以rIL6的纯化为例进行实验。用超声破碎的方法提取出菌体蛋白粗提物和非相关包涵体杂质蛋白(rIL2包涵体),进而用常规免疫法制备兔抗菌体蛋白和包涵体杂质蛋白抗血清。从抗血清中用亲和层析法分离出抗菌体蛋白和包涵体杂质蛋白的特异IgG,然后偶联CNBr激活的Sepharose4B,制成抗菌体蛋白IgG和抗包涵体杂质蛋白IgG的亲和层析柱,即反向亲和柱Ⅰ和反向亲和柱Ⅱ。将反向柱Ⅰ和反相柱Ⅱ分别用01mol/LTrisHC1(pH80)平衡,用8mol/L尿素溶液溶解包涵体,稀释复性后经过反向柱Ⅰ纯化,rIL6含量达到79%… 相似文献
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对重组牛凝血酶原-2包涵体的体外重折叠复性进行了研究。凝血酶原-2是α-凝血酶生成过程中的一个最小的单链中间前体。重组牛凝血酶原-2在E.coli中高效表达并形成包涵体,经2.5mol?L?1脲和0.7%Triton X-100洗涤,再用8mol?L?1脲和0.3mol?L?1DTT溶解后,得到了包涵体裂解液。研究优化了体外复性溶液,其组成为含2.7mol?L?1脲、0.6mmol?L?1GSSG、GSSG/GSH0.9、0.1%PEG6000和0.5mol?L?1L-Arg、pH7.4Na3PO4缓冲液。牛凝血酶原-2复性后经透析,再被Echis Carinatus Snake Venom激活,转化为有活性的α-凝血酶,其总活力可达2948U?mL?1。结果表明稀释复性法可用于重组牛凝血酶原-2包涵体的体外重折叠复性。 相似文献
10.
大肠杆菌表达的rhGM—CSF发酵纯化工艺研究 总被引:4,自引:0,他引:4
重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)基因表达产物在大肠杆菌的胞浆中以不溶性包涵体的形式存在、包涵体用超声破菌分离后,经变性、复性,用流水层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等进行纯化。SDS—PAGE表明终产物纯度达97.8%。纯化蛋白的比活性根据MTT法在TF—1细胞测定的结果,可达3×107u/mg蛋白。 相似文献
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目的表达HPV16型MuE6/E7嵌合蛋白,并检测其免疫原性及抗肿瘤活性。方法将构建的重组MuE6/E7蛋白的表达载体转化大肠杆菌BL21(λDE3)进行诱导表达,表达的包涵体蛋白经分离、纯化、变性及复性后,通过离子交换和分子筛层析进行纯化。纯化蛋白经SDS-PAGE、Western blot、HPLC和质谱分析鉴定,并免疫C57BL/6小鼠,检测其免疫原性和抗肿瘤活性。结果重组MuE6/E7蛋白相对分子质量约为21 000,表达量约为23.06%,表达形式为包涵体,经复性、纯化后,纯度达97.17%。免疫3针后,小鼠可产生高滴度的HPV特异性抗体,并且与注射剂量呈正相关。免疫小鼠能抵抗TC-1肿瘤细胞的攻击,并可延长TC-1致瘤小鼠的存活期。结论已表达并纯化了重组MuE6/E7蛋白,其对TC-1致瘤小鼠具有一定的免疫治疗作用,为进一步研制HPV治疗性疫苗奠定了基础。 相似文献
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目的 探讨原核表达HPVl6 L1蛋白的变性、纯化及复性条件,并对复性效果进行评价.方法 将重组质粒PET28a-L1转化E.coli BL21(DE3).经放大培养诱导表达后,收集菌体.超声破碎后提取包涵体.并对其进行洗涤、变性,离子交换层析纯化,然后稀释复性.经电镜观察、红细胞凝集试验以及免疫原性分析,对复性效果进行评价.结果 LI蛋白在8 tool/L尿素中溶解不完全,SDS、硫脲和高pH值可提高其溶解度;纯化后的L1蛋白纯度可达90%;电镜可观察到VLP,并能凝集小鼠红细胞.免疫家兔后,可产生高滴度的抗体.结论 复性的HPVl6 LI蛋白在体外可自我折叠形成具有正确空间构象的VLP,且具有较好的免疫原性,为进一步研制HPVl6预防性疫苗及诊断试剂盒奠定了基础. 相似文献
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目的构建及表达人生长分化因子11(growth differentiation factor 11,GDF11)基因原核表达质粒,并对重组表达蛋白进行纯化。方法 PCR法扩增人源GDF11 cDNA全长序列,插入至载体pCold-I,构建重组质粒pCold-GDF11,转化感受态Rosetta(DE3)菌株,经终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导表达后,超声破碎获得GDF11包涵体,添加8 mol/L尿素溶解,与Ni~(2+)NTA Agarose充分混匀后装柱,用含谷胱甘肽(glutathione,GSH)和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)的复性液进行复性,经含咪唑的洗脱液洗脱获得目的蛋白,进行Western blot检测。结果重组质粒pCold-GDF11经双酶切及测序鉴定,构建正确;诱导表达蛋白的相对分子质量约45 000,主要以包涵体形式存在;GDF11蛋白纯化产物纯度达85%以上,每升菌液获得2.5 mg的目的蛋白,且可与小鼠抗His单克隆抗体发生特异性结合。结论成功构建了GDF11基因原核表达质粒,且表达产物经纯化后可获得纯度较高的目的蛋白。 相似文献
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嵌合蛋白sTNFRⅡ-IgG Fc纯化与生物学活性研究 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 建立嵌合蛋白sTNFR IgGFc的纯化工艺 ,并对该蛋白的理化和生物活性进行研究。方法 嵌合蛋白sTNFRⅡ IgGFc经变性、复性后 ,用金属螯合层析进行纯化 ,纯化的蛋白进行配基结合实验和拮抗TNF活性检测。结果 该嵌合蛋白的纯度大于 95 % ,在体外能够二聚化 ,保留了sTNFRⅡ对hTNFα的结合特性 ,同单体sTNFRⅡ相比 ,对hTNFα的拮抗活性明显提高。结论 为进一步研究奠定了基础 相似文献
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目的 在原核细胞表达抗HIV-1gp120单链抗体基因,纯化后检测其活性。方法 将单链抗体基因插入pET28原核表达载体进行诱导表达,对包涵体进行变性复性处理后,利用Ni-NTA金属螯合层析柱对表达的蛋白进行初步纯化,纯化后的单链抗体与gp120标准抗原膜条反应。结果 表达产物主要以包涵体形式存在,最高表达量占菌体总蛋白量的51%,金属螯合层析一步纯化后纯度超过85%。纯化后的单链抗体可以特异地识别gp120标准抗原。结论 在原核细胞表达的单链抗体,复性纯化后具有生物学活性。 相似文献
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目的 在大肠杆菌中表达人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段 (sTRAIL)基因 ,并研究其包涵体的复性。方法 应用RT- PCR法从正常人外周血单核细胞中获得sTRAIL的编码基因 ,将其克隆到原核表达载体pBV2 2 0 ,于大肠杆菌DH5α中通过温控诱导表达 ;将包涵体进行变性和复性处理后 ,采用离子交换层析纯化表达产物 ,并经Dotblot及MTT试验鉴定。结果 通过温度诱导 ,目的基因主要以包涵体形式高效表达 ,包涵体蛋白经梯度透析法复性可获得具有抗肿瘤活性的重组人sTRAIL。结论 已获得大量纯化重组人sTRAIL ,为开发新型抗肿瘤制剂奠定基础。 相似文献
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从包涵体中高效纯化HBx-蛋白 总被引:2,自引:0,他引:2
目的获得具有生物学活性的重组HBx-蛋白。方法经TNFMX缓冲液清洗表达的包涵体,再将 此包涵体变性,复性后,经亲和层析,分步洗脱、收集。结果获得大量高纯度的HBx-蛋白,HBx-该蛋白的纯度和回 收率分别达到96%和28%。结论此方法具有较好的纯化效果,也可应用于其他重组蛋白的制备。 相似文献
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目的在原核细胞表达抗HIV-1gp120单链抗体基因,纯化后检测其活性。方法 将单链抗体基因插入pET28原核表达载体进行诱导表达,对包涵体进行变异性复性处理后,利用Ni-NTA金属螯合层析柱对表达的蛋白进行初步纯化,纯化后的单链抗体与gp120标准抗原膜条反应。结果 表达产物主要以包涵体形式存在,最高表达量占菌体总蛋白量的51%,金属螯合层析一步纯化后纯度超过85%。纯化后的单链抗体可以特异地识别gp120标准抗原。结论 在原核细胞表达的单链抗体,复性纯化后具有生物学活性。 相似文献
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目的纯化大肠杆菌表达的重组幽门螺杆菌粘附素。方法将表达HpaA蛋白的工程菌经高压均质机破菌获得包涵体,经洗涤、变性、复性,Q Sepharose High Performance阴离子交换层析和亲和层析分离纯化。采用SDS-PAGE和HPLC检测纯度,用Western blot检测其抗原性。结果纯化后HpaA蛋白纯度高达95%以上,具有良好的抗原性。结论建立了从包涵体中获得高纯度HpaA纯化工艺,为进一步的研究打下了基础。 相似文献