二次贴壁法高效制备人脐带间充质干细胞

目的采用二次贴壁法高效制备人脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)。方法将传统组织块贴壁法弃掉的脐带组织块转移至新的培养瓶中进行二次贴壁,分离hUC-MSCs,并用无血清培养体系连续传代,镜下观察细胞形态;分别检测不同代次细胞的增殖能力、细胞周期、免疫表型、多向分化能力。结果二次贴壁法分离的hUC-MSCs在第4天即出现细胞克隆,第8天汇合度可达70%,经过二次贴壁法,1根20 cm的脐带组织共获得P3间充质干细胞(MSCs)总数为1×10~9个。二次贴壁分离的细胞增殖能力旺盛,与一次贴壁获得的干细胞同代次平均倍增时间差异无统计学意义(P0.05)。传统贴壁法与二次贴壁分离的细胞均表达超过98%的CD73、CD90、CD105和低于2%的CD34、CD45、CD14、CD79a、HLA-DR,且该细胞具有分化为成骨、成软骨和成脂能力。结论经无动物源培养体系体外扩增的二次贴壁分离方法可以获得大量具有MSCs生物学特性的hUC-MSCs,为其规模化临床应用奠定了基础。     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与鉴定

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)体外分离培养及鉴定的方法 ,为MSCs的系列研究奠定基础。方法采用全骨髓直接贴壁筛选法分离培养MSCs并传代,倒置相差显微镜下观察细胞形态,以MTT法检测细胞增殖水平并绘制生长曲线。取第3代MSCs,流式细胞术检测细胞周期和细胞表型,应用成骨细胞诱导液和脂肪样细胞诱导液诱导MSCs定向分化,鉴定其分化能力。结果全骨髓细胞培养5d,镜下可见贴壁细胞增殖明显,细胞形态较均一,大部分呈梭形,7d左右可传代,经2～3次传代后细胞呈单一梭形的成纤维样细胞,即MSCs;细胞生长曲线呈S形;经流式细胞仪检测,MSCs细胞76.01%处于G0/G1期,7.13%处于G2/M期,16.86%处于S期;MSCs表面不表达CD34;在特定诱导液作用下,MSCs可分别向成骨样细胞及脂肪样细胞分化。结论已成功建立了分离培养及鉴定MSCs的方法 ,可用来评价体外培养的MSCs。     

4种来源的间充质干细胞的生物学特性比较

目的比较骨髓、骨骼肌、肋软骨膜及软骨来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的生长、免疫表型及体外诱导分化能力的差异。方法分别获取新西兰大白兔的骨髓、骨骼肌、肋软骨膜细胞及软骨细胞,体外培养观察其生长形态、表型特征及其诱导成骨、成脂的分化能力。结果 4种来源的MSCs均从第2代开始转变为梭形,第3代逐渐出现漩涡状排列;骨髓、骨骼肌和软骨膜来源的细胞生长状态良好,可传10代以上,但软骨来源的细胞在第5代后,逐渐退变死亡。骨髓来源的原代细胞部分表达CD29、CD90、CD34,传代后不表达CD34,但CD29、CD90的表达逐代增强;骨骼肌、软骨膜及软骨来源的原代细胞均不表达CD29、CD90和CD34,从第2代开始均表达CD29、CD90,且不断增强;仅原代软骨细胞表达Ⅱ型胶原,至第2代基本不表达;无细胞表达Desmin。4种来源的第3代细胞经诱导均可分化为成骨细胞或成脂细胞。结论 4种来源的干细胞均具有MSCs的特点,但骨髓、骨骼肌、软骨膜来源的干细胞的生长明显强于软骨来源的干细胞。     

微囊化共培养诱导骨髓间充质干细胞体外定向成骨分化研究

为了模拟体内成骨微环境,为骨组织工程提供一种调控干细胞体外向成骨细胞定向分化的共培养新方法,SD大鼠骨髓间充质干细胞和包埋在海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(alginate-poly-lysine-alginate,APA)微胶囊中的SD大鼠成骨细胞进行体外共培养。共培养过程中,通过碱性磷酸酶(ALP)定量、定性分析以及钙化结节(von Kossa)染色等手段来评价骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化。结果表明在体外微囊化共培养过程中,被诱导细胞的胞内ALP酶活性逐渐高于对照组的干细胞,接近于成骨细胞;ALP以及von Kossa定性染色证实被诱导细胞具有较高的ALP活性以及具有分泌钙基质的能力。微囊化成骨细胞和外部干细胞的共培养体系较好地模拟了体内干细胞向成骨细胞转化的成骨微环境,促进了干细胞向成骨细胞的体外定向分化;微胶囊膜将成骨细胞和干细胞进行了隔离,避免了两者的直接接触和可能的细胞交叉污染混合,同时利于分离目的细胞,这种微囊化共培养体系为骨组织工程提供了一种安全调控干细胞体外成骨定向分化的工程化新方法。     

改良组织块贴壁法制备人脐带间充质干细胞

目的采用改良组织块贴壁法制备人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)。方法无菌条件下取足月婴儿脐带,采用改良组织块贴壁法分离间充质干细胞,台盼蓝染色法计数单个核细胞数,倒置相差显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞周期及免疫表型。结果原代hUCMSCs的数量为(1~5)×105个。培养至8 d,组织块边缘处有单细胞爬出;培养至2周,贴壁生长的细胞散在分布或形成小克隆;培养至20 d,细胞呈梭型、三角形或多角形。培养第20天的原代hUCMSCs的G0/G1期细胞占88.12%,S期细胞占1.23%,G2/M期细胞占10.65%,大多数细胞处于细胞增殖的潜伏期,CD105阳性率为97.65%,CD34阳性率为2.54%。结论采用改良组织块贴壁法分离了hUCMSCs,其生物学特性与骨髓间充质干细胞相似,为其临床应用奠定了基础。     

脐带间充质干细胞促进烫伤创面愈合的作用机制

目的探讨人脐带间充质干细胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,UCMSCs)多点局部注射后,修复烫伤皮肤创面的潜在机制。方法机械消化法分离人UCMSCs,培养至第3代后,进行形态观察、免疫表型和多向分化潜能鉴定。将第3代UCMSCs与碱性成纤维细胞因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)共培养14 d,免疫荧光法检测成纤维细胞标志物波形蛋白的表达;对比小鼠Ⅲ度烫伤模型多点局部注射UCMSCs后创面愈合率及创面愈合时间;Dil标记UCMSCs,局部注射后检测UCMSCs在创面局部的分布情况。结果分离培养的UCMSCs的形态、表面抗原表达及体外诱导分化能力均符合间充质干细胞特性;经b FGF诱导后可显著提高UCMSCs中成纤维细胞标志物波形蛋白的表达量;局部注射UCMSCs可显著提高烫伤小鼠的创面愈合率,UCMSCs可定植于烫伤创面下。结论 UCMSCs具有较强的成纤维样细胞分化能力,经局部注射后,可通过定植于烫伤创面而显著提高创面愈合率。     

一种分离培养人脐带Wharton's jelly间充质干细胞的新方法

目的探讨一种分离培养人脐带Wharton′s jelly间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)的新方法。方法取人脐带组织,除去动静脉后剪碎成2～5 mm3,将组织碎片浸入4 g/LⅠ型胶原酶和1 g/L透明质酸酶的混合液中,于37℃处理1 h,再用0.25%胰蛋白酶在相同条件下消化30 min,得到的消化液经70μm细胞滤网过滤后,制备单个细胞悬液,培养并传代。取P1、P3、P7代脐带Wharton′s jelly MSC,绘制细胞生长曲线;取P3代细胞,采用流式细胞术检测细胞表面标记分子,并分别采用成骨和成脂诱导培养基进行成骨及成脂诱导分化,茜素红染色和油红O染色观察结果。结果 P1、P3代脐带Wharton′s jelly MSC的增殖能力强,且P1代细胞的增殖能力强于P3代,P7代细胞的增殖能力较P3代细胞有所减弱。P3代脐带Wharton′s jelly MSC高表达CD90(99.8%)、CD105(100%)和CD166(100%),低表达CD45(0.3%)、CD14(0.1%)、CD34(0.2%)和CD79a(0.3%),不表达HLA-DR。P3代Wharton′s jellyMSC经成骨诱导后,茜素红染色可见红色结节;经成脂诱导后,油红O染色可见脂质沉积。结论本方法获得的Wharton′s jelly MSC活性好,增殖能力强,为后续实验研究及临床应用提供了理想的种子细胞。     

血小板裂解液大规模扩增人脐带间充质干细胞

目的用血小板裂解液(platelet lysate,PL)大规模扩增人脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cell,UCMSC),并检测其生物学特性,为临床应用提供实验依据。方法分别采用PL和胎牛血清(FBS)低密度扩增人UCMSC,比较两组UCMSC的细胞形态、大小、克隆形成率、增殖能力、细胞表型和分化能力。结果 PL扩增的UCMSC形态细长;直径明显小于FBS扩增的UCMSC(P<0.05);克隆形成率与FBS扩增的UCMSC差异无统计学意义(P>0.05);有更高的细胞累积群倍数;与FBS扩增的UCMSC有相似的细胞表型;与FBS扩增的UCMSC均具有成骨、成脂诱导分化能力,但PL扩增的UCMSC成骨分化能力更强。结论 PL可取代FBS用于大规模扩增UCMSC。     

人脐带华通氏胶间充质干细胞的生物学特性及其向肌源性细胞分化的能力

目的探讨人脐带华通氏胶间充质干细胞(human umbilical cord Wharton′s Jelly mesenchymal stem cells,hUCMSCs)的生物学特性及其向肌源性细胞分化的能力。方法收集健康足月产胎儿脐带组织,采用酶消化法从华通氏胶中分离hUCMSCs,选取第3代对数生长期细胞,显微镜观察细胞形态,流式细胞术检测细胞免疫表型分子的表达,免疫荧光染色检测干细胞标记物及其体外向肌源性细胞的分化,荧光显微镜观察及流式细胞术检测携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的慢病毒转染hUCMSCs后GFP的表达。结果采用酶消化法获得可贴壁生长的大量hUCMSCs,其能在体外成功进行扩增培养。hUCMSCs可高表达CD29、CD44、CD73、CD90和CD105,而极低表达CD14、CD34、CD45和HLA-Ⅱ;能表达干细胞标记物Oct4和Sox2,且在体外特殊培养条件下表达骨骼肌干细胞标记物Pax7和Myo D;转染的hUCMSCs可稳定表达GFP,转染率高达50%~70%。结论人脐带华通氏胶组织存在间充质干细胞,且其具有向肌源性细胞分化的潜能。     

人牙髓干细胞的无血清培养及其生物学特性

目的使用无血清培养基体外分离培养人牙髓干细胞(dental pulp stem cell,DPSC),并分析其生物学特性。方法分别用有血清培养体系(SCM:含10%胎牛血清的DMEM)和无血清培养体系(SFM:化学成分明确的、无动物源成分的市售培养基Mesen Cult-XF medium)培养人DPSC,倒置显微镜下观察细胞生长、增殖情况及形态特征。细胞传至5代后,检测两种培养基培养的细胞的增殖能力、免疫表型和分化能力。结果 SFM与SCM培养的细胞形态相似,但SFM培养的细胞外形显得纤细、细长,立体感更强;SFM与SCM培养的人DPSC有相似的增殖能力、细胞表型和分化能力,且SFM培养的人DPSC成骨和成软骨分化能力更强。结论本实验表明,SFM能够在体外培养扩增人DPSC,并维持其干细胞特性,包括自我更新能力(集落形成能力)和多向分化潜能,可取代FBS用于细胞治疗及生物医学研究。     

SF/COL/PLCL静电纺丝三维纳米纤维支架与人脐带血间充质干细胞的细胞相容性研究

目的研究SF/COL/PLCL静电纺丝三维纳米纤维支架与人脐带血(human umbilical cord blood,hUCB)间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的细胞相容性。方法分离、培养hUCBMSCs,并进行传代,取第3代hUCBMSCs,茜素红染色和Von Kossa染色检测其体外诱导成骨分化的能力;流式细胞术检测其表面相关抗原的表达。制备SF/COL/PLCL静电纺丝三维纳米纤维支架,扫描电镜观察其形貌表征,并检测其力学性能。将hUCBMSCs接种于静电纺丝三维纳米纤维支架上,观察细胞在支架上的生长及增殖情况。结果 hUCBMSCs具有成骨诱导分化能力,其表达CD44、CD29、CD90和CD105,不表达CD45和CD34。SF/COL/PLCL复合纳米纤维的纤维形貌良好,随着PLCL含量的增加,纤维的直径和力学性能均逐渐增加。hUCBMSCs能够在三维纳米纤维支架上很好地黏附,并相互连接向周围扩展,三维纳米纤维支架能很好地促进细胞黏附和增殖,与常规培养的细胞相比,差异有统计学意义(P0.05或P0.01),当SF/COL与PLCL的质量比为30∶70时,最有利于细胞的生长。结论 hUCBMSCs能够在SF/COL/PLCL静电纺丝纳米纤维支架上生长、增殖,这种支架材料具有良好的力学性能及细胞相容性,有望成为一种新型组织工程支架材料。     

人脐血干细胞在局灶性脑缺血大鼠体内的迁移与分化

目的观察人脐血干细胞(human umbilical cord blood stem cells,HUCBSCs)在局灶性脑缺血大鼠体内的迁移与分化,探讨HUCBSCs移植对缺血性脑损伤大鼠神经功能恢复可能的作用机制。方法采用线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注模型,将造模成功的20只大鼠随机分为2组:移植组15只,造模成功后24 h,经尾静脉移植1 ml(2×106个)DAPI/CM-Dil荧光染料标记的HUCBSCs;模型组5只,造模成功后24 h,经尾静脉移植等量生理盐水。分别于移植前及移植后3、7、15 d进行神经功能缺损评分(neurological severity score,NSS),并取脑组织,制备冰冻切片,HE染色观察脑组织形态,荧光显微镜观察HUCBSCs在脑组织中的迁移和分布,免疫荧光法检测脑组织中巢蛋白(Nestin)和神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)的表达。结果移植组大鼠HUCBSCs移植后7 d起,其改良的NSS(m NSS)显著低于对照组(P<0.05)。移植后15 d,大鼠脑组织病理改变明显减轻。移植后3 d起,可见病灶及其周围部位有阳性细胞存在,随着时间的推移,脑缺血病灶部位的阳性细胞增多;移植后7 d,迁移至病灶部位的细胞数增加;移植后15 d,迁移至病灶部位的细胞数量达观察期内的高峰,各时间点阳性细胞数差异有统计学意义(P<0.05)。移植后15 d,大鼠脑组织中CM-Di I/NSE-FITC和CM-Di I/Nestin-FITC双阳性细胞率分别为85.2%和81.6%。结论 HUCBSCs经静脉移植后,能在大鼠体内存活,并向损伤部位迁移,具有向神经元细胞方向分化的潜能,对脑缺血大鼠的神经功能恢复具有促进作用。     

Computational modeling of megakaryocytic differentiation of umbilical cord blood-derived stem/progenitor cells

Quantifying the effect of exogenous parameters regulating megakaryopoiesis would enhance the design of robust and efficient protocols to produce platelets. We developed a computational model based on time-dependent ordinary differential equations (ODEs) which decoupled expansion and differentiation kinetics of cells using a subpopulation dynamic model. The model described umbilical cord blood (UCB)-derived cell's behavior in response to the external stimuli during expansion and megakaryocytic differentiation ex vivo. We observed that the rate of expansion of Mk progenitors and production of mature Mks were higher when TPO was included in the expansion stage and cytokines were added during differentiation stage. Our computational approach suggests that the Mk progenitors were an important intermediate population that their dynamic should be optimized in order to establish an efficient protocol. This model provides important insights into dynamics of cell subpopulations during megakaryopoiesis process and could potentially contribute toward the rational design of cell-based therapy bioprocesses.     

Mixing theory for culture and harvest in bioreactors of human mesenchymal stem cells on microcarriers

The use of human mesenchymal stem cells (hMSCs) in regenerative medicine is a potential major advance for the treatment of many medical conditions, especially with the use of allogeneic therapies where the cells from a single donor can be used to treat ailments in many patients. Such cells must be grown attached to surfaces and for large scale production, it is shown that stirred bioreactors containing ~200 μm particles (microcarriers) can provide such a surface. It is also shown that the just suspended condition, agitator speed N _JS, provides a satisfactory condition for cell growth by minimizing the specific energy dissipation rate, ε_T, in the bioreactor whilst still meeting the oxygen demand of the cells. For the cells to be used for therapeutic purposes, they must be detached from the microcarriers before being cryopreserved. A strategy based on a short period (~7 min) of very high ε_T, based on theories of secondary nucleation, is effective at removing >99% cells. Once removed, the cells are smaller than the Kolmogorov scale of turbulence and hence not damaged. This approach is shown to be successful for culture and detachment in 4 types of stirred bioreactors from 15 mL to 5 L.