复合型阴离子交换层析填料Capto adhere纯化工艺的优化

目的优化复合型阴离子交换层析填料Capto adhere的纯化工艺,并进行验证。方法利用中心复合设计(central composite design,CCD)法对影响复合阴离子交换层析的3个因素(上样液pH值、上样液电导率值、上样量)进行优化,拟合出响应曲面,找出最优参数范围。将优化的Capto adhere层析工艺与亲和层析相结合,纯化CHO细胞表达的IgG1单抗培养液,验证工艺参数的稳定性。结果优化的Capto adhere层析工艺为:上样液pH值6.9,上样液电导值率6.3 mS/cm,上样量300 mg/ml gel;CHO细胞表达的IgG1单抗培养液先经蛋白A亲和层析柱初步纯化,再经优化的Capto adhere层析工艺进一步纯化后,样品纯度达98.9%,蛋白A残留量为0.000 52%,宿主细胞蛋白残留量为0.015%,与预测值比较,结果偏差小于10%,且均符合质控标准,两步层析总收率达86.7%。结论优化了复合型阴离子交换层析填料Capto adhere的纯化工艺,利用亲和层析与Capto adhere复合阴离子交换层析两步法纯化单抗是有效、简便、可行的。     

精制马抗H5N1禽流感病毒免疫球蛋白疏水层析方法的优化

目的对精制马抗H5N1禽流感病毒免疫球蛋白疏水层析方法进行优化。方法将胃蛋白酶直接加入制备好的高效价马抗H5N1禽流感病毒血清进行消化裂解,再加入饱和度为26%的硫酸铵溶液,盐析沉淀离心一次后,直接进行疏水层析进一步纯化F(ab′)2抗体。结果连续洗脱依次出现6个蛋白峰,50min左右,洗脱峰3开始出现,其中含大部分F(ab′)2抗体,此时硫酸铵摩尔浓度约为1.0～1.1mol/L。阶段梯度洗脱,当硫酸铵摩尔浓度降至1.0mol/L时,大量F(ab′)2片段被洗脱下来,纯度达90%以上。结论优化了精制马抗H5N1禽流感病毒免疫球蛋白的疏水层析方法,降低了硫酸铵用量,减少了离心次数,生产周期也大大缩短。     

肠道病毒71型多克隆抗体F(ab’)2片段的制备及其体外中和效果评价

目的制备肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)多克隆抗体F(ab’)2片段,并评价其体外中和效果。方法采用硫酸铵分级沉淀法从EV71感染的兔血清中提取Ig G,用胃蛋白酶进行酶解,正交试验确定最佳酶解条件;使用阴离子交换层析(Q Sepharose Fast Flow)纯化得到F(ab’)2片段,采用体外中和试验检测其对EV71的中和效果。结果硫酸铵分级沉淀法得到电泳纯的Ig G;最佳酶解条件为:胃蛋白酶与Ig G按1∶10的质量比混合,47℃反应4 h,在此条件下,F(ab’)2的产率最大值为79.51%,且方差分析表明,酶切比例对F(ab’)2产率的影响最大,温度次之,时间对F(ab’)2产率的影响不明显;经阴离子交换层析纯化,可有效去除Fc片段,得到电泳纯的F(ab’)2;F(ab’)2具有与Ig G、正常血清同等的中和效果。结论成功制备了EV71兔多克隆抗体F(ab’)2片段,初步确定该F(ab’)2片段具有良好的体外中和效果。     

A、B、E、F型肉毒抗毒素的制备与检定

目的　制备马抗肉毒 (Botulinum)A、B、E、F型抗毒素。方法　菌种经过复苏分离与检定后 ,采用产毒培养、酸沉、盐析及脱毒等步骤 ,制备肉毒A、B、E、F四型类毒素 (Toxoid)和试验毒素 (Testtoxin) ,免疫健康马匹。结果　各型血浆效价均超过 2 0 0 0年版《中国生物制品规程》中对于抗毒素的要求 ,B型与F型的效价均超过 2倍以上 ,A型与E型也达到较好的应答水平。结论　已成功制备四型肉毒抗毒素。     

层析技术制备马抗中东呼吸综合征冠状病毒F(ab’)_2

目的采用层析技术制备高纯度的马抗中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrom coronavirus,MERS-CoV)F(ab’)_2。方法以MERS-CoV病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)对马匹进行多次免疫所制备的高免血清为原料,采用亲和层析技术提取血清IgG,经胃蛋白酶酶切后,通过阴离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析分别对F(ab’)_2进行纯化;以MERS假病毒检测所制备的IgG与F(ab’)_2中和活性。结果凝胶过滤层析实现了F(ab’)_2的高纯度分离,最终制备的F(ab’)_2收率约70%,纯度为93%以上,具有良好的中和活性,其半数抑制浓度(IC_(50))为5.13μg/ml。结论制备了高纯度马抗MERS-CoV免疫球蛋白F(ab’)_2,为人用抗MERS-CoV免疫球蛋白F(ab’)_2生产工艺的建立奠定了基础。     

B型肉毒神经毒素的纯化及胰蛋白酶对其作用分析

目的纯化B型肉毒神经毒素,并比较未激活和用胰蛋白酶激活的B型肉毒神经毒素的分子特性,分析在酸性和碱性条件下B型肉毒毒素复合物的完整性。方法取未激活、胰蛋白酶激活和热处理激活的B型肉毒毒素复合物,采用阴离子交换柱层析纯化神经毒素(分别为A、B和C组)。在酸性条件下溶解激活的B型肉毒毒素复合物(D组)。对各组进行纯度(特异毒性)测定和SDS-PAGE分析。结果柱层析后,神经毒素纯度均比复合物的纯度高,激活的神经毒素比未激活的高2～3倍;在非还原和还原条件下,A组的SDS-PAGE显示神经毒素、重链和轻链3条带;B组显示重链和轻链2条带;C组在非还原条件下显示重链和轻链2条带,在还原条件下只显示轻链1条带。在酸性条件下,B型肉毒毒素复合物由神经毒素与非毒性成分构成,在碱性条件下,神经毒素与非毒性成分分离。结论已成功纯化了B型肉毒神经毒素,经胰蛋白酶处理后,单链裂解为双链,比活性提高。     

用于肉毒毒素活性测定的特异性绿色荧光融合蛋白的制备

目的制备含有7种血清型肉毒毒素切割位点(SNAP25-VAMP)的特异性绿色荧光融合蛋白,在E.coli中诱导表达,纯化后用于肉毒毒素活性测定。方法根据SNARE蛋白复合物中SNAPE25和VAMP基因序列及各血清型肉毒毒素(Bo NTs)的切割位点,设计合成含有SNAREs中突触小体(SNAP25)和突触小泡膜蛋白(VAMP)的Bam HⅠ-HIS6-SNAP62-Eco RⅠ-VAMP57C-TAA-HindⅢ(以下简称为SV)基因,连接至p ET-28a-GFP载体上,构建重组质粒p ET-28a-GFP-SV,转化感受态E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达后,经DEAE阴离子交换层析、Cu2+金属螯合层析、Q阴离子交换层析3步纯化,BCA法测定纯化产物的蛋白浓度,ELISA法检测B型肉毒毒素轻链蛋白(Bo NT/BL)活性。结果构建的质粒p ET-28a-GFP-SV经双酶切及测序鉴定证明构建正确,表达的GFP-SV融合蛋白相对分子量约40 000,主要以可溶形式存在,蛋白浓度为18.4μg/μl,纯度可达70%以上。利用该融合蛋白的荧光强弱变化可测定Bo NT/BL活性大小,同时也可测定其抗体中和活性大小。结论制备的含有SV的特异性绿色荧光融合蛋白在E.coli中获得了高效表达,为后续各型肉毒毒素活性检测及抗体中和毒素活性检测奠定了基础。     

马抗破伤风毒素免疫球蛋白F(ab′)_2新制备工艺的建立

目的建立马抗破伤风毒素免疫球蛋白F(ab′)2新的制备工艺。方法制备并纯化破伤风类毒素(Tetanustoxoid,TT)及重组破伤风毒素c片段(Recombinant tetanus toxin C fragment,rTT-C),将TT/rTT-C(2∶1)免疫马匹,待血清抗体效价达3 500 IU/ml时,采血,分离血清,灭活,去除外源蛋白,胃蛋白酶消化制备F(ab′)2,经DEAE柱层析纯化,并对其进行中和抗体效力、安全性和稳定性检测。结果纯化的TT和rTT-C的浓度分别为70 000 Lf/L和4～5 mg/L,纯度分别达95%以上和96%以上;纯化的TAT-F(ab′)2收率为1.4%,纯度达91%以上,中和抗体效价>15 000 IU/ml;其安全性及稳定性均符合《中国药典》三部(2005版)要求,有效期暂定为18个月。结论建立了马抗破伤风毒素免疫球蛋白F(ab′)2新的制备工艺,制备的制品达到甚至超过了国外的质量标准,为马抗血清同类制品的升级换代提供了技术支持。     

胃酶消化马血浆工艺参数的优化

目的应用DOE试验优化破伤风抗毒素(tetanus antitoxin,TAT)生产中胃酶消化马血浆过程的工艺参数。方法以破伤风类毒素免疫后的马血浆为原料,通过AKTA avant25中UNICORN 6.0软件设计4因子2水平全因子DOE试验模型,并以抗体F(ab′)2含量为评价指标,对影响胃酶消化的主要因子即胃酶加量、消化反应pH值、反应温度和反应时间进行优化。结果胃酶消化马血浆的最适工艺参数为:胃酶加量为13~15 U/ml,消化反应pH值为3.0~3.1,反应温度为35~37℃,反应时间为90~120 min,在该条件下进行6次稳定性试验,制备的TAT抗体F(ab′)2含量平均值达83.1%,标准偏差为2.47%。结论 DOE试验优化了TAT生产中胃酶消化马血浆过程的工艺参数,建立了有效的消化工艺,为降低过敏反应,提高TAT制品的质量提供了实验依据。     

长效重组人生长激素-Fc融合蛋白纯化工艺的建立

目的建立长效重组人生长激素-Fc(recombiant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白的纯化工艺。方法 rhGH-Fc融合蛋白细胞培养液经离心、低pH处理、过滤、浓缩预处理后,再经Protein-A亲和层析、CM阳离子交换层析、Q HP阴离子交换层析进行纯化,同时检测rhGH-Fc融合蛋白的蛋白含量、纯度、等电点及宿主蛋白、宿主DNA、Protein-A残留量等指标。结果 Protein-A亲和层析、CM阳离子交换层析、Q HP阴离子交换层析纯化产物的蛋白含量分别为145、132、92.4 mg,纯度分别为95. 40%、95. 90%和99. 19%,宿主蛋白残留量分别为2 500、864和71 ng/mg,宿主DNA残留量分别为329、0. 56和0. 12 ng/mg,Protein-A残留量分别为24. 5、3. 2和0 ng/mg。rhGH-Fc融合蛋白相对分子质量约97 300,等电点范围为5. 5~6. 5,可与鼠抗人生长激素(human growth hormone,hGH)抗体发生特异性结合。结论成功建立了rhGH-Fc融合蛋白的纯化工艺,该工艺的纯化产物回收率及纯度均较高,本实验为rhGH-Fc融合蛋白的大规模生产奠定了理论基础。