猪LGALS1基因的原核表达及序列分析

目的原核表达猪源LGALS1并进行序列分析。方法提取猪肺泡巨噬细胞总RNA,RT-PCR法扩增LGALS1的cDNA序列,与pMD18-T载体连接,构建重组克隆质粒pMD18-T-LGALS1并测序,应用生物分析软件对基因序列进行同源性比对及系统进化树分析;将构建正确的质粒pMD18-T-LGALS1亚克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组表达质粒pET-30a-LGALS1,转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达、Ni2+亲和层析纯化后,进行Western blot分析。结果 PCR扩增获得了全长为408 bp的cDNA序列,与GenBank中登录的LGALS1编码区序列(NM_001001867. 1)相似性达99%,核苷酸序列同源性分析表明,克隆基因序列与猪源LGALS1同源性最高;质粒pET-30a-LGALS1经PCR及双酶切鉴定证明构建正确;表达的LGALS1相对分子质量约21 000,经纯化后,可与LGALS1 Antibody发生反应,具有反应原性。结论成功表达了猪源LGALS1。     

单增李斯特菌溶血素O的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化单增李斯特菌溶血素O(Listeriolysin O,LLO)。方法 PCR扩增LLO hly基因,并插入pET-32a载体,构建重组表达质粒pET-hly,转化入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,切胶纯化重组蛋白,并进行Westernblot分析。结果克隆的hly基因长1 515 bp,与GenBank中登录的hly基因的核苷酸序列同源性为99%;重组表达质粒pET-hly经酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为55 000,表达量占细菌总蛋白的45.2%;纯化的重组蛋白可与单增李斯特菌阳性血清反应。结论已成功原核表达并纯化了LLO,为下一步诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的原核表达及活性鉴定

目的克隆大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(ltB)基因,构建其原核表达质粒,并对表达产物进行活性鉴定。方法采用PCR技术从产毒大肠杆菌129株基因组DNA中扩增ltB基因,克隆入载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET-32a(+)-ltB,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,Ni2+-NTA树脂层析柱进行纯化,纯化产物采用ELISA法鉴定其与牛GM1的结合活性。结果重组表达质粒经菌落PCR鉴定证明构建正确,所克隆的ItB基因与GenBank中报道的相应核苷酸序列的同源性为99.9%。重组菌诱导4h,目的蛋白表达量最高,约占菌体总蛋白的25%。纯化的重组LTB蛋白纯度约为96%,具有与牛GM1特异性结合的生物学活性。结论已成功克隆了ltB基因,并构建了其原核表达质粒,表达的重组蛋白具有一定的生物学活性。     

B型肉毒毒素轻链蛋白的原核表达及纯化

目的克隆B型肉毒毒素轻链Bont-B基因,使其在大肠杆菌内表达,并对表达的重组蛋白进行纯化。方法设计并人工合成Bont-B基因,克隆入表达载体pMD19-T中,构建质粒pMD19-T-Bont-B,经酶切后与pET-28a载体连接,构建重组表达质粒pET-28a-Bont-B,将重组表达质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot分析后,经金属螯合层析Cu2+柱进行纯化,纯化产物经SDS-PAGE分析纯度。结果重组表达质粒pET-28a-Bont-B经PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约50 000,主要以可溶性形式表达,表达量约占菌体总蛋白的6%;纯化后的重组蛋白纯度可达90%以上。结论已成功克隆并在大肠杆菌BL21(DE3)中原核表达了Bont-B轻链基因,为制备抗Bont-B轻链单克隆抗体及研究肉毒中毒机制和治疗奠定了基础。     

牛Ⅱ型链球菌van B2蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化牛Ⅱ型链球菌(Streptococcus bovis biotypeⅡ)van B2蛋白。方法采用PCR法从牛Ⅱ型链球菌基因组DNA中扩增van B2基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-van B2,转化大肠杆菌Rossata(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经Ni柱亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE及Westernblot分析。结果 PCR扩增获得597 bp的van B2基因片段;重组表达质粒pET-28a-van B2经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组van B2蛋白相对分子质量约为29 000,主要以可溶性形式表达;纯化的重组蛋白纯度为70%,可被小鼠抗牛链球菌血清Ⅱ型多克隆抗体特异性识别。结论原核表达并纯化了牛Ⅱ型链球菌van B2蛋白,为van B2基因的耐药性研究奠定了物质基础。     

幽门螺杆菌粘附素基因hpaA的克隆、表达及鉴定

目的　克隆幽门螺杆菌粘附素基因hpaA ,构建其原核表达系统并鉴定融合蛋白免疫原性。方法　采用PCR技术从幽门螺杆菌总DNA中扩增hpaA基因 ,T -A克隆后测定核苷酸序列 ,构建pET30a的HpaA表达载体 ,在E .coliBL2 1DE3宿主菌中用IPTG诱导表达 ,Ni2 + 柱纯化后经Westernblot鉴定其免疫原性。结果　所克隆的hpaA基因与报道的相应核苷酸序列同源性为 94 . 8%～ 97. 3% ,氨基酸序列同源性为 94 . 6 %～ 97 .7% ,在 134～ 139位存在一段KRTIQK结构 ,HpaA融合蛋白在pET30a载体中可高效表达 ,经纯化后可获得高纯度的重组蛋白。结论　成功构建HpaA原核表达系统 ,所表达的融合蛋白具有较好的免疫原性 ,可作为Hp疫苗的候选抗原。     

牛布鲁菌L7/L12蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化牛布鲁菌L7/L12蛋白。方法提取牛布鲁菌S19基因组DNA,PCR法扩增L7/L12基因,经测序正确后,克隆至pET-28a(+)载体,构建重组原核表达质粒pET-L7/L12,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析目的蛋白的表达形式及表达量,经亲和层析纯化后,Western blot鉴定纯化产物。结果所构建的重组原核表达质粒pET-L7/L12经酶切鉴定表明构建正确。重组蛋白以包涵体形式表达,表达量占全菌总蛋白的33%;纯化的重组蛋白纯度可达94%,可与布鲁菌小鼠免疫血清发生特异反应。结论已成功表达并纯化了牛布鲁菌L7/L12蛋白,为建立高特异性的新型布鲁菌检测方法奠定了基础。     

人GnRH及其转运肽基因合成及鉴定

目的人工合成人GnRH及转运肽(TRS)基因。方法根据已发表的人GnRH基因mRNA序列以及转运肽(9个左旋精氨酸)基因核苷酸序列,设计一对核苷酸,再用含7mol/L尿素的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化,然后以这对核苷酸3′末端短互补序列退火、补齐,合成长达90bp的目的序列GnRH/TRS。将其亚克隆到pMD18T载体上,构建重组质粒pYC1。酶切鉴定筛选出阳性克隆pYC1,并测序。结果GnRH/TRS序列由90个核苷酸组成,扩增产物与原设计序列同源性达100%。结论已成功合成人GnRH/TRS基因,为进一步研究和应用奠定基础。     

牛病毒性腹泻病毒E0和E2蛋白的融合表达及纯化

目的在大肠埃希菌中融合表达牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)E0和E2基因,并进行纯化。方法采用RT-PCR法分别扩增BVDV BA株的E0和E2基因片段,通过酶切位点将二者串联并克隆至原核表达载体pET-28a上,构建重组表达质粒pET-28a-E0-E2,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的融合蛋白E0-E2经镍离子亲和层析纯化后,进行Western blot分析。结果重组表达质粒pET-28a-E0-E2经双酶切和测序证明构建正确;表达的融合蛋白E0-E2相对分子质量约为68 500,表达量约占菌体总蛋白的20%,主要以包涵体形式存在;纯化的融合蛋白纯度达95%,可与牛病毒性腹泻病毒阳性血清发生特异性反应。结论在大肠埃希菌中融合表达了BVDV E0和E2蛋白,纯化后的融合蛋白纯度较高,为BVDV抗体ELISA检测方法的建立及新型疫苗的研制奠定了基础。     

多聚精氨酸蛋白转导域-凋亡素融合蛋白的原核表达及其生物活性

目的原核表达多聚精氨酸蛋白转导域-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性。方法应用PCR法扩增Arg9-VP3序列,与载体pET-43.1a连接后,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni2+-NTA纯化后,进行肠激酶裂解、超滤浓缩,并检测其生物活性。结果重组表达质粒pET-43.1a-Arg9-VP3经酶切鉴定和序列分析,证明构建正确。转化E.coliBL21(DE3)后,重组蛋白获得可溶性表达。纯化的融合蛋白纯度达90%以上,可抑制HeLa细胞增殖。结论已成功地在大肠杆菌中表达了多聚精氨酸蛋白转导域-凋亡素融合蛋白,纯化的融合蛋白具有诱导HeLa细胞凋亡的能力。     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

根据GenBank报道的黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因序列设计两对特异性引物,分别以黑曲霉H7总RNA及基因组DNA为模板,扩增出β-葡萄糖苷酶基因bgl全长及活性中心所在的外显子5序列E5,分别将其连接到pMD18-T载体并转化到大肠杆菌DH5α测序。结果表明,bgl序列全长2583 bp,与β-葡萄糖苷酶基因(XM001398779.1)核苷酸序列同源性为99%,氨基酸序列同源性为99%,E5与bgl外显子5区域同源性为100%。进一步构建表达质粒pET32a(+)-bgl、pET32a(+)-E5、pET28a(+)-E5,转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,并进行SDS-PAGE电泳分析。     

牛乳溶菌酶的原核表达及初步纯化

目的原核表达并初步纯化牛乳溶菌酶(Bos taurus lysozyme1,LYZ1)。方法人工设计并合成LYZ1基因CDS序列,将其克隆至表达载体pET-32a,构建重组表达质粒pET-32a-LYZ1,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性菌株,经IPTG诱导,初步纯化表达产物,并对其进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果所构建的重组表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定正确;SDS-PAGE分析显示,目的蛋白相对分子质量约为32000,主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的70%以上,切胶纯化后纯度达95%;Western blot分析显示,重组融合蛋白可与小鼠Anti-HisTag单抗特异结合。结论已成功原核表达并初步纯化了LYZ1,为后续研究与应用奠定了基础。     

人3型副流感病毒HN基因的克隆、表达及其免疫原性

目的克隆人3型副流感病毒(HPIV-3)HN基因,构建原核表达质粒,并检测表达蛋白的免疫原性。方法从呼吸道感染患儿呼吸道分泌物中提取HPIV-3RNA,用套式RT-PCR扩增HN基因,克隆至pGEM-T载体上,进行核苷酸序列分析,并用生物信息软件分析HN蛋白的二级结构,构建截短的HN基因原核表达载体pET-28a-HN,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达蛋白经SDS-PAGE和Western blot检测后,进行纯化和复性。并以此蛋白免疫昆明小鼠,检测小鼠血清中HN抗体效价。结果扩增出的HPIV-3的HN基因核苷酸序列与参考序列的同源性为95%,氨基酸序列同源性为97%,有16处发生了突变。截短的HN基因的原核表达载体经酶切鉴定及测序,证明构建正确。重组HN蛋白的表达量占菌体总蛋白的30%以上,且具有良好的反应原性。复性的重组HN蛋白免疫的小鼠可产生高效价的抗HN抗体。结论原核表达的截短的HN蛋白具有良好的免疫原性,能够刺激小鼠产生较高水平的抗体应答。     

微小隐孢子虫gp40基因的克隆与核苷酸序列分析

目的 获取微小隐孢子虫侵入蛋白40基因(gp40),并将其克隆到 pMD18-T载体中进行核苷酸序列分析。方法 应用PCR技术,从牛源微小隐孢子虫基因组中扩增出 975bp的gp40基因,然后将其克隆到 pMD18-T载体中,用Sanger’s双脱氧法对重组质粒中的插入片段进行序列分析。结果 测得的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与Cenbank公布的序列核苷酸同源性为98％,氨基酸同源性为98％。结论 获得了序列正确的gp40基因,为其相关研究奠定了基础。     

人β-NGF蛋白的原核表达、纯化及其生物活性

目的在大肠杆菌中表达人神经生长因子β(β-NGF)蛋白,并进行纯化及生物活性检测。方法以人外周血基因组DNA为模板,PCR扩增人β-NGF基因片段,克隆并测序后,与表达载体pET-28a(+)连接,构建重组表达质粒pET-28a-β-NGF,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。采用分子筛层析法对表达产物进行纯化,复性后用鸡胚背根神经节培养试验检测其生物活性。结果酶切和测序证实,PCR扩增的人β-NGF基因片段为β-NGF成熟肽编码序列;重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的23.5%,主要以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度达90%以上,表达量为4.8mg/L菌液,且可明显促进鸡胚背根神经节神经突起生长。结论已在大肠杆菌中成功表达了人β-NGF蛋白,纯化后的重组蛋白具有良好的生物活性。     

b型流感嗜血杆菌D蛋白的原核表达及纯化

目的克隆b型流感嗜血杆菌(Haemophlilus influenza type b,Hib)D蛋白(hpd)基因,原核表达并纯化重组hpd蛋白,为下一步开发以D蛋白为基础的结合疫苗奠定基础。方法从Hib CMCC株基因组DNA中PCR扩增hpd基因片段,克隆入载体pET-30a(+),构建重组原核表达质粒pET-30a-hpd,转化入感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经6 mol/L尿素变性、DEAE阴离子交换柱纯化、透析复性后,采用Western blot法鉴定其反应原性。结果重组表达质粒pET-30a-hpd经PCR及测序证明构建正确;表达的重组蛋白以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的40%;经一步过柱纯化可得到纯度达95%左右的重组蛋白;纯化的重组蛋白可与Hib免疫小鼠制备的抗血清发生特异性反应。结论已成功克隆了Hib hpd基因,并在大肠杆菌中表达了重组hpd蛋白,为下一步开发以D蛋白为基础的结合疫苗奠定了基础。     

幽门螺杆菌黏附素A的原核表达、纯化及其结晶条件搜索

目的原核表达、纯化幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)黏附素A(H.pylori adhesin A,HpaA),并初步搜索其结晶条件。方法采用TMHMM和SignalP-4.1软件预测HpaA蛋白中的跨膜序列和信号肽序列,根据GenBank中登录的编码HpaA的基因序列hp0797去掉预测出的信号肽序列后设计引物,以H.pylori标准株26695基因组为模板,PCR扩增编码HpaA的基因序列,插入原核表达载体pET-22b,构建重组表达质粒pET-22b-HpaA,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),IPTG 25℃诱导表达,表达的重组蛋白经亲和层析、阴离子交换层析和分子筛层析进行纯化。将纯化产物浓缩至10 mg/ml,采用结晶搜索试剂盒,通过悬滴汽相扩散法搜索HpaA的结晶条件,并在此基础上配制条件进行优化。结果去掉序列中编码信号肽区域或跨膜结构域的密码子,选择HpaA的36~260位氨基酸进行克隆,构建的重组原核表达质粒pET-22b-HpaA经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;表达的重组蛋白HpaA相对分子质量约27 000,表达量约占菌体总蛋白的10%以上,主要以可溶形式表达,纯化后的纯度可达99%以上。在多种条件下,均有结晶生长,晶体多为薄片状、针状或簇状,在20%PEG3350,0.1 mol/L HEPES(pH 7.0)条件下,晶体形状类似长方体,外形有所改善。结论成功表达了HpaA蛋白,初步掌握其结晶条件,为下一步晶体结构学的研究及其在H.pylori感染与致病中的作用机制奠定了基础。     

弱化二氢叶酸还原酶基因增进人神经生长因子β亚基在CHO细胞中的表达

目的通过弱化二氢叶酸还原酶基因(Dihydrofolate reductase,DHFR)增进人神经生长因子β亚基(β-Humannerve growth factor,β-hNGF)在CHO细胞中的表达。方法从质粒pUC18-β-NGF中扩增β-NGF基因,克隆至pMD18-T载体,构建克隆质粒β-hNGF/pMD18-T;经人工合成弱化SV40启动子与DHFR基因顺式表达元件,并插入pBudCE4.1质粒,构建质粒w-DHFR/pBudCE4.1;分别双酶切质粒β-hNGF/pMD18-T和w-DHFR/pBudCE4.1后连接,转化大肠杆菌Top10’,构建重组表达质粒β-hNGF/w-DHFR/pBudCE4.1,转染CHO-DHFR-后,筛选阳性细胞克隆,ELISA法检测阳性CHO细胞株表达β-NGF的水平,鸡背根神经节增殖法检测重组β-NGF的生物学活性。结果重组表达质粒β-hNGF/w-DHFR/pBudCE4.1经酶切和测序证明构建正确;共获得5株表达β-hNGF的CHO细胞株,且表达的β-NGF能使神经节出现明显的神经纤维,表达量为0.1μg/μl。结论通过弱化SV40启动子和DHFR基因,在CHO细胞中成功表达了β-hNGF基因,表达量增加且具有生物学活性。     

猪干扰素γ的原核表达及抗血清的制备

目的原核表达猪干扰素γ(poIFNγ),并制备其抗血清。方法PCR扩增poIFNγ成熟多肽基因片段,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-poIFNγ,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的蛋白纯化后免疫小鼠,制备抗血清,ELISA检测抗血清的效价。结果重组原核表达质粒pET-28a-poIFNγ经双酶切和测序证明构建正确;重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的40%,主要以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白纯度可达90%;制备的抗血清效价可达10-5。结论已成功地在大肠杆菌中表达了poIFNγ,并制备了较高效价的抗血清。     

绿色微囊藻抗HIV凝集素MVL蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化绿色微囊藻抗HIV凝集素MVL蛋白,为进一步研究其生物学活性及其应用奠定基础。方法以绿色微囊藻Microcystis viridis NIES-103基因组DNA为模板,PCR扩增MVL基因阅读框序列,并克隆至pET-30b(+)载体中,构建重组表达质粒pET-30b-MVL,经PCR、测序鉴定后,转化感受态E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的蛋白采用Ni-NTA亲和柱层析纯化及复性。结果重组表达质粒pET-30b-MVL序列完整,插入的基因片段全长345bp,与GenBank中公布的MVL基因序列一致。重组菌的最佳诱导表达条件为:诱导起始浓度A600=0.5左右,IPTG浓度0.5mmol/L,诱导温度37℃,诱导时间4h,诱导培养基采用LB。以此条件诱导,在相对分子质量约20000处可见目的蛋白表达条带,表达量可占菌体总蛋白的47%,且表达蛋白主要以可溶性形式存在。纯化的重组蛋白纯度达95%以上,质谱鉴定为甘露糖结合凝集素。结论已成功地原核表达并纯化了绿色微囊藻抗HIV凝集素MVL蛋白。