保健食品中3种病原菌多重PCR快速检测方法的建立及验证

目的建立快速检测保健食品中沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR(multiplex PCR,m PCR)方法,并进行验证及初步应用。方法以提取的各菌株基因组DNA为模板,利用Gen Bank中登录的沙门菌inv A、志贺菌ipa H、金黄色葡萄球菌nuc基因序列设计引物,采用优化后的反应体系及确定的反应条件进行PCR扩增,扩增产物经3%琼脂糖凝胶电泳鉴定,对建立的方法进行特异性、敏感性、重复性验证。将沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌等量混合后,进行10倍系列稀释,加至10批无病原菌蛋白质粉和10批无病原菌减肥茶样品匀浆中,用建立的方法进行PCR扩增,并与GB常规生化检测结果进行比较。结果确定m PCR反应体系为:10×PCR buffer 2.0μl,d NTPs 2.5μl,Taq DNA酶0.6μl,上下游引物各1.5μl,Mg2+1.0μl,补加dd H2O至25μl。10株细菌中,沙门菌、2株志贺菌、金黄色葡萄球菌扩增结果为阳性,其他菌株为阴性,inv A、ipa H、nuc基因扩增片段与Gen Bank登录的序列同源性分别为99%、99%和100%;沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌菌株均能在101~105 CFU/ml浓度时扩增出特异性目的条带;5个浓度混合菌液扩增产物均可见特异性反应条带。该方法扩增出10批人工添加细菌蛋白质粉和10批人工添加细菌减肥茶中沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌的特异性基因片段,检出限均为102 CFU/ml,与GB常规生化检测结果一致。结论建立的保健食品中沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌m PCR检测方法特异性强,灵敏度高,重复性好,可满足不同检验机构快速、准确检测保健食品中多种病原微生物样品的实际需要。     

评估CHROMagar金黄色葡萄球菌显色培养基在化妆品检验中的应用效果

目的评估CHROMagar Staph.aureus（CSA）金葡菌显色平板和血琼脂平板（BA）用于化妆品金黄色葡萄球菌的检测效果。方法使用47株珠菌菌株在CSA和BA上作典型菌落生长测试和比较CSA和血浆凝固酶反应在鉴定金黄色葡萄球菌中的敏感性和特异性。应用CSA和BA分别检测58件不同类型的化妆品样品。结果CSA和BA对所有金黄色葡萄球菌的菌株均为单一的特征性菌落生长，也有少数凝固酶阴性葡萄球菌表现有假阳性菌落特征；CSA和血浆凝固酶鉴定金黄色葡萄球菌的敏感性和特异性均为100%；CSA和BA在样品中分别检测出7株和1株金黄色葡萄球菌（x^2=4.83,P〈0.05），总阳性率为12.07%。结论CSA在分离实际样品过程中的筛选效率和敏感性均高于BA，且节省了鉴定菌株所用的时间和费用，建议将CSA作为检测、鉴定化妆品中金黄色葡萄球菌的常规培养基应用。     

评估CHROMagar~金黄色葡萄球菌显色培养基在化妆品检验中的应用效果

目的评估CHRO Magar Staph.aureus(CSA)金葡菌显色平板和血琼脂平板(BA)用于化妆品金黄色葡萄球菌的检测效果。方法使用47株球菌菌株在CSA和BA上作典型菌落生长测试和比较CSA和血浆凝固酶反应在鉴定金黄色葡萄球菌中的敏感性和特异性;应用CSA和BA分别检测58件不同类型的化妆品样品。结果CSA和BA对所有金黄色葡萄球菌的菌株均为单一的特征性菌落生长,也有少数凝固酶阴性葡萄球菌表现有假阳性菌落特征;CSA和血浆凝固酶鉴定金黄色葡萄球菌的敏感性和特异性均为100%;CSA和BA在样品中分别检测出7株和1株金黄色葡萄球菌(X2=4.83,P<0.025),总阳性率为12.07%。结论CSA在分离实际样品过程中的筛选效率和敏感性均高于BA,且节省了鉴定菌株所用的时间和费用,建议将CSA作为检测、鉴定化妆品中金黄色葡萄球菌的常规培养基应用。     

C基因型牛副流感3型病毒分离株全基因组测序及分析

目的对宁夏地区分离得到的1株C基因型牛副流感3型病毒(bovine parainfluenza 3 virus,BPIV3)进行全基因组测序,并进行同源性及进化树分析。方法参考Gen Bank上登录的BPIV3中国分离株SD0835基因组序列设计5对引物,覆盖病毒基因组全长,提取BPIV3总RNA,以其为模板,进行RT-PCR扩增,扩增产物与p MD誖18-T Vector连接,连接产物转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞,将阳性克隆进行核苷酸测序,测序结果通过分子生物学软件进行拼接,并与Gen Bank上登录的参考序列进行比较,构建系统进化树。结果成功分离得到1株BPIV3,命名为NX49,NX49株全基因组核酸序列为15 474 nt,提交至Gen Bank的序列号为KT071671。NX49与中国山东C型分离株SD0835的同源性最高,为99.3%;与中国内蒙古A型分离株NM09的同源性为82.5%;与澳大利亚B型分离株Q5592的同源性为81.4%。结论 NX49与SD0835同属一个进化分枝,但由于地域及时间上的不同,可能造成它们之间在基因水平上存在差异。     

金黄色葡萄球菌α-毒素重组蛋白的免疫原性及其免疫保护性评价

目的评价金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)无毒性α-毒素(alpha toxin,AT)重组蛋白的免疫原性及其在金葡菌49521(CP5型)和49525(CP8型)菌株中的免疫保护作用。方法根据NCBI中hla基因参考序列(NC_007795.1),人工合成无毒突变hla H35L基因(即mhla基因)序列,克隆至pET-28a(+)载体中,构建重组质粒pET-28a-mhla,转化至E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达产物进行Ni柱亲和层析纯化,SDS-PAGE分析目的蛋白(mAT)的可溶性。用重组蛋白mAT+氢氧化铝佐剂(试验组)和氢氧化铝佐剂(对照组)分别于0、14、28 d经腹部皮下免疫BALB/c小鼠,攻毒前1 d小鼠眼眶采血,检测血清中IgG抗体及其亚型IgG1、IgG2a、IgG2b抗体水平;末次免疫10 d后,分别用致死剂量49521(6.0×108 CFU/只)及49525(3.0×109 CFU/只)菌液经腹腔感染两组小鼠,试验重复3次,统计小鼠存活率。结果经双酶切及测序鉴定,重组质粒pET-28a-mhla构建正确。重组蛋白mAT相对分子质量约为34 000,以可溶性形式表达。纯化的重组蛋白mAT可诱导小鼠产生滴度为1∶580 000的IgG抗体,且以IgG1亚型(抗体滴度为1∶440 000)为主。试验组小鼠对49521 3次攻毒的保护率分别为75.0%、70.0%和83.3%,对49525菌的保护率分别为80.0%、60.0%和80.0%,均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P均0.05)。结论金葡菌无毒性重组蛋白mAT具有较好的免疫原性和免疫保护作用,可作为多抗原组分疫苗研究的候选抗原。     

水痘-带状疱疹病毒Oka株gC基因的克隆及序列分析

目的对水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)Oka株gC基因进行克隆及序列分析。方法取第40代Oka VZV疫苗株,反复冻融3次后,收集上清,提取病毒DNA,根据NCBI登录的Dumas株VZV序列,设计引物,扩增gC基因,与pMD19-T Vector连接后,热转化至E.coli Competent Cells JM109中,挑选阳性菌落进行测序;将得到的序列与Gen Bank中登录的其他12株VZV毒株的gC基因序列,进行核苷酸序列和氨基酸水平分析。结果 13株VZV-gC基因开放阅读框(ORF)的核苷酸长度为1 557~1 776 bp,编码的蛋白由519~592个氨基酸组成。核苷酸序列同源性在94.8%~100%之间,氨基酸序列同源性在93.9%~100%之间。R2重复拷贝数为7,Dumas、SVETA和Ellen重复拷贝数为6,LAX1为4。结论 VZV Oka株gC蛋白具有高度的保守性,与其功能的发挥密切相关。     

浙江新分离狂犬病病毒街毒株与国内外疫苗株G基因的比较分析

目的对浙江新近分离的2株狂犬病病毒街毒株的G基因进行遗传学分析,并比较其与国内外使用的狂犬病疫苗株间的差异。方法以直接免疫荧光法和双抗体夹心ELISA法检测伤人犬脑组织,乳鼠接种分离病毒,RT-PCR扩增G基因片段,直接测序后进行遗传学分析。结果在2份伤人犬脑组织(编号LH和ZJCA1)中均检出狂犬病病毒,与其他浙江街毒株相比,G基因核苷酸和氨基酸序列同源性均为98.7%～99.2%。与当前国内外使用的多种疫苗株相比,与CTN疫苗株同源性最高,G基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为79.5%～86.1%和86.8%～94.1%。结论浙江新分离的2株狂犬病病毒街毒株属于基因1型,与当前使用的多种疫苗株相比,与CTN疫苗株属于同一分支,二者的亲缘关系最近。     

一株耐盐性莠去津高效降解菌Halomonas sp.SY-AD-9的分离、鉴定及其特性

[目的]进行盐单胞菌Halomonas sp.对莠去津降解的研究,解决含有莠去津的高盐废水处理问题。[方法]从长期受莠去津污染的土壤中分离出一株莠去津降解菌SY-AD-9,通过摇瓶实验及分子生物学技术研究该菌株对于莠去津的降解特性。[结果]结合生理化特性以及16S r RNA基因相似性分析将其初步鉴定为盐单胞菌属,基因序列已提交Gen Bank,登陆号为HM627247。该菌含有trz N和atz BCDEF 6个莠去津降解相关基因。该菌株具有很高的耐盐性,耐受极限高达14%。Na Cl质量分数为6%时该菌株在48 h内对200 mg/L的莠去津降解率为98.5%。[结论]利用盐度为6.5%的莠去津实际废水并且通过与本实验室另外一株莠去津降解菌SY-AD-39(Pseudomonas sp.)比较,菌株SY-AD-9具有更好的应用潜力。     

真菌性角膜炎常见致病菌株——镰刀菌的AFLP指纹图谱分析

目的采用AFLP对镰刀菌进行基因分型。方法对镰刀菌分离、纯化、重新鉴定后,用CTAB法提取其DNA。经EcoRI和MseI双酶切,对酶切片段进行预扩增和选择性扩增。扩增后的产物经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染成像。结果用20株镰刀菌作材料,筛选出3对多态性较高、带型质量较好的AFLP引物,分别是E-TCM-CAA,E-TAM-CTT,E-TAM-CAC。各菌株间的相似率为74%～90%,在SM=0.74(74%)的相似性水平上,镰刀菌明显地分为2种。14株茄病镰刀菌种内可分为9型,6株串珠镰刀菌种内可分为4型。结论AFLP可用于真菌性角膜炎常见致病菌株即镰刀菌的基因分型。     

我国百日咳疫苗生产用菌株主要抗原片段基因序列分析

目的对我国百日咳疫苗生产用菌株主要抗原片段基因进行序列分析,为我国百日咳疫苗的研制和质量控制提供依据。方法分别从我国百日咳杆菌疫苗生产用菌株CS株基因组DNA中扩增百日咳毒素(Pertussis toxin,PT)、外膜蛋白(Pertactin,PRN)、菌毛蛋白2(Fimbriae 2,FIM2)、菌毛蛋白3(Fimbriae 3,FIM3)基因,克隆至pMD18-T载体,测序,并与GenBank中登录的百日咳杆菌其他菌株的PT、PRN、FIM2、FIM3基因序列进行比较,构建系统进化树。结果百日咳杆菌CS株PT、PRN、FIM2和FIM3基因的扩增产物大小均与预期一致。CS株PT基因与国内的另一疫苗生产株18323亲缘关系最近,在同一分支上,且与国际标准株Tohama在同一亚分支内;PRN、FIM2和FIM3基因与国际标准株Tohama均在同一进化分支上。结论百日咳杆菌CS株与国际标准菌株Tohama亲缘关系较近,与临床分离的其他流行株亲缘关系较远。