胶体金免疫层析试纸条在食品安全检测中的研究进展

为了提高免疫检测的速度,简化操作步骤,建立了胶体金免疫层析技术.它是利用纤维膜的毛细作用,使待测物和金标物(抗原/抗体)沿膜表面向前运动,与检测区的捕获物特异结合而聚集显色.它既有免疫学方法的特异性,又有简便快速,无需仪器的优点.本文主要介绍了胶体金免疫层析技术的在食品安全检测中的应用,并对胶体金免疫层析试纸条技术的发...     

氰戊菊酯残留胶体金免疫层析试纸条研制

应用胶体金免疫层析技术研制出一种准确、快速、简便检测氰戊菊酯农药残留的试纸条.采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,标记氰戊菊酯单克隆抗体,以硝酸纤维素膜为载体,包被氰戊菊酯抗原作为检测线(T线),包被兔抗鼠IgG抗体作为质控线(C线),经过竞争反应后目测结果.实验结果表明,该快速检测试纸条100%抑制浓度为800 ng/m...     

用于新型冠状病毒快速诊断的荧光免疫层析试纸条的制备及其细胞成像

合成了双光子荧光标记探针LP并对其结构进行了表征,通过LP标记SARS-COV-2的N蛋白抗原（Ag）获得LP-Ag,并将LP-Ag制成免疫层析试纸条（TPICS）/试剂盒（TPICK）。临床应用研究表明,与核酸法（PCR）/胶体金法比较,TPICS的阳性符合率（PR）、阴性符合率（NR）和总符合率（TR）分别为98.73 % / 98.26 %、98.76 % / 99.20 %和98.75 % / 98.75 %,其一致性系数kappa值（K）为0.972 / 0.975,灵敏度（SE）、特异性（SP）和准确度（AC）分别为98.99 % / 98.10 %、99.55 % / 99.53 %和99.38 % / 99.06 %。检测试剂与参比试剂检测结果一致（K > 0.75）,无统计学差异。检测所用稀释血样一般为25~50 μL（合全血样5~10 μL）,检测周期10 min内。它既避免了核酸法操作繁琐与检测周期过长的缺点,又克服了胶体金法因吸附官能团脱落而导致的不稳定性,具有良好的应用价值。LP-Ag可用于细胞中SARS-COV-2成像以鉴定阴阳性。     

用于新型冠状病毒快速诊断的荧光免疫层析试纸条的制备及其细胞成像

合成了双光子荧光标记探针LP并对其结构进行了表征,通过LP标记SARS-CoV-2的N-蛋白抗原(Ag)获得LP-Ag,并将LP-Ag制成免疫层析试纸条(TPICS)/试剂盒(TPICK).临床应用研究表明,与核酸法(PCR)/胶体金法比较,TPICS的阳性符合率、阴性符合率和总符合率分别为98.99％/98.10％、...     

玉米细菌性枯萎病菌纳米磁标记免疫层析检测试剂与试纸条

分别以粒径为50和100 nm的羧基化纳米磁珠,通过碳二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联法使磁珠与抗体偶联,制备出可特异性识别玉米细菌性枯萎病菌的两种纳米免疫磁珠试剂。基于双抗体夹心法,经实验条件优化,选用100 nm的羧基化纳米磁珠为磁标记探针,组装了玉米细菌性枯萎病菌磁标记免疫层析检测试纸条。该方法用于玉米种子中玉米细菌性枯萎病菌的检测,检出限为1.0×106CFU/m L,15 min内可通过肉眼判读结果,也可用超顺磁共振检测仪实现量化检测,具有简便、快速、现场化检测的优势。     

布病胶体金免疫层析检测方法的建立

目的建立诊断布病的胶体金免疫层析方法。方法以B.abortus 544A全菌免疫BALB/c小鼠,以杂交瘤细胞技术制备单抗,纯化后以胶体金标记,选择最佳反应模式组装试纸条,并对其进行鉴定。结果已筛选4B8、1G9、1C9和1E24株稳定分泌单抗的细胞株,以其单抗互相配对组合的试纸条均能检出B.abortus 544A菌。其中以1G9为包被抗体、4B8为金标抗体的试纸检测效果最佳,与以B.abortus 544A菌多抗为包被抗体、4B8单抗为金标抗体的试纸对比,检测结果一致,且不与其他菌发生交叉反应。对PCR检测为阳性的70份牛血清样品,两种试纸条检测结果的符合率均为100%。结论所建立的诊断布病的胶体金免疫层析法快速、简便、准确,有望用于布病的诊断。     

三聚氰胺快速检测试纸条评价

胶体金试纸条因其方法简便、快速,已经广泛应用于日常检测和实验研究中.为了解国产三聚氰胺试纸条的有效性和可靠性,选择了一种市售试纸条,从灵敏度、特异性、准确度、耐变性、批间变异等多个角度对其进行了技术评价.结果发现用胶体金法测定牛奶中的三聚氰胺,检测限为0.05 mg/L,特异性、耐变性较好,批件差异较小,不同基质对检测结果无影响.此试纸条满足食品中有毒有害物质快速检测的要求,可作商品化快速检测试纸条使用.     

犬细粒棘球绦虫感染胶体金检测试纸条的制备

目的制备犬细粒棘球绦虫感染胶体金检测试纸条。方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,用于标记抗细粒棘球绦虫Ediag A864单克隆抗体2D12制作金标垫,兔抗细粒棘球绦虫Ediag A864多克隆抗体标记检测线(T线),羊抗鼠Ig标记质控线(C线),制备胶体金试纸条,并进行特异性、敏感性、重复性及稳定性试验。用优化的胶体金检测试纸条对96份犬粪样品(36份参照阳性样,60份临床样品)进行检测。结果制备的犬细粒棘球绦虫感染胶体金检测试纸条与犬蛔虫阳性粪及犬贾第虫阳性粪样品均无交叉反应;粪便稀释度为1∶4时仍可检出正确结果;3次检测参照阳性样本均为阳性;于不同温度(室温、4及37℃)下保存不同时间(1、2、3、4个月)的试纸条均可检出正确结果。96份犬粪便样品中,36份参照阳性样品检出率为97.2%(35/36),60份临床样品均为阴性。结论制备的试纸条具有良好的特异性及稳定性,可应用于临床样品检测及大规模流行病学调查。     

ELISA法与胶体金试纸条检测HBsAg差异分析

目的探究胶体金试纸条与ELISA法检测HBsAg临床应用价值。方法分别用胶体金试纸条与ELISA法检测360份标本中的HBsAg,并对阳性率进行比较,然后将强阳性的10份标本作倍比稀释,观察2种检测方法灵敏度的差异。结果2种方法的阳性率之间无显著差异,ELISA法灵敏度较胶体金试纸条灵敏度高。结论2种方法皆是检测HBsAg的良好方法,胶体金试纸条法操作简便、快速适用于急诊及健康人群的筛查,ELISA法适用于常规检测。     

胶体金层析免疫法对盐酸克伦特罗的检测试验

盐酸克伦特罗俗称"瘦肉精",若大量添加到猪饲料中,将在猪肉及内脏中残留,给食品安全带来了隐患。传统的检测技术繁琐,成本高,不利于推广普及。本实验利用胶体金层析法检测盐酸克伦特罗,结果表明:最低检测限度为5 ppb,具有简便、便捷、快速、灵敏度强的特点。     

呋喃妥因代谢物AHD单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备呋喃妥因代谢物AHD单克隆抗体,并进行鉴定。方法利用对羧基苯甲醛合成1-氨基乙内酰胺脲(AHD)的衍生物1-氨基乙内酰脲-4-羧苯基肟(4-CPAHD),通过活性脂法将4-CPAHD与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,获得免疫抗原4-CPAHD-BSA和包被抗原4-CPAHD-OVA,采用紫外分光光度法检测偶联是否成功。将人工合成抗原4-CPAHD-BSA免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术将免疫小鼠脾脏细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,筛选能稳定产生抗体的细胞株;通过间接ELISA法检测该细胞株分泌的单克隆抗体的效价、邻硝基-PAHD(2-NPAHD)对单克隆抗体的半数抑制浓度(IC50),并分析抗体的特异性。结果偶联后4-CPAHD-BSA的最大吸收峰有较明显的偏移,表明4-CPAHD与BSA偶联成功,平均偶联比为17.4∶1。制备的单克隆抗体的效价为1∶64 000,2-NPAHD对单克隆抗体的IC50为1.45μg/L,单克隆抗体与同类抗生素及其代谢物无交叉反应。结论制备的AHD单克隆抗体各项指标均较好,为呋喃妥因代谢物免疫检测试剂的研发奠定了基础。     

抗犬新孢子虫MIC6单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗犬新孢子虫MIC6单克隆抗体,并进行鉴定。方法用重组蛋白p GEX-MIC6作为抗原免疫BALB/c小鼠,收集脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,对融合后的杂交瘤细胞进行筛选后,经腹腔注射BALB/c小鼠,制备腹水,鉴定单抗的亚类。采用辛酸-硫酸铵法结合蛋白亲和层析柱纯化腹水,SDS-PAGE分析抗体的相对分子质量,间接ELISA法检测抗体效价及特异性,BCA蛋白浓度检测试剂盒测定抗体浓度。结果最终获得两株能稳定分泌新孢子虫MIC6蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A1和1H11,分泌的抗体分别属于Ig G1和Ig G2b亚类。纯化后的腹水经SDS-PAGE分析,分别可见相对分子质量约为50 000的重链和25 000的轻链条带,纯化效果较好;1A1和1H11的腹水效价分别为5.12×104和1.024×105,浓度分别为0.935和2.010 mg/ml,两株单抗均能特异性识别新孢子虫,与弓形虫无交叉反应。结论制备的抗犬新孢子虫MIC6单克隆抗体特异性较强,为进一步研究新孢子虫MIC6的生物学功能及建立特异敏感的新孢子虫检测方法奠定了基础。     

14型肺炎球菌多糖单克隆抗体的制备与初步应用

目的制备14型肺炎球菌多糖单克隆抗体,并进行鉴定及初步应用。方法制备免疫原,免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体,经3次亚克隆筛选单抗细胞株,并制备腹水。对筛选的单抗进行ELISA效价、特异性、亚型、中和效价、浊度法特异性等鉴定。采用制备的单抗腹水检测市售23价肺炎球菌多糖疫苗、7价肺炎球菌结合疫苗中14型肺炎球菌多糖含量,计算回收率;并与丹麦血清研究所(State Serum Institute,SSI)14型肺炎球菌多糖兔多抗血清检测结果进行比较,计算两者之间的变异系数(CV)。结果共获得7株14型肺炎球菌多糖单抗细胞株:PP-14-101~107,效价分别为105、104、104、104、105、105、105;7株单抗与23价肺炎疫苗中包含的除14型以外的其他所有血清型的多糖均不发生交叉反应;PP-14-101、104、105、106这4株单抗具有免疫浊度趋势,另3株单抗无浊度信号;PP-14-101和PP-14-104株单抗与6A、33F型肺炎球菌多糖具有一定的交叉反应,而PP-14-105和PP-14-106株单抗与23型多糖均无交叉反应;PP-14-101、PP-14-104株单抗为Ig M亚型,PP-14-105、PP-14-106株单抗为Ig G1亚型,PP-14-106比PP-14-105株单抗稀释倍数高,反应性更强,因此选择PP-14-106株单抗为目标单抗;PP-14-106株单抗腹水对14型肺炎球菌的中和效价远高于1∶17 496,中和效价较高;采用PP-14-106株单抗腹水检测市售23价肺炎球菌多糖疫苗和7价肺炎球菌结合疫苗,回收率为90.2%~120.0%,该单抗与SSI血清检测上述疫苗成品14型肺炎球菌多糖含量的CV值在2.5%~11.9%之间。结论成功获得1株效价高、具有杀菌活性、特异性好的单抗,该单抗具有免疫浊度趋势,能准确测定肺炎球菌疫苗中的多糖含量,可替代SSI血清用于多糖疫苗和结合疫苗中14型肺炎球菌多糖含量的定量检测。     

甲型副伤寒沙门菌菌体抗原单克隆抗体的制备及其初步应用

目的制备甲型副伤寒沙门菌菌体抗原单克隆抗体,并对其进行鉴定及初步应用。方法用甲醛灭活的甲型副伤寒沙门菌免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,筛选出稳定分泌甲型副伤寒沙门菌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,对克隆纯化后的阳性细胞扩大培养后,免疫BALB/c小鼠,收获腹水,间接ELISA法检测抗体效价,并进行Ig类和亚类鉴定;腹水经辛酸-硫酸铵盐析法纯化后,采用间接ELISA法、玻片凝集试验、SDSPAGE法、免疫扩散试验进行检测。将纯化后的2株单克隆抗体用于双抗体夹心ELISA法的建立,并用自制配对抗体检测甲型副伤寒患者血浆、乙型副伤寒患者血浆、伤寒患者血浆和正常人血浆。结果共筛选出2株持续分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为1H4和2A9,腹水抗体效价为1∶10~7和1∶10~6,分别为IgG_1和Ig G_3亚类,轻链均为κ型。纯化后的单克隆抗体1H4、2A9效价分别为1∶10~7和1∶10~3,1H4纯度大于85%,2A9纯度小于60%。2株单克隆抗体与甲型副伤寒沙门菌50503、50973可产生凝集反应,与伤寒沙门菌50096不产生反应;1H4在稀释度为1∶8时可与甲型副伤寒沙门菌菌体特异多糖(organism specific polysaccharide,OSP)产生凝集反应,而2A9在每个稀释度与OSP均不发生反应。将1H4和2A9用于双抗体夹心ELISA检测法建立,确定1H4/HRP-2A9的组合为最佳配对,用该配对抗体检测阳性样本检出率为100%,正常人血浆样本检出率为0。结论获得2株甲型副伤寒沙门菌菌体抗原单克隆抗体,可用于甲型副伤寒沙门菌的快速鉴定。     

抗细粒棘球绦虫EdiagA864单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗细粒棘球绦虫Ediag A864单克隆抗体,并进行鉴定。方法以细粒棘球绦虫Ediag A864蛋白为抗原,经皮下多点免疫BALB/c小鼠,共免疫4次。末次免疫3 d后制备小鼠脾细胞,在聚乙二醇(PEG)的作用下与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,间接ELISA法筛选出阳性杂交瘤细胞株进行克隆,检测其染色体数及分泌的单克隆抗体亚型。采用体内培养法大量制备抗细粒棘球绦虫Ediag A864单克隆抗体,并经正辛酸-饱和硫酸铵法和Hi Trap Protein G HP亲和层析结合法纯化。结果经筛选克隆共获得4株可产生细粒棘球绦虫Ediag A864单克隆抗体的杂交瘤细胞株:2D12、3H4、4A6和6E5,细胞染色体数分别为97、101、98和96,重链亚型均为Ig G1,轻链亚型均为Kappa。2D12、3H4腹水效价为2×105,4A6和6E5腹水效价为1×105。纯化后的2D12抗体可见相对分子质量为46 000和26 000的重链和轻链条带。结论本实验获得的2D12是一株稳定的杂交瘤细胞株,且可产生高效价细粒棘球绦虫Ediag A864单克隆抗体,为细粒棘球绦虫病的免疫诊断奠定了基础。     

抗荧光素单克隆抗体免疫磁珠的制备及初步应用

目的制备抗荧光素单克隆抗体免疫磁珠,并进行初步应用。方法采用B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗荧光素单克隆抗体;制备腹水,经50%硫酸铵粗提后,再经阴离子交换树脂DE52进一步纯化单克隆抗体;采用氧化共沉淀法制备纳米磁性粒子;乳液聚合法制备羧基磁性微球;用碳二亚胺将抗荧光素单克隆抗体共价偶联于磁性微球表面,制备抗荧光素单克隆抗体免疫磁珠。用制备的免疫磁珠检测乙肝表面抗原,并与市售ELISA试剂盒的检测结果进行比较。结果共获得5株杂交瘤细胞株,其中1F12细胞株分泌的抗体效价、相对亲和力较高,特异性较好;纯化的1F12株单抗的纯度达95%,蛋白含量为2.4 mg/ml,ELISA效价为106,相对亲和力为0.2 mg/L,与FITC标记的BSA可特异性结合;纳米磁性粒子的平均粒径为150 nm,铁含量为71.63%;羧基磁性微球的平均粒径为210 nm,羧基含量约为2.15 mmol/g;每克羧基磁性微球可结合抗荧光素单克隆抗体约12 mg,制备的免疫磁珠可有效结合荧光素标记的蛋白。应用抗荧光素单克隆抗体免疫磁珠检测乙型肝炎表面抗原的灵敏度高于ELISA试剂,检测限达0.1 ng/ml。结论成功制备了抗荧光素单克隆抗体免疫磁珠,其具有应用于免疫检测分析的价值。     

抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheities virus,IBRV)gD蛋白单克隆抗体,并鉴定其生物学特性。方法采用超速离心纯化的IBRV全病毒免疫BALB/c小鼠,取免疫后血清抗体呈阳性的小鼠脾细胞,通过融合剂PEG与骨髓瘤细胞SP2/0融合,采用间接免疫荧光法(IFA)筛选杂交瘤细胞,并制备腹水,分析单抗的生物学特性。结果筛选出1株稳定分泌抗IBRV gD蛋白单抗的杂交瘤细胞,命名为3C1。单抗的重链为IgG1亚类,轻链为kappa链;上清和腹水效价分别为1∶40和1∶12 800;单抗可与IBRV及gD重组蛋白分别在相对分子质量71 000和96 000处发生特异性反应,可与感染IBRV的MDBK细胞发生特异性结合,产生荧光。结论成功制备了抗IBRV gD蛋白的单克隆抗体,为深入研究gD蛋白功能及IBR的临床诊断方法筛选等提供了数据材料。     

牛传染性鼻气管炎病毒gE蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheities virus,IBRV)g E蛋白的单克隆抗体,并进行鉴定。方法将扩增的IBRV gE基因插入至载体p ET-32a(+),转化感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白IBRV gE,通过Ni-NTA Agarous Kit纯化后,免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠脾细胞,与SP2/0细胞融合,间接免疫荧光法筛选阳性杂交瘤细胞。经小鼠腹腔注射杂交瘤细胞,3×10~6个/只,待小鼠腹腔膨大后,采集腹水,硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体,并进行亚类、浓度、染色体数目、Western blot及间接免疫荧光检测。结果重组蛋白IBRV gE相对分子质量约35 000,纯化后浓度为1.2 mg/mL。小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后,筛选出1株稳定分泌IBRV单抗的杂交瘤细胞(命名为3G9),获得相应抗体浓度为1.46 mg/m L;为IgG1亚类,轻链为kappa链;染色体数目为95~105;可与IBRV发生特异性反应;可与接种IBRV毒株的MDBK细胞发生特异性结合,产生特异性荧光。结论采用原核表达系统表达并纯化了IBRV gE蛋白,成功制备了抗IBRV gE的单克隆抗体,为建立特异性的IBRV诊断方法及致病机理的研究奠定了基础。     

牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)gD蛋白单克隆抗体,并进行鉴定。方法将扩增的IBRV gD基因插入原核表达载体p ET-28a(+),构建重组质粒gD-pET-28a,转化至感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白gD,通过Ni-NTA Agarous Kit纯化后,免疫BALB/c小鼠。取小鼠脾细胞,与SP2/0细胞融合,筛选阳性杂交瘤细胞,经小鼠腹腔注射,待小鼠腹腔膨胀时抽取腹水,用Hi Trap Protein G HP试剂盒纯化单抗,进行Western blot及间接免疫荧光检测。结果重组蛋白gD相对分子质量为48 000,纯化后浓度为4.19 mg/ml。小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后筛选出1株阳性杂交瘤细胞株,获得相应单克隆抗体的蛋白含量为1.81 mg/ml,且可与IBRV发生特异性反应,可与接种IBRV的MDBK细胞发生反应,产生特异性荧光。结论本研究利用原核表达系统表达纯化了IBRV gD蛋白,成功制备了IBRV gD单克隆抗体,为下一步表位鉴定及致病机理的研究奠定了基础。     

adr和adw亚型HBsAg单克隆抗体的制备

目的制备adr和adw亚型乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)单克隆抗体,并用其区分两亚型HBsAg。方法利用杂交瘤细胞融合技术制备adr和adw亚型HBsAg单克隆抗体,采用间接ELISA法进行筛选;优化鉴别试验抗原包被剂量,并对HBsAg亚型鉴别试验进行验证。结果共获得抗两亚型HBsAg的单克隆抗体7株;鉴别试验抗原的最佳包被剂量为10μg;1H6和4D3株单抗检测2份编盲adw亚型HBsAg样品的adwA450/adrA450值均大于2,判定其为adw亚型;1E9株单抗检测2份编盲adr亚型HBsAg样品adrA450/adwA450值均大于2,判定其为adr亚型;3A5株单抗检测4份编盲样品的adrA450/adwA450值和adwA450/adrA450值均小于2,未能区分两亚型HBsAg。结论抗adr亚型单抗1E9株及抗adw亚型单抗1H6株和4D3株可用于adr亚型汉逊酵母乙肝疫苗研制过程中HBsAg亚型的鉴别。