重组抗血管生成素肽-Fc融合蛋白的质控方法和质量标准的建立

目的建立重组抗血管生成素肽-Fc融合蛋白的质控方法和质量标准。方法分别采用分子筛高效液相色谱(size exclusion-high performance liquid chromatography,SE-HPLC)、反相高效液相色谱(reverse phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC)和还原毛细管电泳(reduced capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfate,rCE-SDS)测定3批重组抗血管生成素肽-Fc融合蛋白成品的纯度;采用AlphaScreen组氨酸检测试剂盒进行重组抗血管生成素肽-Fc融合蛋白受体配体结合试验测定效价;采用ELISA法进行鉴别试验;蛋白含量、pH值、渗透压摩尔浓度、Tween-20、不溶性微粒、外观、澄清度、生物学活性、水分、内毒素、无菌试验、异常毒性、渗透压等项目的检测按《中国药典》三部(2010版)规定进行。结果 SE-HPLC、RP-HPLC及rCE-SDS测定3批供试品的纯度分别为>98%、>80%和>99%;重组抗血管生成素肽-Fc融合蛋白对血管生成素(angiopoietin,Ang)与酪氨酸激酶受体(tyrosine kinase with immunoglobulin-like and EGF-like domains,Tie)结合的抑制作用呈剂量依赖性,3批供试品与标准品的剂量反应曲线相同,呈典型的倒S型,R2均>0.98,结合效价均在平均值的正负25%区间内;3批供试品的S/N值均>1.60;其他项目检测结果均符合《中国药典》三部(2010版)相关规定。结论建立的质控方法具有保证产品安全有效、质量可控的特点,可用于该类产品的常规检定。     

金黄色葡萄球菌GapC蛋白与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白的融合表达及其活性

目的在大肠埃希菌中融合表达金黄色葡萄球菌(Staphylococcus.aureus,S.aureus)GapC蛋白与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白,并检测其甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)活性。方法采用PCR技术分别扩增鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白flic基因和S.Aureus GapC基因,通过overlap PCR将这两段基因拼接并克隆至载体pQE30a,构建重组表达质粒pQE30-flic-GapC,将重组表达质粒转化E.coli XL-blue,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱亲和层析试剂盒纯化后,进行SDS-PAGE及Western blot分析,并检测其GAPDH活性。结果重组表达质粒pQE30-flic-GapC经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达产物相对分子质量约95 000,最佳诱导表达时间为5 h,主要以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的31.4%;纯化产物可与小鼠抗S.aureus全菌体多抗血清和抗鼠伤寒沙门菌全菌体多抗血清发生特异性反应,GAPDH活性为(0.337±0.019)。结论成功表达并纯化了具有较高生物学活性的flic-GapC融合蛋白,为S.aureus亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

GST-AEP融合蛋白的表达、纯化和鉴定

目的利用GST融合基因表达系统表达GST-AEP融合蛋白,并进行纯化及鉴定。方法IPTG诱导重组质粒pGEX-4T-1/AEP在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,溶菌酶裂解后,采用GST蛋白纯化系统进行纯化,所得产物进行12%SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果大肠杆菌经诱导,高效表达出相对分子质量约34000的蛋白,与GST-AEP融合蛋白相符。Western blot结果显示该蛋白能够被兔抗GST多克隆抗体识别。结论已成功表达并纯化了融合蛋白,为更深入研究AEP的结构和功能奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌α-毒素重组蛋白的免疫原性及其免疫保护性评价

目的评价金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)无毒性α-毒素(alpha toxin,AT)重组蛋白的免疫原性及其在金葡菌49521(CP5型)和49525(CP8型)菌株中的免疫保护作用。方法根据NCBI中hla基因参考序列(NC₀07795.1),人工合成无毒突变hla H35L基因(即mhla基因)序列,克隆至pET-28a(+)载体中,构建重组质粒pET-28a-mhla,转化至E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达产物进行Ni柱亲和层析纯化,SDS-PAGE分析目的蛋白(mAT)的可溶性。用重组蛋白mAT+氢氧化铝佐剂(试验组)和氢氧化铝佐剂(对照组)分别于0、14、28 d经腹部皮下免疫BALB/c小鼠,攻毒前1 d小鼠眼眶采血,检测血清中IgG抗体及其亚型IgG1、IgG2a、IgG2b抗体水平;末次免疫10 d后,分别用致死剂量49521(6.0×108 CFU/只)及49525(3.0×109 CFU/只)菌液经腹腔感染两组小鼠,试验重复3次,统计小鼠存活率。结果经双酶切及测序鉴定,重组质粒pET-28a-mhla构建正确。重组蛋白mA...     

重组CFP10-PPE68融合蛋白检测结核分枝杆菌感染的初步应用

目的以结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)RD1区特异性培养滤液蛋白10(culture filtrate pro-tein10,CFP10)与戊糖-5-磷酸-3-差异构象酶68(pentose-5-phosphate-3-epimerase68,PPE68)的融合蛋白CFP10-PPE68作为包被抗原,建立检测结核病患者血清中MTB抗体的间接ELISA法。方法采用亲和层析法纯化重组CFP10-PPE68、CFP10和PPE68蛋白;分别以3种蛋白作为包被抗原,建立检测结核病患者血清中MTB特异性抗体的间接ELISA法;采用方阵滴定法对建立的间接ELISA法的条件进行优化;并以临床诊断为金标准,对间接ELISA法的特异性、敏感性和准确性进行验证。结果纯化的重组CFP10-PPE68融合蛋白纯度约为70%。分别以重组CFP10-PPE68、CFP10和PPE68蛋白作为包被抗原的最佳包被浓度分别为2、4、4μg/ml,血清最佳稀释度均为1∶1 000,酶标二抗最佳稀释度均为1∶5 000。3种蛋白对肺外结核的诊断效果均优于肺结核,且重组CFP10-PPE68融合蛋白检测肺外结核的特异性、敏感性及准确性均最佳;3种蛋白诊断结核病的特异性较高,而敏感性相对较低。结论以重组CFP10-PPE68融合蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA法诊断MTB感染具有较高的敏感性和特异性,特别是对难以诊断的肺外结核病的诊断有一定的参考价值。     

胰高血糖素样肽-1融合蛋白生物学活性检测方法的建立及验证

目的建立胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)融合蛋白(GLP1-Fc)生物学活性荧光素酶报告基因测定方法,并进行验证。方法采用电穿孔法将GLP-1受体(GLP-1R)表达载体和cAMP反应元件(cAMP response element,CRE)报告基因共转染入HEK-293细胞中,通过加入潮霉素B筛选和单克隆培养,获得稳定转染的单克隆细胞株;采用药物敏感的细胞株建立报告基因生物学活性测定方法,并对方法进行优化及验证。结果筛选出GLP-1-Fc活性检测细胞株293-GLP-1R/CRE,该细胞较合适的活性检测参数为每孔接种20 000个细胞,培养10～15 h,利拉鲁肽的起始浓度为10 mg/L,作用时间5 h。采用建立的方法检测不同效价利拉鲁肽样品相对生物学活性的回收率在(90. 43±3. 29)%～(99. 87±5. 34)%之间,利拉鲁肽(标准品)与样品6次测定的EC50的CV值分别为2%和3%,二者无差异。结论建立了快速、精确的测定GLP1-Fc生物学活性的方法,为GLP-1相关的药效指标评价提供了更加客观、全面的手段。     

HPV16 E5蛋白免疫优势肽段分析及其多克隆抗体的制备

目的 预测人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus 16,HPV16) E5蛋白的免疫优势肽段,并制备其多克隆抗体.方法 以人HPV16 E5蛋白全长氨基酸序列为基础,采用Hopp&Woods的亲水性方案、Zimmerman极性参数、Jameson-Wolf抗原指数方案和Emini表面可及性方案及抗...     

融合蛋白GST-PADI4可溶性表达条件的优化及纯化

目的优化融合蛋白GST-PADI4的可溶性表达条件,并对蛋白进行纯化。方法对融合蛋白GST-PADI4工程菌的诱导温度(16、20、25、30、37℃)、诱导剂IPTG浓度(0.05、0.1、0.2、0.5、1 mmol/L)、诱导时菌液A600值(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0)、诱导时间(8、12、16、20、24 h)进行优化,分析融合蛋白GST-PADI4的可溶性表达情况;按优化的表达条件进行大量表达后,采用Sepharose 4B亲和层析柱对融合蛋白进行纯化。结果在16℃,菌液A600值约为0.4时,以0.1 mmol/L IPTG诱导12 h,融合蛋白GST-PADI4有较高的可溶性表达;纯化的融合蛋白纯度为91%。结论优化了融合蛋白GST-PADI4的可溶性表达条件,并获得了高纯度的可溶性融合蛋白,为后续研究PADI4蛋白的功能奠定了基础。     

Melanocortin-5 Receptor: Pharmacology and Its Regulation of Energy Metabolism

As the most recent melanocortin receptor (MCR) identified, melanocortin-5 receptor (MC5R) has unique tissue expression patterns, pharmacological properties, and physiological functions. Different from the other four MCR subtypes, MC5R is widely distributed in both the central nervous system and peripheral tissues and is associated with multiple functions. MC5R in sebaceous and preputial glands regulates lipid production and sexual behavior, respectively. MC5R expressed in immune cells is involved in immunomodulation. Among the five MCRs, MC5R is the predominant subtype expressed in skeletal muscle and white adipose tissue, tissues critical for energy metabolism. Activated MC5R triggers lipid mobilization in adipocytes and glucose uptake in skeletal muscle. Therefore, MC5R is a potential target for treating patients with obesity and diabetes mellitus. Melanocortin-2 receptor accessory proteins can modulate the cell surface expression, dimerization, and pharmacology of MC5R. This minireview summarizes the molecular and pharmacological properties of MC5R and highlights the progress made on MC5R in energy metabolism. We poInt. out knowledge gaps that need to be explored in the future.     

TF-CTP-OD_2-HA融合蛋白的原核表达及纯化

目的构建pCold-TF-CTP-OD2-HA原核表达质粒,在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白。方法以前期构建的质粒p32a(+)CTP-OD-HA为模板,PCR扩增寡聚化结构域(Oligomerization domain,OD)中起关键作用的OD2基因序列,与胞浆转导肽(Cytoplasmic transduction peptide,CTP)和流感病毒血凝素抗原表位(Hemagglutinin,HA)连接后,克隆至pCold-TF-DNA质粒中,构建质粒pCold-TF-CTP-OD2-HA,同时构建质粒pCold-TF-CTP-HA作为对照。将两种质粒分别转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果质粒pCold-TF-CTP-OD2-HA和pCold-TF-CTP-HA经PCR、双酶切和测序鉴定构建正确;表达的融合蛋白TF-CTP-OD2-HA和TF-CTP-HA相对分子质量分别约为63 000和58 000,两种融合蛋白均主要存在于破菌上清中,表达量分别约占菌体总蛋白的32%和25%,破菌沉淀中有少量表达;纯化的融合蛋白纯度均达95%以上,均可与鼠抗HA-tag多克隆抗体特异性结合。结论成功构建了pCold-TF-CTP-OD2-HA原核表达质粒,在大肠杆菌中表达并纯化了融合蛋白,为后续研究其在CML中的作用机制奠定了基础。     

Production and properties of a factor X-cellulose-binding domain fusion protein

A fusion protein, FX–CBD_Cex, which comprises factor Xwith a cellulose-binding domain (CBD_Cex) fused to its C-terminus,was produced in BHK cells. It was purified from the culturemedium by affinity chromatography on cellulose. FX–CBD_Cexcould be activated to FXa–CBD_Cex with Russell viper venom.FXa–CBD_Cex was as active as FXa against a chromogenicsubstrate and against proteins containing the Ile–Glu–Gly–Argsequence hydrolysed by FXa. FXa–CBD_Cex retained its activitywhen adsorbed to cellulose.     

人LIGHT-Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的利用酵母表达系统制备人LIGHT-Fc融合蛋白。方法利用基因工程方法构建含人LIGHT胞外段基因和人Ig G4 Fc基因的重组质粒p PIC9K-LIGHT-Fc,经SalⅠ线性化后电转化感受态酵母菌GS115,PCR鉴定重组转化子。将阳性重组转化子经甲醇诱导表达后,RT-PCR法检测目的基因的转录水平,SDS-PAGE及Western blot法进行表达产物的鉴定。结果表达质粒p PIC9K-LIGHT-Fc经酶切及测序鉴定,证明构建正确。10个重组子均为Mut+型阳性转化子,经甲醇诱导后可扩增出特异性目的基因片段。表达的重组LIGHT-Fc融合蛋白相对分子质量约45 000,可与鼠抗人LIGHT多克隆抗体发生特异性结合。结论人LIGHT-Fc融合蛋白在毕赤酵母中已成功获得了表达,为进一步开展其生物学功能的研究奠定了基础。     

融合标签在蛋白质可溶性表达中的应用进展

融合标签是大规模生产可溶性蛋白质的有效工具,因此融合标签在蛋白质可溶性表达中的应用已成为外源蛋白表达的研究热点。本文重点介绍了常用融合标签及其提高重组蛋白质可溶性表达的机理,主要用5种模型从不同的角度阐述融合标签在蛋白折叠中的作用,其中大多数功能较强的融合标签（如MBP和NusA）作为分子伴侣帮助重组蛋白正确折叠从而提高蛋白质可溶性。此外,阐述了实际应用中常用的组合标签和标签的去除。最后提出了融合标签在大规模生产可溶性蛋白质中的应用前景、面临的挑战,以及今后研究的方向。     

Destabilizing interactions between the partners of a bifunctional fusion protein

Hybrid MalE–GVP is a bifunctional protein in vitro sinceit binds maltose as protein MalE of Escherichia coli and sinceit is dimeric and specifically binds single-stranded DNA asprotein GVP of phage M13. The oxidation rate of a unique cysteineresidue was used to compare the stabilities of GVP in its freeand hybrid forms, under conditions where MalE was either foldedor unfolded by a denaturing agent. The results showed that boththe covalent link and tertiary non-covalent interactions betweenMalE and GVP destabilized GVP in MalE–GVP. To test whetherGVP had identical structures in its free and hybrid forms, mutationswere used as local conformational probes. The effects of thesemutations on the capabilities of MalE–GVP to dimerizeand to bind single-stranded DNA were assayed in vitro. Theywere compatible with the effects of the same mutations on theglobal activity of free GVP in vivo and with the effects thatcould be predicted from the known data on free GVP, in particularits crystal structure. Thus, one partner of a hybrid proteincan be destabilized by the other partner while maintaining itsstructural and functional characteristics.     

重组葡激酶-水蛭素融合蛋白质控方法和质量标准的建立

目的建立注射用重组葡激酶(staphylokinase,SAK)-水蛭素(hirudin,HV)融合蛋白(SFH)的质控方法和质量标准。方法采用纤维蛋白平板溶圈(fibrin agarose plate assay,FAPA)法测定SFH的溶栓比活性,纤维蛋白凝块溶解法测定SFH的抗凝比活性;还原型SDS-PAGE测定SFH的相对分子质量;非还原SDS-PAGE和反相高效液相色谱(reversed-phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)测定SFH的纯度;胰酶裂解后采用RP-HPLC法分析SFH的肽图;其他各项指标的检测按《中国药典》三部(2010版)规定进行。结果用建立的方法对SFH原液和成品进行检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部(2010版)的要求。结论建立的质控方法和质量标准能够保证产品安全、有效、质量可控,可用于注射用SFH产品的常规检定。