悬浮Vero细胞快速扩增轮状病毒

目的探讨在悬浮Vero细胞中快速扩增轮状病毒(RV)的方法。方法 Vero细胞经消化后,直接接种KMG1b7株RV。采用微量滴定法、PAGE和RT-PCR等方法比较悬浮扩增、静置培养及微载体发酵培养RV的感染性滴度、基因组核酸带型和型特异VP7基因序列;采用电镜观察和Westernblot鉴定悬浮扩增RV的形态及结构蛋白的抗原性。结果悬浮细胞扩增的RV接种24h后病毒感染性滴度达峰值,为6.00lgCCID50/ml;而静置培养和微载体发酵培养分别在接种后(96±24)h和(48±6)h达峰值,分别为(6.00±0.25)lgCCID50/ml和(6.50±0.25)lgCCID50/ml。悬浮扩增的RV基因组呈典型的4-2-3-2G1血清型带型,G1型特异基因VP7序列未发生突变。悬浮扩增的RV形态和结构蛋白的抗原性未发生改变。结论在悬浮Vero细胞中扩增RV可以缩短病毒制备周期,提高病毒收获量,有利于RV疫苗的研制或生产。     

Vero细胞微载体技术规模化培养轮状病毒

目的利用Vero细胞微载体技术规模化培养轮状病毒。方法利用5 L生物反应器进行Vero细胞的微载体培养,待细胞密度达1.5×106个/ml时,以0.05 MOI接种轮状病毒P[2]G3株,于37℃连续培养6 d后收获病毒,期间每天取样观察细胞病变(CPE),并检测病毒感染性滴度。结果在轮状病毒规模化培养的初期,其病毒滴度逐渐升高,至48 h达到最高。在上清中,病毒的滴度为5.5CCID50/ml;在细胞裂解产物中,病毒的滴度为3.75CCID50/ml。结论Vero细胞微载体规模化培养轮状病毒可提高病毒的滴度。     

Vero细胞培养H3N2流感病毒冷适应株条件的优化

目的对Vero细胞培养H3N2流感病毒条件进行优化。方法使用Vero细胞培养H3N2流感病毒,对病毒感染复数(MOI)、吸附时间、维持液中NaHCO_3含量、TPCK-胰酶终浓度和细胞病变效应(CPE)等培养条件进行优化。结果在MOI为0. 05,病毒吸附1. 5 h,病毒维持液中6. 6%NaHCO_3溶液加入量为2%,TPCK-胰酶终浓度为1 mg/L,40%～50%细胞出现CPE情况下收获病毒,血凝(hemagglutination,HA)效价最高。结论优化后的培养条件可用于大规模流感疫苗的生产。     

流感病毒H5N1在Vero细胞上培养条件的优化

目的优化流感病毒H5N1在Vero细胞上的培养条件。方法在Vero细胞上,用不同维持液[M199、M199+表皮细胞生长因子(epidermal growth factor,EGF)、MEM、MEM+EGF、无血清培养基(serum-free medium,SFM)]及含不同胰酶浓度(3、5、7μg/ml)的M199维持液培养流感病毒H5N1,收获培养上清,检测血凝滴度,确定最适维持液及胰酶浓度;用流感病毒H5N1感染细胞上清于冻融前后分别感染Vero细胞,连续传代,收获培养上清,检测血凝滴度,比较冻融对病毒增殖的影响。将流感病毒H5N1以0.01 MOI感染对数生长期Vero细胞,以优化后的培养条件培养,收获培养上清,检测血凝滴度及病毒感染性滴度,确定H5N1在Vero细胞上连续传代的稳定性。结果当维持液培养基为SFM、胰酶浓度为5μg/ml时,利用病毒收获液直接感染2代后,再将维持液培养基更换为M199时,血凝滴度最高。利用优化后的培养条件在Vero细胞上连续传代培养流感病毒H5N1,血凝滴度和感染性病毒滴度均较稳定。结论优化后的培养条件在Vero细胞上可连续稳定传代培养流感病毒H5N1,为建立工作种子批,用于大流感疫苗的制备奠定了基础。     

用无血清适应的Vero细胞培养H5N1型流感病毒条件的优化

目的优化无血清适应的Vero细胞(SFM-Vero细胞)培养H5N1型流感病毒的条件。方法将H5N1型流感病毒接种于SFM-Vero细胞,于免疫荧光显微镜下观察病毒感染情况。对病毒无血清培养条件MOI(0.05、0.10、0.15、0.20)、细胞培养时间(12、24、36、48 h)、培养液基础培养基(DMEM/F12、M199、RPMI1640及MEM:DMEM/F12混合液)、培养温度(33、33.5、34、34.5、35和37℃)、收获时间(24、36、48、60和72 h)、培养液p H值(6.8、7.1、7.4、7.7、8.0和8.3)和TPCK胰酶浓度(0.5、1.0、1.5μg/ml)进行优化,并检测最佳条件无血清培养的H5N1型流感病毒的血凝效价及形态。结果 H5N1型流感病毒对SFM-Vero细胞具有感染性。最佳无血清培养条件为:MOI=0.1和0.15,细胞培养时间36 h,以DMEM/F12为基础培养基,病毒培养温度33.5和34.5℃,病毒收获时间60 h,培养液p H 7.7,TPCK胰酶浓度为1.0μg/ml。最佳条件无血清培养的H5N1型流感病毒的血凝效价为1∶512,电镜下观察病毒形态完整。结论确定了H5N1型流感病毒对SFM-Vero细胞具有感染性,并优化了SFMVero细胞培养流感病毒的适宜条件,为更具有生物安全性流感疫苗的研发奠定了基础。     

轮状病毒P[2]G3株在Vero细胞上的传代适应性

目的研究轮状病毒P[2]G3株在Vero细胞上的传代适应性,以确定其在Vero细胞上培养的最适条件。方法将P[2]G3株轮状病毒分别以0.01、0.05和0.1MOI接种于Vero细胞,观察细胞病变(CPE)情况,并检测病毒的感染性滴度,确定在Vero细胞上接种病毒的最适MOI。同时观察连续传15代后,各代次病毒的滴度及其基因核酸带型的变化。结果MOI为0.05时,接种病毒后出现CPE及收获时间均较早,病毒的感染性滴度最高,确定接种病毒的最适MOI为0.05。连续传15代,病毒滴度随传代次数的增加而上升,各代次病毒的基因组核酸带型基本一致,且与原代病毒相符。结论轮状病毒P[2]G3株经适应性培养后,可在Vero细胞上稳定传代15代。     

肠道病毒71型在Vero细胞中培养条件的优化

目的优化肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)在Vero细胞中的培养条件。方法分别采用吸附法和直接接种法将EV71接种于Vero细胞中进行增殖,检测病毒滴度;选择最佳接种方法接种病毒,考察血清浓度、收毒方式、病毒接种量(MOI)和收毒时间对病毒滴度的影响。结果将MOI为0.02～0.2的病毒直接接种于不含血清的培养基中,培养60 h,胞外收毒,可获得较高的病毒滴度。结论优化了EV71在Vero细胞中的培养条件,为EV71的大规模培养及其疫苗研发奠定了基础。     

低血清培养Vero细胞和流感病毒条件的优化

目的优化低血清培养Vero细胞和流感病毒的条件,为开发Vero细胞流感疫苗奠定基础。方法分别在DMEM/F12和SLM-199培养基中,添加不同浓度的血清,培养Vero细胞,观察细胞连续传代的生长状态;接种流感病毒后,检测病毒培养液不同pH值、不同浓度TPCK-胰酶和病毒不同接种量对病毒血凝效价的影响。结果用SLM-199在1.0%血清浓度下培养的Vero细胞接种流感病毒血凝效价较高,病毒培养液pH值为7.2,TPCK-胰酶含量为1.0μg/ml,接种病毒MOI为1.0时,72h收获的病毒血凝效价最高。结论已筛选出低血清培养Vero细胞和流感病毒的适宜条件。     

Vero细胞无血清培养基的优化

目的通过试验设计(design of experiments,DOE)方法和统计学分析快速优化Vero细胞无血清培养基。方法以DMEM/F12为基础培养基,通过Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和Box-Behnken试验考察7种添加物胰岛素、人转铁蛋白、透明质酸、牛血清白蛋白、亚硒酸钠、表皮生长因子和高密度脂蛋白对Vero细胞生长的影响,以CCK-8测定的吸光度值(A490)为响应值,优化Vero细胞无血清培养基。用最优化的因子浓度配制的Vero细胞无血清培养基培养Vero细胞,对优化结果进行验证。结果通过Plackett-Burman试验筛选出胰岛素、牛血清白蛋白和人转铁蛋白对Vero细胞生长影响较大;采用最陡爬坡试验和Box-Behnken试验进一步优化,Design-Expert 8.06软件进行回归分析,得到胰岛素、人转铁蛋白和牛血清白蛋白的最佳浓度分别为5.625μg/ml、14.034μg/ml和3.92 mg/ml,在此优化条件下的A490值为2.3,较基础培养基提高了3.41倍。用最优的胰岛素、人转铁蛋白和牛血清白蛋白浓度配制的Vero细胞无血清培养基培养Vero细胞的A490值为2.148,为预测值的93.4%,符合度较高。结论应用DOE方法快速高效地优化了Vero细胞无血清培养基,为无血清培养基的研制奠定了基础。     

Vero细胞培养流感病毒的低血清培养基的筛选

目的筛选Vero细胞生长的最适低血清培养基,用于流感病毒的细胞培养。方法分别以MEM、M199、DMEM/F12、DMEM/F12与MEM混合物(1∶1)为基础培养基,添加5%、2%、1%的小牛血清传代培养Vero细胞,通过细胞形态观察、细胞计数及MTT法检测细胞的增殖活力筛选最适基础培养基;将流感病毒接种低血清适应的Vero细胞,检测病毒收获液的血凝效价及残留BSA含量,电子显微镜观察病毒形态。结果以DMEM/F12与MEM混合物(1∶1)为基础培养基,添加2%小牛血清培养的Vero细胞长势良好,细胞数量较多,增殖活力最强。低血清适应的Vero细胞培养的流感病毒血凝效价最高可达1∶512,平均值为1∶384;病毒液中的残留BSA含量约为正常血清培养条件下的1/18;病毒形态完整。结论成功筛选出Vero细胞培养流感病毒的低血清培养基,为更具生物安全性的流感疫苗的研发奠定了基础。     

Vero细胞无血清培养基的筛选及其培养流感病毒H5N1条件的优化

目的筛选适宜Vero细胞培养的无血清培养基,并优化其培养流感病毒H5N1的条件。方法取VP-SFM培养的Vero细胞(SFM-Vero),以增殖速率为指标,筛选无血清培养基[VP-SFM、EX-CELL~(TM) VERO、Virus Pro ~(TM) VERO、自制无血清培养基1(SFM-1)和2(SFM-2)];采用中心组合实验(Box-Behnken)优化SFM-Vero培养流感病毒H5N1的pH、TPCK-Trypsin浓度和病毒接种MOI。结果 Vero细胞在VP-SFM和自制SFM-1培养基中生长情况好于其他无血清培养基;H5N1病毒株能够感染无血清适应的Vero细胞;SFM-Vero培养流感病毒H5N1较优条件为:p H 7.64,TPCK-Trypsin浓度0.68μg/ml,MOI 0.01。在该条件下培养的流感病毒HA滴度可达768 HAU/50μl,为正常培养基培养的Vero细胞的2.33倍。结论筛选出适宜Vero细胞生长的无血清培养基,优化了流感病毒H5N1 Vero细胞适应株无血清培养的条件。     

轮状病毒在不同细胞上培养效果的比较

目的比较轮状病毒(rotavirus,RV)在不同细胞上的培养效果,确定RV最适培养细胞株。方法采用原代牛肾细胞(PCKC)、MA104细胞、CV-1细胞、Vero细胞4种细胞培养RV,观察RV在不同细胞培养过程中细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),并检测病毒收获液的病毒毒力及病毒RNA。结果 MA104和PCKC细胞较适宜RV的增殖培养,其次是CV-1细胞,而Vero细胞感染病毒后3 d才出现CPE,6 d才有约75%的细胞圆缩死亡,这时收获的病毒液滴度也不及前3种细胞的病毒收获液滴度,且收获液的病毒RNA电泳的条带较模糊。结论 MA104、PCKC、CV-1细胞较适宜RV的增殖培养,而应用于大规模生产疫苗的Vero细胞培养RV要想达到前3种细胞的效果,还需进一步完善感染和培养方法。     

乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上增殖条件的优化

目的优化乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上的增殖条件。方法以乙型流感病毒感染无血清悬浮培养的MDCK细胞,对培养条件中的MOI(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7)、胰酶终浓度(2. 5、5、7. 5、10、15、20μg/mL)、细胞接毒密度(50×10⁴、100×10⁴、300×10⁴、500×10⁴、700×10⁴个/mL)及病毒收获时间(24、48、72、96、120 h)进行优化。同时对流感病毒在贴壁培养及无血清悬浮培养MDCK细胞上的增殖情况进行比较。结果乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上最适增殖条件为:MOI为10^-2、胰酶终浓度为10μg/m L、细胞接毒密度为300×10⁴个/mL、病毒收获时间为72 h。流感病毒在...     

酪酸菌培养条件的优化

酪酸菌为人和动物肠道内正常菌群中的一种有益菌,能产生各种维生素,对人体具有保健作用,酪酸菌的芽孢是一种较理想有开发前景的微生态制剂。制备酪酸菌微生态制剂首先要实现酪酸菌的高密度培养,其次是获得较高酪酸菌芽孢转化率,本文对酪酸菌的培养条件进行了优化,取得良好的效果。     

无血清培养Vero细胞及其传代稳定性分析

目的建立无血清无动物源性培养基(virus production-serum-free medium,VP-SFM)培养Vero细胞的工艺,并分析其传代稳定性。方法采用VP-SFM适应培养Vero细胞,建立无血清无动物源性Vero细胞库,对细胞库进行常规检定;绘制VP-SFM培养Vero细胞的生长曲线;比较140、150、160代Vero细胞在VP-SFM中培养的比生长速率(μ)和分裂次数(Cd);比较142、147、153代Vero细胞在VP-SFM中培养的狂犬病病毒滴度;比较无血清与含血清培养140、150、160代Vero细胞的μ和Cd值;分别在250 ml spinner flask中加入2 g/L cytodexⅠ、在3 L生物反应器中加入3 g/L cytodexⅠ培养Vero细胞,观察细胞贴壁和生长情况。结果建立的无血清无动物源性Vero细胞库,细胞密度为4×10~6个/ml,冻存前细胞活率为100%,复苏后细胞平均活率为(94.20±3.95)%,无菌检查和支原体检查合格;细胞在VP-SFM中复苏传代后生长良好,经过24 h潜伏期后,进入对数生长期,第8天进入平台期,第12天达最大细胞密度20.5×10~5个/ml,并维持至第14天,活细胞数开始下降,最大μ值为0.025 4 h~(-1)。Vero细胞在无血清培养基中传代稳定性较好,140、150、160代Vero细胞在VP-SFM培养的μ和Cd值差异无统计学意义(P0.05);142、147、153代Vero细胞在VP-SFM培养的狂犬病病毒滴度差异无统计学意义(P0.05);140、150、160代Vero细胞在无血清和含血清培养基培养的μ和Cd值差异无统计学意义(P0.05)。在生物反应器微载体系统中,采用无血清培养基培养Vero细胞,细胞贴壁及生长状态良好。结论初步建立无血清、无动物源性物质的Vero细胞库,采用方瓶静置培养或微载体搅拌培养,细胞生长状态均良好,传代稳定性也较好。