A、B、E、F型肉毒抗毒素的制备与检定

目的　制备马抗肉毒 (Botulinum)A、B、E、F型抗毒素。方法　菌种经过复苏分离与检定后 ,采用产毒培养、酸沉、盐析及脱毒等步骤 ,制备肉毒A、B、E、F四型类毒素 (Toxoid)和试验毒素 (Testtoxin) ,免疫健康马匹。结果　各型血浆效价均超过 2 0 0 0年版《中国生物制品规程》中对于抗毒素的要求 ,B型与F型的效价均超过 2倍以上 ,A型与E型也达到较好的应答水平。结论　已成功制备四型肉毒抗毒素。     

A型肉毒毒素和A型肉毒神经毒素的非临床安全性评价

目的分析注射用A型肉毒毒素和注射用A型肉毒神经毒素活性药用成分(active pharmaceutical ingredient,API)的纯度、N-末端氨基酸序列和相对分子质量,并通过多个非临床研究试验,评价两种制品在药理、毒理特性等方面的一致性。方法采用SDS-PAGE法检测注射用A型肉毒毒素(衡力~,Lantox~,以下简称复合物)和注射用A型肉毒神经毒素(Chintox~,以下简称神经毒素)的纯度;对其N-末端氨基酸序列进行测序,并将测序结果与NCBI blast数据库中A型肉毒梭菌Hall株的氨基酸序列比对,确证其各组分的成分;毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis,CGE)检测其在非还原及还原条件下各组分的相对分子质量;单次肌肉注射、静脉注射、灌胃给予大鼠及单次肌肉注射给予食蟹猴的试验评价复合物和神经毒素的急性毒性;重复肌肉注射给予食蟹猴39周和恢复期12周的药理毒理试验评价复合物和神经毒素的长期毒性;家兔红细胞的体外溶血试验评价两者的溶血性;肌肉注射给予大鼠Ⅰ、Ⅱ段生殖毒性试验评价肉毒毒素的生殖毒性。结果神经毒素组:非还原条件下,神经毒素相对分子质量约152 000,N-末端氨基酸序列ALNDLQINVN,为完整的A型肉毒神经毒素;还原条件下,由相对分子质量约101 000,N-末端氨基酸序列ALNDLQINVN的重链和相对分子质量约51 000、N-末端氨基酸序列PFVNKQFNYK的轻链组成;复合物组:非还原条件下,含A型肉毒神经毒素(Mr 152 000)、非毒素非血凝素蛋白(non-toxic non-HA,NTNH)(Mr 136 000)、HA70组分(Mr 57 000、17 000)、HA33组分(Mr 30 000、28 000)和HA17组分(Mr 15 000),还原条件下,则含有重链、轻链、NTNH、HA70、HA33和HA17组分。注射用A型肉毒毒素、注射用A型肉毒神经毒素单次肌肉注射和静脉注射给予大鼠,肌肉注射的最大耐受剂量≥100 U/kg,静脉注射的最大耐受剂量≥30 U/kg;单次肌肉注射给予食蟹猴所产生的急性中毒反应与死亡情况一致,最大耐受剂量均为20 U/kg,近似致死剂量为40 U/kg;反复肌肉注射给予食蟹猴的试验中,未见明显毒性作用剂量(no observed adverse effect level,NOAEL)均为16 U/kg;在体外对家兔红细胞无溶血作用,不引起红细胞凝聚;Ⅰ段生殖毒性试验对雄鼠生育力的NOAEL为4U/kg,对雌鼠生育力的NOAEL为8 U/kg,对孕鼠早期胚胎发育的NOAEL为16 U/kg;Ⅱ段生殖毒性试验对孕鼠的NOAEL为1 U/kg,对胚胎-胎仔毒性和致畸性的NOAEL为16 U/kg。结论注射用A型肉毒毒素和注射用A型肉毒神经毒素在食蟹猴和大鼠的急性毒性、长期毒性等试验中,剂量、动物病理解剖结果一致,进一步说明A型肉毒毒素和A型肉毒神经毒素的药理毒理特性是相同的,且在反复肌肉注射给予食蟹猴的长期毒性试验中发现,A型肉毒神经毒素更不易产生抗体。在神经毒素灌胃试验中半数致死剂量高于复合物,表明其安全性更好。     

肉毒毒素及其疫苗研究进展

肉毒毒素是目前已知毒性最强的毒素,是引起食物中毒的常见细菌毒素之一,也是重要的生物战剂之一。本文对肉毒毒素的结构、作用机制及其疫苗的研制进行了综述。     

肉毒毒素生物学活性及肉毒中毒病原检测方法的研究进展

肉毒毒素生物学活性的检测和肉毒中毒诊断方法的研究进展迅速,对食品检验、肉毒中毒实验室诊断、生物反恐和肉毒毒素制品的开发及应用具有十分重要的意义。本文就肉毒毒素生物学活性及肉毒中毒病原检测方法的研究进展作一综述。     

肉毒毒素的应用现状

肉毒毒素是肉毒杆菌在生长繁殖中产生的一种神经毒素。注入肌肉后，能迅速与突触前胆碱能神经终板结合，减少周围运动神经末梢和神经肌肉接头处乙酰胆碱的释放，抑制细胞外乙酰胆碱，造成肌肉松弛和麻痹。20世纪70年代末肉毒毒素被开发并逐步应用于临床，以治疗某些神经肌肉疾思。目前，肉毒毒素已经用于眼科、神经科、康复科、消化科及皮肤科(多汗症、美容)等领域50余种病症的治疗，取得了诸多成果。本文就肉毒毒素在临床医疗、医学美容、生物农药等方面的应用情况进行了概述。     

B型肉毒毒素轻链蛋白的原核表达及纯化

目的克隆B型肉毒毒素轻链Bont-B基因,使其在大肠杆菌内表达,并对表达的重组蛋白进行纯化。方法设计并人工合成Bont-B基因,克隆入表达载体pMD19-T中,构建质粒pMD19-T-Bont-B,经酶切后与pET-28a载体连接,构建重组表达质粒pET-28a-Bont-B,将重组表达质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot分析后,经金属螯合层析Cu2+柱进行纯化,纯化产物经SDS-PAGE分析纯度。结果重组表达质粒pET-28a-Bont-B经PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约50 000,主要以可溶性形式表达,表达量约占菌体总蛋白的6%;纯化后的重组蛋白纯度可达90%以上。结论已成功克隆并在大肠杆菌BL21(DE3)中原核表达了Bont-B轻链基因,为制备抗Bont-B轻链单克隆抗体及研究肉毒中毒机制和治疗奠定了基础。     

A型肉毒毒素轻链蛋白的表达及纯化

目的构建A型肉毒毒素轻链表达载体重组质粒,在大肠埃希菌中表达后,利用金属螯合层析柱纯化。方法以p GEM-Bo NT/AL轻链质粒为模板,PCR扩增Bo NT/AL基因,克隆至表达载体p ET-28(a)中,构建重组质粒p ET-28(a)-Bo NT/AL,转化E.coli BL21(DE3),分别于37、30、25℃IPTG诱导表达,表达产物经Chelating Sepharose 4Fast Flow(Cu~(2+))层析柱纯化,纯化产物经尿素梯度复性。结果质粒p ET-28(a)-Bo NT/AL经酶切鉴定及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约52 000,主要以包涵体形式存在,37℃诱导表达量最高,占菌体沉淀总蛋白的41%;包涵体经2%Trition-X100和2 mol/L尿素洗涤后,可去除部分杂蛋白,8 mol/L尿素能溶解大部分包涵体;经再次浓缩后,蛋白浓度可达89μg/ml,纯度达90%。结论成功克隆及表达了Bo NT/A轻链基因,为制备抗Bo NT/A轻链单链抗体以及研究肉毒中毒机制和治疗方案奠定了基础。     

注射用A型肉毒毒素的生物学特性及质量分析

目的对注射用A型肉毒毒素(Botulinum toxin type A for injection,商品名衡力,出口商品名BTXA)制品中的活性药用成分(Active pharmaceutical ingredient,API)的性质及2009～2011年生产的注射用A型肉毒毒素原液的比活性进行分析。方法对BTXA收获物样品进行阴离子交换层析,分离毒素复合体各组分;采用血凝试验、HPLC法、SDS-PAGE、等点聚焦电泳及N-末端氨基酸测序等方法分析A型肉毒毒素复合体及其各组分的性质;统计2009～2011年连续生产的注射用A型肉毒毒素原液的比活性数据,分析连续生产的工艺稳定性和质量重现性。结果 BTXA收获物样品在碱性条件下可被解离,解离出的A型肉毒神经毒素相对分子质量约为150 000,无血凝效价;BTXA的API为完整的单体,纯度均在99.5%以上;复合物和神经毒素的等电点分别为4.97、4.91,N-末端氨基酸测序结果与GenBank基本一致;在连续3年的生产过程中,原液比活性平均为3.0×107LD50/mg蛋白,BTXA成品中API载量约为5 ng/瓶。结论注射用A型肉毒毒素的活性成分是特异的复合体结构,可在碱性条件下解离出A型肉毒神经毒素;BTXA原液的比活性在连续3年的生产中持续稳定,具备很好的连续性,为临床使用的安全性提供依据。     

针刺结合A型肉毒杆菌毒素治疗面肌痉挛疗效观察

目的探讨针刺结合A型肉毒杆菌毒素治疗面肌痉挛的疗效。方法对我院80例面肌痉挛患者采用针刺结合A型肉毒杆菌毒素进行治疗。结果本组完全缓解71例(88.75%),明显缓解7例(8.75%),部分缓解2例(2.5%)。发生面肌无力感8例,轻微上睑下垂5例,均于1个月内自然恢复,均无全身反应,肝功能及尿常规均未见异常。结论采用针刺结合A型肉毒杆菌毒素治疗面肌痉挛,简便易行,无全身反应,疗效维持时间长,费用低廉,患者易接受,值得临床推广。     

离子色谱法测定A型肉毒毒素及其胶塞中的氟

建立了离子色谱法测定注射用A型肉毒毒素与其覆聚乙烯-四氟乙烯膜氯化丁基橡胶塞中的氟离子。此方法线性范围为25～400 ng·mL^-1,r为0.9994,检测限为0.1 ng·mL^-1,定量限>0.3 ng·mL^-1,胶塞浸提液中氟离子回收率为83%～88%,RSD为2.4%,注射用A型肉毒毒素中氟离子回收率为88%～104%,RSD为5.9%。本文所建方法简单可行,且胶塞中迁移出的氟离子远小于注射用A型肉毒毒素中含有的氟离子,表明此胶塞有望作为注射用A型肉毒毒素的内包材。     

两种不同培养工艺制备森林脑炎灭活疫苗的免疫原性及安全性评价

目的评价细胞工厂工艺制备森林脑炎灭活疫苗的免疫原性及安全性。方法利用10 L转瓶和细胞工厂两种工艺在地鼠肾细胞上培养森林脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV),收获病毒液,经病毒灭活、超滤浓缩、柱层析纯化、除菌过滤后,制备森林脑炎灭活疫苗。采用透射电子显微镜及SDS-PAGE对病毒进行形态观察及鉴定。将两种工艺共制备的6批疫苗免疫小白鼠,评价疫苗的免疫原性;通过家兔刺激试验及豚鼠主动过敏性试验评价疫苗的安全性。结果两种工艺共制备的6批疫苗原液,透射电镜下观察均可见约为50 nm的圆形病毒颗粒,SDS-PAGE分析均可见相对分子质量分别为50 000和40 000～45 000的蛋白条带,病毒形态及蛋白条带大小均与TBEV相符;免疫保护指数均大于1. 0×10⁵,符合《中国药典》三部(2015版)标准;家兔刺激试验对注射部位无刺激性,豚鼠主动过敏试验无小鼠出现过敏性反应。结论细胞工厂工艺和10 L转瓶工艺制备的森林脑炎灭活疫苗均具有良好的免疫原性及安全性。     

不同生产工艺的水泥配制混凝土的性能研究

对比研究了不同工艺条件生产的P·II42.5R水泥与外加剂的相容性、不同水灰比条件下的胶砂强度、标准砂浆在不同养护条件下的干缩性能,以及配制相同工作性能与强度等级的混凝土时配合比与干缩性能的差异。结果表明,水泥与外加剂的相容性越好,胶砂强度越高,则配制相同工作性能与强度等级的混凝土时水泥与外加剂用量可以越少。本试验条件下,配制相同工作性能与强度等级的混凝土时,立窑水泥的总胶凝材料用量最大,从而导致立窑水泥配制的混凝土干缩最大。     

Transformation of a non-enzymatic toxin into a toxoid by genetic engineering

Curaremimetic toxins are typical non-enzymatic toxins that bind to their target [the nicotinic acetylcholine receptor (AChR)] through multiple residues. Nevertheless, we show that the concomitant substitutions of only three of the ten functionally important residues of such a toxin sufficed to cause an affinity decrease of the toxin for AChR that is higher than four orders of magnitude. Despite these triple mutations, the overall conformation of the mutated protein remains similar to that of a related recombinant toxin, as judged from both circular dichroism analysis and investigation of antigenicity, using monoclonal and polyclonal antibodies. Furthermore, we show that the detoxified toxin is capable of eliciting antibodies that neutralize the binding of a wild-type toxin to AChR. Therefore, transformation of a non-enzymatic toxin into a toxoid can be achieved, like in the case of enzymatic toxins, by introducing a small number of mutations at positions identified to be critical for expression of toxicity.      

不同形式脊髓灰质炎病毒颗粒的免疫原性

目的评价不同形式的脊髓灰质炎病毒(poliovirus,PV)颗粒的免疫原性。方法采用蔗糖密度梯度超速离心法分别将经56℃加热1.5 h处理和未经加热的PV进行分离纯化,收集相应组分,进行电镜观察及SDS-PAGE分析,并测定各组分的D抗原及蛋白含量。用不同PV颗粒组分分别免疫大鼠,均经腿部肌肉注射,共接种3次,每次间隔21 d,于免疫前和第1、2次免疫后21 d经眼眶采血,末次免疫后21 d经心脏穿刺采血,分离血清,微量细胞病变(CPE)抑制法检测血清中抗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型PV中和抗体几何平均滴度(GMT)。结果未经加热处理的PV可分离获得EP(蔗糖浓度16%~19%)和FP(蔗糖浓度22%~24.5%)两种病毒颗粒,电镜观察分别为空心颗粒和实心颗粒,EP经SDS-PAGE分析可见VP0、VP1和VP3病毒蛋白条带,FP可见VP1、VP2、VP3和VP4条带;经56℃加热处理的PV可分离获得HP(蔗糖浓度15%~17%)一种病毒颗粒,电镜观察为空心颗粒,SDS-PAGE分析可见VP0、VP1、VP2、VP3病毒蛋白条带。EP、FP免疫大鼠后,均可诱导产生针对PV的中和抗体,但EP诱导产生的中和抗体GMT低于FP;HP不能诱导产生中和抗体。结论未经加热的PV可分离获得EP和FP两种病毒颗粒,均具有免疫原性;经加热处理的PV仅分离获得HP一种病毒颗粒,不具有免疫原性。     

不同生产工艺制备水痘减毒活疫苗(VZV 84-7株)的比较

目的采用细胞工厂替代传统转瓶工艺制备水痘减毒活疫苗(VZV 84-7株)。方法分别用细胞工厂和3 L转瓶培养2BS细胞,制备水痘减毒活疫苗(VZV 84-7株)各6批,采用Countstar全自动细胞计数仪进行细胞计数,并以计数结果中的单位面积细胞数、成活率及消化后细胞的平均直径为指标,考察细胞质量,同时采用蚀斑法检测原液、成品及成品37℃放置7 d后(热稳定性)的病毒滴度。结果采用细胞工厂连续制备的6批2BS细胞的平均单位面积细胞数、细胞平均成活率均略优于3 L转瓶培养工艺,平均直径变动范围小于3 L转瓶;细胞工厂制备的6批疫苗,平均原液滴度为5.58 lg PFU/ml,平均成品滴度为4.78 lg PFU/0.5ml,37℃放置7 d后的平均病毒滴度为4.13 lg PFU/0.5ml,优于3 L转瓶。结论利用细胞工厂制备水痘减毒活疫苗(VZV 84-7株),可获得更高滴度病毒液,降低疫苗生产过程中的劳动强度及污染风险,并提高了疫苗产量及质量的稳定性,适合于水痘减毒活疫苗(VZV 84-7株)的规模化生产。     

Novel Lytic Enzyme of Prophage Origin from Clostridium botulinum E3 Strain Alaska E43 with Bactericidal Activity against Clostridial Cells

Clostridium botulinum is a Gram-positive, anaerobic, spore-forming bacterium capable of producing botulinum toxin and responsible for botulism of humans and animals. Phage-encoded enzymes called endolysins, which can lyse bacteria when exposed externally, have potential as agents to combat bacteria of the genus Clostridium. Bioinformatics analysis revealed in the genomes of several Clostridium species genes encoding putative N-acetylmuramoyl-l-alanine amidases with anti-clostridial potential. One such enzyme, designated as LysB (224-aa), from the prophage of C. botulinum E3 strain Alaska E43 was chosen for further analysis. The recombinant 27,726 Da protein was expressed and purified from E. coli Tuner(DE3) with a yield of 37.5 mg per 1 L of cell culture. Size-exclusion chromatography and analytical ultracentrifugation experiments showed that the protein is dimeric in solution. Bioinformatics analysis and results of site-directed mutagenesis studies imply that five residues, namely H25, Y54, H126, S132, and C134, form the catalytic center of the enzyme. Twelve other residues, namely M13, H43, N47, G48, W49, A50, L73, A75, H76, Q78, N81, and Y182, were predicted to be involved in anchoring the protein to the lipoteichoic acid, a significant component of the Gram-positive bacterial cell wall. The LysB enzyme demonstrated lytic activity against bacteria belonging to the genera Clostridium, Bacillus, Staphylococcus, and Deinococcus, but did not lyse Gram-negative bacteria. Optimal lytic activity of LysB occurred between pH 4.0 and 7.5 in the absence of NaCl. This work presents the first characterization of an endolysin derived from a C. botulinum Group II prophage, which can potentially be used to control this important pathogen.     

C型产气荚膜梭菌保护性抗原的免疫原性

目的研究C型产气荚膜梭菌α-β2-β1融合基因重组工程菌BL21(DE3)/pXETAB2B1抗原的免疫原性。方法在对重组工程菌BL21(DE3)/pXETAB2B1进行优化表达的基础上,制备包涵体粗提物、全细胞培养物及全细胞乳糖诱导培养物3种抗原,对ICR小鼠进行攻毒保护试验。结果重组工程菌BL21(DE3)/pXETAB2B1能够表达α-β2-β1融合蛋白,该融合蛋白能够有效刺激免疫小鼠产生特异性抗体,达到保护的目的。结论已获得具有一定免疫原性的重组工程菌,可作为预防产气荚膜梭菌所引起疾病的候选菌株。     

以白喉毒素无毒变异体蛋白CRM197和破伤风类毒素为载体的Y群脑膜炎球菌多糖结合物对小鼠的免疫原性

目的探讨以天然白喉毒素无毒变异体蛋白CRM197和破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)为载体的Y群脑膜炎球菌多糖(group Y meningococcal polysaccharide,MenYPS)结合蛋白对小鼠的免疫原性。方法将MenYPS用1,6-己二酰肼(1,6-adipic acid dihydrazide,ADH)进行衍生,制备MenYps-ADH衍生物,将MenYPS-ADH衍生物在碳二亚胺[N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDAC]的作用下,分别与CRM197和TT共价结合,制备3批MenYPS-CRM197和MenYPS-TT结合物,采用琼脂双扩散法检测结合物中多糖抗原的血清型特异性。经BALB/c小鼠大腿内侧皮下注射制备的衍生物及结合物,2.5μg/只,0、14、28 d各免疫1次,分别于第7、21和35天经小鼠眼眶采血,分离血清,ELISA法检测小鼠血清GMT。参考《中国生物制品规程》(2000版)进行无菌试验及异常毒性试验。结果制备的3批MenYPS-CRM197和MenYPS-TT结合物可与MenYPS诊断血清产生沉淀线。MenYPSTT和MenYPS-CRM197免疫小鼠3次后,均产生较高的滴度,MenYPS-TT和MenYPS-CRM197结合物第2、3次免疫小鼠后产生的GMT均明显高于MenYPS-ADH衍生物,差异有统计学意义(P均0.05),而两种结合物GMT差异无统计学意义(P均0.05);MenYPS-TT和MenYPS-CRM197结合物第2次免疫后产生的GMT均明显高于第1次免疫后,第3次免疫后明显高于第2次免疫后,差异均有统计学意义(P均0.01)。无菌试验符合《中国生物制品规程》(2000版)相关要求;异常毒性试验中,豚鼠和小鼠观察7 d后,均无异常反应,体重增加,无死亡。结论 MenYPS与CRM197和TT的结合物均能诱导BALB/c小鼠产生较高的抗体水平,且产生了免疫记忆。     

肉毒梭菌培养液澄清过滤工艺的优化

目的优化肉毒梭菌培养液的澄清过滤工艺,并对过滤效果进行验证。方法选择不同型号的过滤器组合对A型肉毒梭菌培养液进行一级、二级澄清过滤,筛选最佳过滤器组合;用最佳过滤器组合对扩大培养批量的A、B、E、F型肉毒梭菌培养液进行澄清过滤。结果 P700K+50P过滤器组合对A型肉毒梭菌培养液进行一级、二级澄清过滤的效果最佳;用该过滤器组合对扩大培养批量的A、B、E、F型肉毒梭菌培养液进行澄清过滤,各型均可达到预期的试验目标。结论筛选出P700K+50P为A、B、E、F型肉毒梭菌培养液澄清过滤的最佳过滤器组合,为肉毒梭菌培养液澄清过滤工艺的进一步优化提供了实验依据。