蔗糖密度梯度离心法纯化流感病毒工艺的优化

目的优化蔗糖密度梯度离心法纯化流感病毒的工艺参数。方法在不同进样量(600、700和800 ml)时,检测经蔗糖密度梯度离心纯化后各紫外检测峰的糖浓度、血凝滴度及卵清蛋白含量,并对血凝滴度大于1∶480的检测峰样品进行蛋白质含量和血凝素含量检测,确定最佳收峰位置、糖度范围及病毒浓缩液进样量;在不同比例的30%和50%的蔗糖溶液、不同离心时间(2、3和4 h)条件下对流感病毒浓缩液进行蔗糖密度梯度离心纯化,检测纯化后的病毒纯化液蛋白质、血凝素及卵清蛋白含量,计算蛋白质含量与血凝素含量比值及血凝素回收率,确定最佳离心时间。结果确定最佳收峰位置为第三峰,糖度范围为30%~50%之间;当病毒浓缩液进样量为600~700 ml时,30%蔗糖溶液进液量为450~550 ml,55%蔗糖溶液进液量为400~500 ml,转速为90 639×g离心3 h后,可获得最佳纯化效果。结论确定了蔗糖密度梯度离心法纯化流感病毒的最佳工艺参数,为进一步提高流感病毒的纯化效果提供了参考。     

两种方法纯化流感病毒的比较

目的比较两种方法纯化流感病毒的效果。方法取病毒原液,经超滤浓缩后,分别用Sepharose 4FF凝胶层析和蔗糖密度梯度离心法进行纯化,并对纯化产物进行检定。结果层析法的纯度、卵清蛋白及杂蛋白去除率略高于蔗糖密度梯度离心法,而蔗糖密度梯度离心法的病毒回收率优于层析法。结论两种方法均可用于流感病毒的纯化。     

脊髓灰质炎病毒颗粒分离纯化方法学评价

目的比较3种不同密度梯度离心方法对脊髓灰质炎病毒空心颗粒、实心颗粒的分离效果。方法选择蔗糖密度梯度离心、氯化铯密度梯度离心、Optiprep(碘克沙醇溶液)密度梯度离心方法,对脊髓灰质炎病毒进行纯化,抽取离心之后的蛋白条带,通过计算蛋白回收率、SDS-PAGE分析、病毒颗粒透射电镜观察,评价其对病毒空心颗粒、实心颗粒的分离效果。结果病毒液经蔗糖、氯化铯和Optiprep 3种介质超速离心,均能分离空心颗粒和实心颗粒。氯化铯密度梯度离心法蛋白回收率优于Optiprep及蔗糖密度梯度离心法;Optiprep密度梯度离心法蛋白纯度优于氯化铯及蔗糖密度梯度离心法。结论通过蛋白回收率、SDS-PAGE分析、病毒颗粒透射电镜观察初步评价了3种方法对脊髓灰质炎病毒空心颗粒和实心颗粒的分离效果,为脊髓灰质炎病毒分离纯化提供了参考。     

去氧胆酸钠裂解流感病毒的效果研究

目的　研究去氧胆酸钠对流感病毒最佳的裂解条件。方法　流感病毒在不同浓度的去氧胆酸钠作用一定时间后 ,经蔗糖梯度密度离心纯化 ,制备出流感裂解疫苗样品。以电镜观察病毒裂解情况和血液凝集反应 ,测定病毒效价作为评价指标 ,确定最佳裂解条件。结果　裂解纯化后的样品经电镜、SDS PAGE检测表明病毒颗粒完全裂解 ,裂解后的血凝效价收率约为 80 %。结论　 0 .8%的去氧胆酸钠作用 12 0min可使流感病毒达到最佳裂解效果。     

正交试验设计优化流感病毒纯化工艺

目的通过正交试验优化流感病毒蔗糖密度梯度离心纯化工艺条件。方法以影响流感病毒纯化效果的蔗糖溶液用量、上样量、超速离心时间及上样速度为试验因素,每因素设3个水平,通过正交试验设计9组试验。每组试验流感病毒浓缩液纯化后获得的样品进行血凝滴度及蛋白含量检测,计算血凝滴度收率和蛋白去除率;根据正交试验血凝滴度收率、R值及K值结果,确定最适纯化工艺参数。采用最适纯化工艺对中试3批流感病毒浓缩液进行纯化。结果正交试验结果表明,影响流感病毒纯化效果因素的重要性依次为超速离心时间、蔗糖溶液用量、上样量、上样速度,最适纯化工艺参数为超速离心时间3 h,30%蔗糖溶液用量500 mL/台,上样量为700 mL/台,上样速度为60 m L/min。3批中试病毒浓缩液纯化后的血凝滴度收率均 90%,满足工艺需求。结论采用正交试验获得的流感病毒纯化工艺适合于规模化生产。     

甲型流感病毒HA基因核酸疫苗表达载体的构建及表达

目的构建含有甲型流感病毒HA基因的核酸疫苗表达载体,转染COS-7细胞,并检测目的蛋白的表达。方法将甲型流感病毒New Caledonia/20/99(H1N1)接种鸡胚后,收获尿囊液,提取流感病毒总RNA,RT-PCR法扩增HA基因。经亚克隆后获得质粒pMD-T/HA,酶切鉴定后测序,将其与质粒pVAX1分别双酶切后连接,构建甲型流感病毒表达载体pVAHA。脂质体法转染COS-7细胞,并检测目的蛋白的表达。结果扩增出1700 bp片段,与预期的HA基因大小相符,测序结果与GenBank报道一致,酶切鉴定表明甲型流感病毒表达载体pVAHA构建正确,Western blot检测证明了流感病毒HA蛋白的表达。结论已成功构建了甲型流感病毒HA基因核酸疫苗表达载体pVAHA。     

纯化病毒疫苗的通用方法

各地药审部门近年要求提高疫苗的安全性，以降低副作用，纷纷强制改进病毒疫苗的生产和纯化方法。例如，流感病毒疫苗的生产正开始用VERO细胞取代鸡胚培养。纯化方法已放弃蔗糖密度梯度离心这类传统方法，而走向自动化程度更高、更易于在位清洗的超滤和液相层析技术。以下的人流感病毒疫苗纯化，是一种通用的病毒疫苗纯化策略。     

Benzonase酶去除流感疫苗中Vero细胞DNA条件的优化

目的优化非限制性内切酶Benzonase去除Vero细胞制备的H5N1流感疫苗中残余细胞DNA的条件,并结合两步柱层析法使疫苗中DNA残余达到质量要求。方法向H5N1流感病毒浓缩液中添加不同终浓度的Benzonase酶(10、20、30、40、50、60 U/ml),置于37℃酶解不同时间(0.5、1、1.5、2、2.5、3 h),经100 k D超滤离心管,用不同p H(7.10、7.30、7.50、7.70、7.90)的PBS进行洗滤浓缩。将Benzonase酶处理的病毒液经蔗糖密度梯度离心纯化,去除部分杂蛋白,电镜下观察病毒的形态。结合两步柱层析法进一步去除Vero细胞DNA。结果 H5N1流感病毒液经终浓度为10 U/ml的Benzonase酶,37℃处理2.5 h后,用p H为7.50的PBS溶液进行洗滤,其DNA去除率可达99%以上。Benzonase酶处理前后病毒形态一致,结构完整,轮廓清晰。在用酶处理去除原液中大部分Vero细胞残余DNA的基础上,结合两步柱层析法基本可使疫苗残余外源DNA达到100 pg/剂的限定标准。结论非限制性核酸内切酶Benzonase可高效降解H5N1流感病毒液中的DNA,此方法降低流感疫苗中Vero细胞DNA简单可行,大大降低了后续工艺去除DNA的压力,同时结合两步柱层析法可使疫苗中DNA残余达到限定标准,为以Vero细胞为基质大流行流感疫苗的研发奠定了基础。     

流感裂解疫苗纯化及裂解工艺的优化

目的优化大规模生产的流感病毒裂解疫苗的纯化及裂解工艺。方法比较凝胶层析和蔗糖密度梯度超速离心的纯化效果,以及TritonX-100和去氧胆酸钠两种裂解剂在不同条件下的裂解效果。结果层析法纯度稍高于蔗糖密度梯度超速离心法,而蔗糖密度区带超速离心法的收率优于层析法。TritonX-100的裂解效果优于去氧胆酸钠,裂解剂浓度为0.5%或0.8%,裂解3或4h,裂解率达90%以上。疫苗在4℃保存1年后,所有检测项目均合格,4℃保存18个月和37℃保存28d后,HA含量仍保持在30μg/ml以上。结论已建立了切实可行的流感病毒裂解疫苗规模生产的纯化及裂解工艺。     

流感病毒超滤工艺的优化

目的分析截留相对分子质量不同的超滤膜浓缩对流感病毒纯化效果的影响,以获得杂质含量低的高浓度病毒液。方法将H1N1、H3N2、Bv和By 4个型别流感病毒分别接种9~11日龄鸡胚,经(34±1)℃培养72 h后,收获尿囊液,经连续流离心获得澄清的病毒液后,再进行截留相对分子质量1 000 000、300 000的超滤膜及其两种超滤膜组合的超滤浓缩,测定超滤前后的总蛋白含量、卵清蛋白含量和血凝滴度。结果截留相对分子质量1 000 000的超滤膜超滤后,杂质去除率高,均在80%以上,截留相对分子质量300 000的超滤膜超滤后杂质去除率相对低,但后者病毒回收率较高,二者组合既能降低杂蛋白含量,又可提高病毒回收率。结论流感病毒鸡胚尿囊液采用截留相对分子质量1 000 000+300 000超滤膜组合超滤浓缩,病毒纯化效果较好。