植物乳杆菌M1-UVs29缓释微胶囊的制备及其缓释性能分析

目的制备植物乳杆菌M1-UVs29缓释微胶囊,并分析其缓释性能。方法以壳聚糖-海藻酸钠为壁材制备植物乳杆菌M1-UVs29缓释微胶囊,在单因素试验的基础上,采用三因素三水平的响应面分析法,以包埋率为响应值,依据回归分析确定最佳工艺条件,对模型进行验证,并检测微胶囊在模拟肠液中的释放效果。结果最佳工艺条件为:海藻酸钠浓度2.7 g/100 ml,壳聚糖浓度0.8 g/100 ml,Ca Cl2浓度2.0 g/100 ml。所制备的微胶囊累计释放时间达8 h左右。结论成功制备了植物乳杆菌M1-UVs29缓释微胶囊,其具有较好的缓释性能。     

培养基中氯化钠对百日咳杆菌CS株生长及百日咳毒素表达的影响

目的探讨培养基中氯化钠(Na Cl)对百日咳杆菌CS株生长及百日咳毒素(pertussis toxin,PT)表达的影响,确定最适PT表达的Na Cl加入方式。方法以MSS为起始培养基,补加不同浓度的Na Cl溶液,接种生产用百日咳杆菌Ⅰ相CMCC58003(CS株)后,分别于不同时间取样;分别于接种菌种后不同时间补加Na Cl至7.5 g/L,于培养结束时(39 h)取样;分别于接种菌种后0和25 h时补加Na Cl至7.5 g/L,培养不同时间取样。上述样品分别测定菌浓度及PT表达量。结果起始培养基中Na Cl浓度越高,细菌生长越缓慢,菌浓度增加时间也越长,起始培养基中Na Cl浓度为7.5 g/L时,培养上清中PT表达量最高,达6.61μg/ml,比对照培养基(MSS)提高了15.6%。培养过程中在25 h时补加Na Cl,培养结束时PT表达量最高,为8.64μg/ml,比对照培养基(MSS)提高了43.28%,比0 h时补加Na Cl提高了26.13%。在25 h时补加Na Cl后,细菌的菌浓度增长期比MSS培养基培养延长了2~3 h,比0 h时补加Na Cl缩短了1~2 h,菌浓度在培养的中后期明显高于0 h时补加Na Cl,PT表达周期与生长曲线基本平行,当细菌生长进入衰退期时,PT也随之开始逐步降解。结论在培养前期,可采用含2.5 g/L Na Cl的MSS培养基使菌体快速生长,当进入抗原PT表达期后,可通过补加Na Cl来提高PT转录活性,从而提高PT的产量。     

复合诱变选育新型高产细菌素植物乳杆菌

目的从东北传统发酵肉制品中分离和再诱变选育广谱高产细菌素的植物乳酸菌,并对其进行鉴定。方法四轮复合诱变[微波诱变、亚硝基胍(nitroso-guanidin,NTG)诱变、常压室温等离子体(atmospheric room temperatureplasma,ARTP)诱变、紫外诱变突]具有降胆固醇能力的的植物乳杆菌M1株,获得还可产生广谱细菌素的植物乳杆菌。对其进行稳定性、微生物形态特征、生理生化特征及PCR鉴定。结果原始菌株经四轮复合诱变后获得1株高产细菌素菌株,该菌株兼具遗传稳定性、优良发酵特性和抑菌功效。鉴定该菌株为植物乳杆菌,命名为M1-UVs300,其分泌的细菌素命名为M1-UVs301;菌株保藏号为CGMCC No. 7972。结论通过四轮复合诱变获得的植物乳杆菌M1-UVs300抑菌谱较宽,且兼具降胆固醇和防腐的优良加工特性,工业化推广前景广泛。     

短乳杆菌产胸苷磷酸化酶发酵培养基的优化

胸苷磷酸化酶在核苷类物质合成中具有重要作用,本研究以短乳杆菌为胸苷磷酸化酶生产菌种,对短乳杆菌产胸苷磷酸化酶发酵培养基进行优化。首先通过Plackett-Burman设计筛选出影响短乳杆菌产胸苷磷酸化酶的3个较为重要因素：发酵时间（P=0.030）、接种量（P=0.033）和葡萄糖浓度（P=0.019）。在此基础上采用最陡爬坡路径逼近最大响应区域,并利用响应面中心组合设计对影响显著因素进行优化,得到最适培养基组成成分和培养条件为：发酵初始pH 8.0,葡萄糖18 g/L,酵母膏15 g/L,NaCl 7.5 g/L,蛋白胨10 g/L,胸苷15 mmol/L,摇床转速110 r/min,发酵温度38 ℃,发酵时间10.57 h,接种量1.54%。在此优化条件下,短乳杆菌产胸苷磷酸化酶能力得到了很大提高,短乳杆菌胸苷磷酸化酶活从0.400 U/mg湿菌体提高到1.172 U/mg湿菌体,比优化前提高了2.93倍。蛋白质凝胶电泳分析显示经优化后每克湿菌体胸苷磷酸化酶的含量明显高于优化前。     

植物乳杆菌中胆盐水解酶基因的原核表达及纯化

目的克隆植物乳杆菌中胆盐水解酶(BSH)基因,原核表达并纯化重组蛋白。方法利用PCR技术扩增植物乳杆菌BSH基因,克隆至表达载体pET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行纯化及Western blot鉴定。结果重组表达质粒pET-30a-BSH经双酶切鉴定,可见961bp的目的基因条带。表达的重组蛋白相对分子质量约为40000(含6个His标签),主要以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的43%,纯化后,纯度达90%以上,且可与植物乳杆菌多克隆抗血清发生特异性反应。结论已成功克隆了植物乳杆菌中BSH基因,并在大肠杆菌中获得高效表达。纯化的重组蛋白纯度较高,为高效降解胆固醇的基因工程菌株的研究奠定了基础。     

有机酸对产丙二醇菌生长和生产的影响

为提高克雷伯氏肺炎杆菌厌氧发酵生产1,3-丙二醇的能力,在发酵过程中添加有机酸(OA),考察其对菌体生长、1,3-丙二醇及其他副产物合成的影响。实验表明:添加OA可促进菌体生长,加入质量浓度为0.2~0.5g/L的OA,菌体生长的菌液在590 nm处吸光度(OD)值比参照值高出30%;加入过量的OA(>1.0 g/L),则菌体生长受到抑制,OD值比参照值低37%;添加OA可促进单位细胞合成1,3-丙二醇,加入质量浓度为0.2~0.5g/L的OA,单位菌体的1,3-丙二醇质量浓度比参照高3.8%~17.5%;添加OA能提高甘油转化为1,3-丙二醇的转化速率,加入0.2~0.5 g/L的OA,甘油转化为1,3-丙二醇的最大转化速率达0.81 h-1。在15 L罐上批式发酵48 h,1,3-丙二醇最终质量浓度达42.9 g/L,甘油转化为1,3-丙二醇的平均转化率达64%。     

植物乳酸菌高密度发酵培养基优化

主要探索了如何提高植物乳杆菌高密度发酵活菌数,研究了培养基成分、pH值等发酵条件。结果表明:植物乳酸菌生长最适碳源是淀粉、葡萄糖,最适氮源是酵母浸粉;二价锰离子和无机盐对菌体的生长有促进作用;最适培养基组成:酵母浸粉3%,醋酸钠0.5%,柠檬酸三铵0.2%,磷酸氢二钾0.3%,氯化钠0.2%,吐温80 0.1%,硫酸锰0.3‰,硫酸镁0.2‰,无水葡萄糖2.2%,碳酸钙0.5%,淀粉4.4%。在5 L半自动发酵罐中,发酵16h左右,活菌数为8.9×1011 CFU/mL,发酵液保存周期较长,在75d跟踪检测中活菌数无数量级变化。     

大肠杆菌hCG核酸疫苗质粒扩增营养条件研究

采用摇瓶实验考察了营养条件对大肠杆菌hCG核酸疫苗质粒含量的影响。结果表明,甘油是质粒DNA生产的最佳碳源;C/N比对质粒DNA含量影响明显。向改良的PDM培养基中添加3 g.L-1的柠檬酸钠,可以降低糖酵解途径的代谢通量,使质粒含量达到11.73 mg.L-1,提高了20%。氟化钠是糖酵解途径的抑制剂,在菌体生长8 h后,向改良的PDM培养基中添加浓度为120 mg.L-1的氟化钠,培养后质粒DNA含量为12.09 mg.L-1,提高了29%。进一步研究发现乙醇对质粒DNA含量影响显著,在改良的PDM培养基中添加2 g.L-1的乙醇,可使质粒DNA含量达到12.94 mg.L-1,提高了32%。     

试验设计法优化肺炎支原体培养基

目的试验设计(design of experiment,DOE)法优化肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)培养基,以期提高MP产量。方法以MP(FH株)为试验菌株,PPLO培养基为基础,菌体蛋白含量为响应值,采用Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验及Box-Behnken试验对脑心浸液、水解乳蛋白、胨3号、精氨酸、小牛胸腺DNA、葡萄糖和胰蛋白胨7种培养基添加成分进行筛选及优化。以菌体蛋白含量及颜色变化单位(color change unit,CCU)为指标,验证改良培养基培养MP的效果。结果培养基各添加成分对MP生长影响作用大小依次为葡萄糖、胰蛋白胨、脑心浸液、精氨酸、月胨3号、水解乳蛋白、小牛胸腺DNA,最终筛选出脑心浸液、葡萄糖及胰蛋白胨3种添加物,最适浓度分别为5. 68、1. 34及2. 64 g/L。采用改良培养基培养MP 96 h时,菌体蛋白含量及CCU达最大,分别为851. 29μg/mL及10~9 ccu/mL。结论 DOE法实现了对MP培养基的优化,获得了影响MP生长的主要参数,提高了MP菌体产量。     

枯草芽孢杆菌出芽培养条件优化

探索了提高枯草芽孢杆菌产生芽孢的方法,使用单批一次投料培养法研究了培养基成分、p H值、培养过程中通气量及装液体积比对菌体产芽孢的影响。试验结果说明:枯草芽孢杆菌最适生长和产生芽孢的碳源是糖蜜,最适氮源是酵母浸粉;二价锰离子和无机盐对菌体的生长和产芽孢有很大影响。菌体生长和产芽孢的最适培养基组成:糖蜜1.0%,酵母粉0.8%,(K2HPO4+KH2PO4)0.5‰,Mn SO4 0.2‰;产芽孢的最适条件:开始培养p H值为7.0,最适装液量为20%(体积比)。在5L半自动发酵罐中,溶氧大于70%,发酵24 h后,芽孢数量为5.1×1011CFU/m L,出芽率为98.0%。