大鼠活化STAT蛋白抑制剂1基因重组腺病毒质粒的构建及鉴定

目的构建大鼠活化STAT蛋白抑制剂1(Protein inhibitor of activated STAT1,PIAS1)基因重组腺病毒质粒,并进行鉴定。方法应用RT-PCR法从大鼠胰腺腺泡细胞AR42J细胞株中扩增全长PIAS1基因,经T-A克隆后,亚克隆至穿梭质粒pDC316中,利用同源重组将腺病毒骨架质粒Nad5/F35和穿梭质粒pDC316-PIAS1共转染293细胞,获得重组腺病毒质粒Ad5/F35-PIAS1,经包装和扩增后,获得重组腺病毒。RT-PCR检测PIAS1基因的表达;荧光显微镜观察病毒感染情况;Western blot检测PIAS1蛋白的表达;并计算重组腺病毒的滴度。结果从AR42J细胞中扩增出1 956 bp的PIAS1基因片段,重组腺病毒质粒Ad5/F35-PIAS1经双酶切鉴定证明构建正确。RT-PCR及Western blot分析显示,PIAS1基因和蛋白已在293细胞中表达;荧光显微镜观察显示,重组腺病毒的感染率达90%;病毒滴度为4.45×1010 PFU/ml。结论已成功构建了大鼠PIAS1基因重组腺病毒质粒,为进一步研究PIAS1基因在相关疾病中的作用及其临床应用奠定了基础。     

CpG-ODN对肾小球肾炎进展的影响

目的观察CpG-ODN对肾小球肾炎进展的影响。方法将Wistar雄性大鼠随机分为N组(正常对照)、M组(模型对照)、CpG组和GpC组。N组大鼠经尾静脉注射生理盐水2.5ml/(kg·d),其余3组大鼠经尾静脉注射抗-thy1.1单克隆抗体2.5ml/(kg·d),隔日1次,共3次。注射抗-thy1.1单克隆抗体后,隔天,CpG组经尾静脉注射CpG-ODN,300μg/只,GpC组经尾静脉注射GpC-ODN,300μg/只,隔日注射,共3次。各组大鼠分别于用药前和第1针注射后1周测定尿蛋白;用药后第8周留取大鼠24h尿、血清及肾脏组织,检测24h尿蛋白定量、血清白蛋白和肾功;肾脏组织用于肾脏病理检查以及RT-PCR法检测TLR-9mRNA的表达。结果CpG组与M组和GpC组相比,血清白蛋白含量明显降低,且差异有显著意义;M组、CpG组和GpC组在给药后1周均出现尿蛋白,在给药后8周,24h尿蛋白含量明显增多;CpG组与M组相比,TLR-9mRNA在肾脏的表达水平明显增加,且差异有显著意义;GpC组与M组相比,差异无显著意义;光镜下可见CpG组肾组织病理改变明显加重。结论天然CpG-ODN可促进肾小球肾炎病情加重,TLR-9可能在其发生机理中起重要作用。     

狂犬病病毒磷蛋白重组人5型腺病毒的构建及鉴定

目的构建表达狂犬病病毒(rabies virus,RABV)BD06株磷蛋白(phosphoprotein,P)的重组人5型腺病毒,并进行鉴定。方法质粒p MD18-T-BD06P经双酶切后,获得完整的P蛋白基因,将其克隆至腺病毒表达系统穿梭质粒pac Ad5CMVK-Np A,构建重组穿梭质粒pac Ad5CMV-BD06P,与骨架质粒pac Ad5 9.2-100经PacⅠ酶切线性化后,共转染HEK293AD细胞,经同源重组,获得表达RABV P蛋白的重组人5型腺病毒r Ad5-BP。采用K覿ber法计算r Ad5-BP滴度,RT-PCR、Western blot、直接免疫荧光方法(direct immunofluorescence assay,d FA)检测P蛋白基因在HEK-293AD细胞的转录及表达水平。以107 TCID50r Ad5-BP肌肉注射免疫昆明小鼠,14 d后,经尾静脉采血,分离血清,IFA法检测抗RABVP蛋白抗体及其反应活性。结果经酶切及测序鉴定证明重组穿梭质粒pac Ad5CMV-P构建正确;重组腺病毒r Ad5-BP滴度可达108 TCID50/ml,能够介导P蛋白在HEK293AD细胞中的转录及表达,接种小鼠后可刺激机体产生针对RABVP蛋白抗体,且与RABV具有良好的反应活性。结论成功构建了RABVBD06株P蛋白重组人5型腺病毒,该病毒能够介导P蛋白在小鼠体内有效表达,刺激机体产生针对RABVP蛋白抗体,且与RABV具有良好的反应活性,为进一步研究RABV P蛋白在病毒感染过程中的作用奠定了基础。     

重组腺相关病毒介导克老素基因表达对2型糖尿病大鼠肾脏纤维化的作用及其机制

目的观察重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)介导的克老素(klotho,KL)基因表达对2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)大鼠肾脏纤维化的影响及其机制。方法将SD大鼠随机分为4组,随机选3组建立T2DM大鼠模型,分别经尾静脉注射rAAV.mKL(T2DM-mKL组)、rAAV.GFP(T2DM-GFP组)和PBS(T2DM-PBS组),正常对照(SD-PBS组)大鼠经尾静脉注射PBS,12周后,处死动物,收集肾脏组织标本,冰冻切片观察GFP,Masson染色观察肾脏组织病理变化及胶原纤维表达;免疫组化法检测各组大鼠肾脏组织中KL和波形蛋白(vimentin,VIM)的表达;RT-PCR法检测各组大鼠肾脏组织中Rho激酶(Rho associated coiled-coilforming protein kinase,ROCK)基因mRNA转录水平;Western blot法检测各组大鼠肾脏组织中ROCKⅠ蛋白活性。结果 T2DM-GFP组、T2DM-mKL组大鼠肾脏组织中GFP表达较强;T2DM-mKL组大鼠肾小球基底膜结构较清晰完整,肾小球系膜区及肾小管间质区胶原纤维明显较T2DM-PBS组和T2DM-GFP组减少;T2DM-mKL组KL蛋白的表达明显高于其他各组(P<0.01),VIM蛋白的表达明显低于其他各组,与T2DM-PBS组和T2DM-GFP组VIM蛋白的表达相比,差异有统计学意义(P<0.01);T2DM-mKL组ROCKⅠmRNA转录水平及其蛋白活性均明显低于T2DM-PBS组(P均<0.05)。结论 rAAV.mKL转染可明显增加T2DM大鼠肾脏中KL基因的表达,延缓糖尿病肾纤维化进程,其机制可能与KL抑制ROCK信号通路活性相关。     

氧化苦参碱对四氯化致大鼠慢性肾损伤保护作用的初步研究

将实验大鼠随机分为正常对照组、四氯化碳(CCL4)肾损伤模型组及氧化苦参碱组,各组动物分别造模并给药,8周后处死并检测血清中尿素氮(BUN)及肌酐(SCr)含量,计算肾脏指数,同时观察动物体重及摄食量变化情况。结果显示,模型组大鼠与对照组大鼠相比,尿素氮和肌酐均显著升高,分别为(7.30±1.44)mmol/L,(29.86±3.24)mmol/L;氧化苦参碱组大鼠与模型组大鼠相比,尿素氮和肌酐均降低,分别为(6.16±1.19)mmol/L,(21.63±5.26)mmol/L。     

间充质干细胞对急性肝衰竭的治疗及移植途径的优化

目的探讨脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)对急性肝衰竭大鼠的治疗作用及移植途径的优化。方法将48只SD大鼠随机分为4组:空白对照组、模型对照组以及移植治疗A、B组,每组12只,模型对照组和移植治疗组大鼠均经腹腔注射50%CCl4橄榄油溶液,造模后24 h,模型对照组经尾静脉注射1 ml生理盐水,空白对照组和移植治疗A组均经尾静脉注射1 ml hUCMSCs悬液,移植治疗B组经肝叶注射0.3 ml hUCMSCs悬液。移植治疗后多时间点收集血清,采用全自动生物化学分析仪检测白蛋白(albumin,ALB)、总胆红素(total bilirubin,TBil)和丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)含量;移植治疗后1和2周,采用Real-time PCR法检测各组大鼠肝组织中人CK8、CK18和AFP基因水平;移植治疗后3 d、1和2周,采用免疫组化SP法检测各组大鼠肝组织中人CK18蛋白的表达。结果移植治疗后24、48 h,移植治疗组与模型对照组相比,ALB、TBil和ALT含量差异有统计学意义(P均<0.05);移植治疗后1和2周,与模型对照组相比,移植治疗A和B组CK8、CK18和AFP基因水平均明显升高(P均<0.01),随造模时间的延长,基因水平也逐渐升高;移植治疗后3 d,大鼠肝脏组织中可检测到人CK18蛋白的表达,hUCMSCs在大鼠肝组织中诱导分化后,从汇管区向肝小叶中央迁移扩散;移植治疗A和B组的肝功能指标、移植细胞分化程度比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论hUCMSCs能促进急性肝衰竭大鼠肝脏的修复,同时自身能分化为具有肝细胞功能的类肝样细胞,经尾静脉注射移植与经肝叶注射移植疗效相似,前者更易于应用和推广。     

磷酸酶张力蛋白同系物基因shRNA重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建携带磷酸酶张力蛋白同系物(phosphoatase and tensin homolog,PTEN)基因的sh RNA重组腺病毒,并探讨其对犊牛肝细胞中PTEN基因m RNA表达水平的影响。方法在Lipofectamine 2000介导下,将4个PTEN基因的psh RNA转染原代犊牛肝细胞,筛选转染效果最佳的psh RNA,将其克隆至重组穿梭载体p Shuttle-EGFP-CMV中,构建重组穿梭质粒p Shuttle-GFP-PTEN-sh RNA,将构建正确的重组穿梭质粒及重组腺病毒骨架载体p Adxsi进行酶切并连接,构建重组腺病毒质粒p Adxsi-GFP-PTEN-sh RNA。将重组腺病毒质粒经Pac I酶切线性化后,转染人肾K293细胞,包装重组腺病毒Adxsi-GFP-PTEN-sh RNA,经3轮扩增,测定病毒滴度。荧光定量PCR法检测重组腺病毒对犊牛肝细胞中PTEN基因m RNA表达水平的影响。结果与空白对照组比较,psh RNA1和psh RNA3组中PTEN基因m RNA表达量分别下降了44%和68%(P<0.05,确定p GPU6/GFP/Neo-PTEN-sh RNA3为最佳转染质粒);重组腺病毒质粒p Adxsi-GFP-PTEN-sh RNA经酶切鉴定证明构建正确,经包装和3轮扩增,重组腺病毒AdxsiGFP-PTEN-sh RNA的滴度为1.2×1010 PFU/ml;转染Adxsi-GFP-PTEN-sh RNA 48 h后,犊牛肝细胞中PTEN表达量为空白对照组和阴性对照组的42%和51%(P<0.05)。结论成功构建了PTEN基因sh RNA重组腺病毒AdxsiGFP-PTEN-sh RNA,有效降低了犊牛肝细胞中PTEN的表达水平,为进一步探讨采用基因疗法防治奶牛脂肪肝奠定了基础。     

重组腺病毒载体pAd-4-hMASP-2的构建

目的 利用p Yr-adshuttle-4质粒构建重组腺病毒载体p Ad-4-h MASP-2。方法 应用PCR技术扩增甘露糖凝集素相关丝氨酸蛋白酶-2(human mannan-binding lectin associated serine protease-2,h MASP-2)基因,经Bam HⅠ和Eco RⅠ双酶切后与p Yr-adshuttle-4质粒连接,构建穿梭质粒p Yr-ads-4-h MASP-2,在LR酶作用下与腺病毒骨架载体p Ad/PL-DEST进行体外同源重组,获得重组腺病毒载体p Ad-4-h MASP-2,转染HEK293细胞,获得重组腺病毒r Adh MASP-2,应用酶切、PCR扩增及基因测序进行鉴定,并测定病毒滴度。将r Ad-h MASP-2感染小鼠,实时荧光定量PCR法检测h MASP-2基因m RNA在小鼠肺组织中的表达。结果 重组穿梭质粒p Yr-ads-4-h MASP-2经双酶切及测序证实构建正确,通过同源重组获得了重组腺病毒载体p Ad-4-h MASP-2,扩增出滴度为1.5×109 PFU/ml的重组腺病毒颗粒r Ad-h MASP-2,其能在小鼠肺组织中表达。结论 成功获得重组腺病毒载体p Ad-4-h MASP-2和重组腺病毒颗粒r Ad-h MASP-2,为体内外研究h MASP-2的活性提供了有效的转基因载体。     

双歧杆菌介导HSV-tk/GCV系统治疗大鼠膀胱癌的疗效

目的观察双歧杆菌介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-tk)/丙氧鸟苷(Gancyclovir,GCV)系统治疗大鼠膀胱癌的疗效,并初步探讨其可能的作用机制。方法采用N-甲基亚硝基脲(N-methyl-nitrosourea,MNU)膀胱灌注法建立大鼠膀胱癌模型,将模型大鼠随机分为3组,分别经尾静脉注射生理盐水、携带空载体pGEX-5X-1的双歧杆菌和携带重组质粒pGEX-tk的双歧杆菌(含婴儿双歧杆菌4.4×109个/ml),再联合腹腔灌注GCV(50 mg/kg)治疗,治疗结束后称量各组大鼠膀胱重量;TUNEL染色法检测各组大鼠膀胱组织细胞凋亡情况,RT-PCR和Western blot法检测各组大鼠膀胱肿瘤组织细胞色素C(Cyt-C)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(caspase-9)基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平。结果治疗后,双歧杆菌重组质粒组大鼠膀胱重量明显低于生理盐水对照组和双歧杆菌空载体组(P<0.001),膀胱组织细胞凋亡指数明显高于生理盐水对照组和双歧杆菌空载体组(P<0.001),膀胱肿瘤组织Cyt-C和caspase-9基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均明显高于生理盐水对照组和双歧杆菌空载体组(P<0.001)。结论双歧杆菌介导的HSV-tk/GCV治疗系统治疗大鼠膀胱癌疗效显著;该治疗系统可能通过以Cyt-C为中心的内源性凋亡途径导致膀胱癌细胞凋亡。     

microRNA沉默卡氏肺孢子菌主要表面糖蛋白基因对大鼠卡氏肺孢子菌肺炎的治疗作用

目的探讨靶向卡氏肺孢子菌(Pneumocystis carinii,PC)主要表面糖蛋白基因(Major surface glycoprotein gene,MSG)上游保守序列(Upstream conserved sequence,UCS)的microRNA重组质粒对大鼠卡氏肺孢子菌肺炎(Pneumocystis cariniipneumonia,PCP)的治疗作用。方法将SD大鼠经腹股沟皮下注射地塞米松磷酸钠7周,制备大鼠PCP感染模型。将模型大鼠随机分为5组:microRNA重组质粒治疗组(M组)、磺胺药物治疗组(H组)、生理盐水对照组(C1组)、空载体质粒对照组(C2组)和模型对照组(C3组),其中M组和C1、C2组经尾静脉分别注射含microRNA重组质粒pPC-UCS、生理盐水和空载体,H组用磺胺药物灌胃治疗,C3组不做处理,每日1次,疗程为7 d。1周后吉姆萨染色,油镜下计数大鼠肺组织液印片中PC包囊数;HE染色,光镜观察肺组织病理改变;ELISA法检测大鼠血清中IL-10和IFNγ的表达水平;RT-PCR法检测肺组织中PC MSG-UCSmRNA的表达水平;电镜观察PC的超微结构。结果与C1、C2和C3组相比,M组和H组大鼠肺组织PC包囊数均明显减少(P<0.05),肺组织炎症较轻,大鼠血清IL-10的表达水平均显著降低(P<0.05),而IFNγ的表达水平显著升高(P<0.05),大鼠肺组织PC MSG-UCS mRNA的表达水平均显著降低(P<0.05);电镜观察显示,M组和H组PC包囊表面均出现破损,C1、C2、C3组未发现破损。结论 microRNA重组质粒pPC-UCS对大鼠PCP有明显的治疗作用,为治疗PCP提供了新的思路。     

乙烯酮(双乙烯酮)下游产品废水的治理技术

乙烯酮(双乙烯酮)是十分重要的化工中间体,其下游产品较多。江苏某化工厂开发生产乙烯酮(双乙烯酮)下游产品三十多个,年生产规模三万多吨,是国内以乙烯酮(双乙烯酮)为中间体生产精细化学品的综合骨干企业。针对乙烯酮(双乙烯酮)下游产品废水特点,该厂结合企业实际,开展了产品优化,结构调整,清洁生产,资源循环利用,节水降耗等工作,从源头削减了污染物的生产。同时投资二千多万元新建预处理装置三套,6000m3/d废水生化处理装置一套,使全厂乙烯酮(双乙烯酮)下游产品的废水得到了有效的治理。     

分解炉扩径的技术改造

我厂3号回转窑(Φ4m×60m)生产线在1996年年底由SP窑(产量912t/d)改为NSP窑(产量1320t/d),预分解系统为四级旋风预热器带离线式分解炉     

基于组件技术的化工原理实验课件的设计

利用组件技术开发化工原理实验课件,给出了系统层、组件库层和应用层的架构划分。重点讨论了组件库的设计,给出了流体阻力这一典型实验的实现描述。实践证实,基于组件技术可以提高仿真实验的开发效率。     

水泥水化热测定方法综述

水泥水化热是中、低热水泥和核电工程用水泥的一项关键的技术指标。全球范围内测定水泥水化热的方法有溶解法、直接法/半绝热法、等温传导量热法三种。本文总结了中、美、欧相关方法标准,对其测试原理、仪器设备、试验过程等方面进行了比对,并对其在领域的应用做了简单的概括。     

几种乙炔加压设备性能的比较

阐述并比较了几种加压设备在乙炔加压清净过程中的性能和特点。     

A study of miscibility of blends of polybutadienes of varying microstructure

The miscibility of various amorphous polybutadienes with mixed microstructures of 1,4 addition units (cis, 1,4 and trans 1,4) and 1,2 addition units have been investigated. The studies here involved optical transparency, differential scanning calorimetry, and small angle light scattering. It was found that a 90 percent (cis) 1, 4 addition polybutadiene was immiscible with high (91 percent) 1,2 addition polybutadiene. Reduction of the 1,2 content to 71 percent induced an upper critical solution temperature (UCST) with the cis 1,4 polymer. Polybutadienes with 50 percent and 10 percent 1,2 contents were miscible above the crystalline melting temperature of the cis 1,4 polybutadiene. Immiscibility of the 91 percent 1,2 addition polymer was also found with a 10 percent 1,2 polybutadiene. The latter polymer also exhibits an UCST with the 71 percent 1,2 polymer. The results are used to interpret the characteristics of blends of polybutadienes of varying microstructure.     

粉煤灰中烧失量检测的不确定度分析

以F类粉煤灰为例,详细介绍了测定粉煤灰中烧失量的步骤、计算数学模型、影响测量不确定度的因素以及各项测量不确定度分量评定,人员、设备、材料、方法、环境都是影响测量不确定的因素。