热纤梭菌β-葡聚糖酶基因的克隆和表达

提取热纤梭菌(Clostridium.sp)基因组DNA,首次通过PCR克隆了该菌的β-葡聚糖酶基因全长。结果表明:该基因全长1040bp,ORF为1003bp,编码334个氨基酸,计算分子质量为37.8kD,等电点为7.67。经Blast分析,该序列与热纤梭菌同源性最高(99%),而与基因库中嗜热梭菌的同源性为94%,该基因已被GenBank接受(AY225318)。用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切目的片段和表达载体pET-30a(+)后相连接,构建重组表达载体pET-clo,并导入BL21细菌中表达。酶学特性表明:SDS-PAGE电泳在37kD左右有表达蛋白带,该工程菌最适酶活29.4U/mL,是出发菌的15倍,最适温度80℃,最适pH9。该工程菌可作为耐热性材料构建耐热性好、酶活高的杂合基因工程菌。     

β-1，4-葡聚糖内切酶基因在大肠杆菌中分泌表达

采用重叠延伸PCR合成技术将乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)分泌蛋白基因序列usp45(81 bp)和瑞氏木霉(Trichoderma reesei)β-1,4-葡聚糖内切酶成熟蛋白序列egl3(657 bp)连接成融合基因usp45-egl3,构建了分泌型重组质粒pMG36e-usp45-egl3及重组大肠杆菌E.coli DH5α/pMG36e-usp45-egl3。分析重组大肠杆菌的表达效果及表达产物降解纤维素的能力。结果表明,重组大肠杆菌DH5α/pMG36e-usp45-egl3经14 h培养能分泌酶活为226 mU/mL的β-1,4-葡聚糖内切酶,并有效地降解了羧甲基纤维素钠。其中分泌的β-1,4-葡聚糖内切酶降解羧甲基纤维素钠生成还原糖的速率为2.35 mg/(h·mL)。     

内切–β–1,4–葡聚糖酶基因在茌梨果实发育及成熟中的表达模式分析

本研究以茌梨(Pyrus bretschneideri Rehd.Cv.Chili)果实为材料,分析了内切-β-1,4-葡聚糖酶(EGase)基因Pb EG3和Pb EG4在果实发育及成熟衰老时期的表达模式。茌梨果实中Pb EG3和Pb EG4的基因表达量均于发育时期呈现峰值,其中,Pb EG3的基因表达量在花后70 d达到峰值0.31,花后130 d降至0.003;而Pb EG4的基因表达峰值于花后110 d出现,为0.14,花后130 d降为0.005,与EGase的活性变化趋势一致。0℃贮藏期间,茌梨果实中Pb EG3和Pb EG4的基因表达量均呈下降趋势,且二者均在采收点呈现最大值,其中Pb EG3于采后60 d表达量最低,之后表达量略有升高;而Pb EG4在贮藏期间的表达量均较低。采后乙酰水杨酸(ASA)处理能够减少茌梨果实的失重,抑制其可溶性果胶的增加,降低EGase活性,延缓纤维素的降解,从而推迟果实的成熟衰老进程。Pb EG3和Pb EG4可能与茌梨果实的生长发育有关,未参与其采后衰老进程。     

β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆与序列分析

依据GenBank中收录的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)β-1,3-1,4葡-聚糖酶基因序列,设计特异性引物,以提取的解淀粉芽孢杆菌基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)扩增获得758 bp的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bgl),将此目的基因克隆至pTG19-T Easy载体中,经PCR、限制性内切酶鉴定和克隆片段的序列测定、比较,结果表明该克隆片段扩增准确、可靠。序列比较发现,此片段与解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefacines,M15674)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis,D00518)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis,AY365256)分别有99%、95%和94%的同源性。     

黑曲霉内切β-1,4-半乳聚糖酶AghA的分子克隆与特征解析

利用内切β-1,4-半乳聚糖酶(endo-β-1,4-galactanase,EC 3. 2. 1. 89)水解土豆浆制备低聚半乳糖,有望解决产品回收率低的问题。为此,该研究通过分子克隆技术,将黑曲霉β-1,4-半乳聚糖酶基因agh A在毕赤酵母中进行克隆表达,构建获得了重组菌GS115(p PIC-aghA)。摇瓶培养条件下,重组酶Agh A的酶活为130 U/m L,高于大多数已报道的半乳聚糖酶的酶活。酶学性质的研究表明,该酶的最适反应pH值和温度分别为4. 5和45℃,且在pH 4. 0～6. 0或30～50℃具有较好稳定性。大部分金属离子和EDTA对重组酶Agh A的酶活没有显著影响; Fe3+对其活性有强烈的抑制作用;而Hg2+则可使Agh A几乎完全失活。该酶对半乳聚糖的最大反应速率Vmax和米氏常数Km分别为400 mg/(m L·min)和0. 08 mg/m L。此外,重组酶Agh A还可以水解土豆浆,产生半乳二糖、半乳三糖和少量半乳四糖等低聚半乳糖。     

嗜热地衣芽孢杆菌SR01葡聚糖酶基因的原核表达及酶学性质研究

从一株嗜热地衣芽孢杆菌SR01中克隆了β-葡聚糖酶的编码基因,并通过原核表达对重组酶的酶学性质进行了研究。结果显示,该酶编码基因ORF包含741bp,编码246个氨基酸,理论分子量为28.03ku,等电点为6.42。在温度30℃、浓度0.05mmol/L条件下IPTG诱导4h,重组蛋白得到显著表达。酶的最适反应温度、pH值分别为55℃、pH6.0~7.0;在温度40~90℃、pH5.0~10.0条件下具有良好的稳定性。Cu2+、Fe2+、Ca2+、Ba2+、Mn2+、EDTA对该酶有不同程度的抑制作用,K+、Na+对该酶起轻微的激活作用。该酶对体外模拟胃肠环境具有较好的耐受性,在模拟胃液中放置90min仍有80%左右的活性,胰液对该酶有一定的激活作用。     

嗜热内切-1,4-β-木聚糖酶在枯草杆菌中的表达及酶学性质

首先根据Thermopolyspora flexuosa的内切-1,4-β-木聚糖酶基因设计了引物,PCR扩增成功后进行酶切消化,连接载体质粒pHT43,经大肠杆菌DH5α扩增后,挑选阳性克隆,经菌体PCR及测序验证后,将基因序列测序正确的质粒大量抽提,经过转化导入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilius WB800N宿主,培养并经过1 mmol/L IPTG诱导表达后,发酵胞外上清经SDS-PAGE电泳证明重组蛋白质成功获得表达。其相对分子质量为27 kD,最适反应温度为80℃,最适反应pH为6.0。由此得知,分泌表达的嗜热内切-1,4-β-木聚糖酶的枯草芽孢杆菌工程菌株构建成功,这为未来该酶的产业化生产奠定了基础。     

毕赤酵母中内切β-1,4葡聚糖酶的表达及共培养制备低分子质量黄原胶

低分子质量黄原胶具有抑菌、益生及抗氧化等多种生物活性,因此通过水解制备低分子质量黄原胶具有广阔应用前景。该研究将来源于绵羊瘤胃元基因组的内切β-1,4-葡聚糖酶首次在毕赤酵母中表达,其在pH 7.0和75℃下发挥最佳作用,并有较高的pH和温度稳定性。此后,建立了毕赤酵母和野油菜黄单胞菌的共培养体系并对发酵条件进行优化,其中野油菜黄单胞菌生成的黄原胶可以被毕赤酵母分泌的内切β-1,4-葡聚糖酶直接降解产生低分子质量黄原胶。摇瓶水平下,共培养体系中总糖最高为11.4 g/L,水解产物中重均分子质量为2 500 Da的低分子质量黄原胶达到93.79%。该研究为功能性低分子质量黄原胶的工业化生产提供了一个潜在的策略。     

嗜热β-葡聚糖酶产生菌的筛选及其培养基优化研究

以大麦β-葡聚糖为唯-碳源,从吐鲁番地区采集的土样中筛选到1株热稳定性β-葡聚糖酶产生菌株XTP-5,经初步鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).对该菌株产酶培养基优化实验结果表明:最佳培养基配方:麦糟粉20g/L、酵母粉4/L、K<,2>HPO<,4>1.0WL、NaC10.5 g/L、FeSO<,4>·7H<,2>O 0.01g/L、MgSO<,4>·7H<,2>O 0.5g/L、(NH<,4>)2SO<,4> 2.0g/L、Tween-80 0.06%.接种上述液体培养基(pH7.0)中,于37°C、180 r/min摇瓶培养60h达到产酶高峰,酶活力可达9.52 U/mL.     

黑曲霉DL08内切葡聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质研究

通过反转录PCR(RT-PCR)从黑曲霉(Aspergillus niger)DL08中提取内切葡聚糖酶基因(GeneBank No.KJ437592),PCR测序表明该基因全长999个核苷酸,编码332个氨基酸,预测相对分子质量为36.75 kDa,等电点(pI)为4.38,命名eg1。结构域分析表明,该蛋白包括18个氨基酸构成的信号肽和C末端1个糖基水解酶家族5的催化结构域。重组内切葡聚糖酶蛋白通过Ni-NTA亲和层析柱纯化,酶学性质研究表明,以羧甲基纤维素钠为底物时重组酶最适作用pH为5.0,最适作用温度为45℃。通过薄层层析法检测重组内切葡聚糖酶酶解1%羧甲基纤维素钠的产物,主要为连续寡糖。这些特性为纤维素酶酶解纤维素生产生物化学品和可再生生物燃料提供技术参考。     

嗜热β-葡聚糖酶产生菌的筛选及其培养基优化研究

以大麦β-葡聚糖为唯一碳源,从吐鲁番地区采集的土样中筛选到1株热稳定性β-葡聚糖酶产生菌株XTP-5,经初步鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。对该菌株产酶培养基优化实验结果表明:最佳培养基配方:麦糟粉20g/L、酵母粉4/L、K2HPO41.0g/L、NaCl0.5g/L、FeSO·47H2O0.01g/L、MgSO·47H2O0.5g/L、(NH4)2SO42.0g/L、Tween-800.06%。接种上述液体培养基(pH7.0)中,于37℃、180r/min摇瓶培养60h达到产酶高峰,酶活力可达9.52U/mL。     

重组β-葡萄糖苷酶基因和内切葡聚糖苷酶基因在大肠杆菌中的共表达

β-葡萄糖苷酶和内切葡聚糖苷酶是纤维素酶的重要组分,多基因的共表达在各领域有重大的应用价值,本研究利用pET32a和pET30b两个载体的不同抗性的特性,在大肠杆菌中将β-葡萄糖苷酶基因和内切葡聚糖苷酶基因,实现了不相容性共表达,获得了产两种酶的工程菌,酶活力可达1196.8U/mL。比单一酶组分的酶活力高,酶学性质分析显示共表达酶的最适反应pH为6.0,最适反应温度60℃,在pH5⁷范围内能保持较高活性,酶活可达最高酶活的80%以上,在30⁶0℃范围能有较高的温度稳定性,酶活维持在80%以上。这一结果将为工业应用的进一步研究提供理论基础。      

黑曲霉内切β-葡聚糖酶的纯化和性质

黑曲霉(Aspergillus niger)的粗酶滤液经过硫酸铵沉淀和四种色谱CM-Sephadex C-50离子交换色谱、DEAE-Sephadex A-50离子交换色谱、POROS 20 HQ离子交换色谱和TSK-G3000SW凝胶色谱,从中提纯了一个新的内切β-葡聚糖苷酶该酶经SDS-PAGE电泳检测分子量为36.0KD,该酶活力的最适温度为70℃,最适pH值为3.6 纯化后的该酶只能降解羧甲基纤维素,不能降解微晶纤维素,对蔗糖、麦芽糖和纤维素也不起作用。其N-末端部分氨基酸序列为V F E W F G C N E C G A E F Tx N I P G。     

裂褶菌产内切β-1,3-葡聚糖酶的特性研究

对裂褶茵所产内切β-1,3-葡聚糖酶进行有效分离纯化并用电泳法对其纯度进行鉴定,进而研究其酶学特性.结果表明:经过DEAE-Sephadex A-50离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤分离纯化得到电泳纯分子量约为45 kD的内切β-1,3-葡聚糖酶,其最适pH为5.0,最适温度为45℃;Fe<'2+>、B...     

米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质分析

根据NCBI(GenBank Accession No.:D83732.1)中注册的米曲霉内切葡聚糖酶CelB基因序列设计引物,以本实验室自行筛选的天然米曲霉基因组DNA为模板,PCR高保真扩增出内切葡聚糖酶基因eg,将其定向插入到酵母表达载体pPICZαA上,转化酵母宿主菌X33,刚果红水解圈筛选结果表明已成功表达。SDS-PAGE分析表明,表达产物分子量约为65 ku。对酵母表达工程菌X33-eg进行发酵条件优化,结果显示最适甲醇诱导浓度为0.75%,用1 L三角瓶诱导培养5天达到最高酶活120 U/mL。对重组酶的酶学性质分析表明,其最适反应pH值和温度分别为pH4.0和45℃,在30～45℃和pH3.4～pH6.9范围内可保持内切葡聚糖酶最高酶活力70%以上。     

内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质

利用A¨KTA UPC-900快速蛋白液相色谱系统(FPLC)从黑曲霉发酵粉中分离纯化出内切β-葡聚糖苷酶。分离纯化后的酶比活力提高了8.1倍,回收率为7.5%。经SDS-PAGE电泳分析该内切酶的相对分子质量为26 400。酶学试验研究表明:该酶的最适反应温度为55℃,最适pH为4.8,Lineweaver-Burk法求得动力学参数,Km和Vmax分别为6.838×10-3mg/mL、2.906×10-2(mL.min)/mg。并确定了FPLC层析缓冲液的离子强度为4.8 mmol/L时分离效果达到最佳。     

裂褶菌产内切β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化

采用不同饱和度的硫酸铵溶液对内切β-1,3-葡聚糖酶粗酶液进行分段盐析,以确定最佳盐析条件,将盐析处理后的酶液经透析浓缩、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤层析等进一步分离纯化,浓缩纯化后的含酶组分,经过SDS-PAGE电泳分析其纯度并初步确定其分子量。结果显示:经过纯化后的内切β-1,3-葡聚糖酶的比活力由20.90U/mg提高到933.37U/mg,纯化倍数为44.7倍,酶活回收率为11.6%,电泳分析呈单一条带,分子量近似为45ku。     

高产嗜热β-葡聚糖酶菌种的诱变选育研究

以嗜热β-葡聚糖酶产生菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis XJ-Li)X-5为出发菌株,采用紫外线(UV)和硫酸二乙酯(DES)复合诱变处理技术,选育出一株产嗜热β-葡聚糖酶性能稳定、活力较高的突变株AS35.在同等摇瓶发酵条件下,其产酶活力达15.83 U/mL以上,较原始出发菌株提高了81.54%.同时,经连续7次传代保存,产酶性能未出现较大的变异,表现出良好的遗传稳定性,极有潜力改良为工业化生产菌种.     

酿酒酵母表面展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶学性质研究

固定化酶是酵母表面展示技术的1个重要应用方向。本文应用食品级酵母展示表达系统进行表达,成功获得具有生物活性且固定在酿酒酵母细胞表面的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,并测定其酶学性质。结果表明,与分泌表达的自由酶相比,展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质发生了改变。其最适温度为60℃,热稳定性增强。50℃保温3 h,对酶活几乎没有影响。60℃保温1 h后的酶活为初始酶活的129.2%。随着该温度下保温时间的延长,酶活迅速下降,保温3h后的酶活为初始酶活的64.6%。70℃保温1 h,酶活增加到初始酶活的109.2%;1 h后酶活开始下降;70℃保温3 h后残留酶活仅为初始酶活的35.8%。展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶最适pH为6.0,在pH 4~7范围内酶的稳定性较好。     

极耐热内切葡聚糖酶Cel12B的高效表达

海栖热袍菌 Thermotoga maritima 是嗜极端高温的厌氧细菌,其产生的极耐热葡聚糖酶具有很好的热稳定性和潜在的可观工业用途。但嗜高温菌基因在大肠杆菌中表达水平较低,T．m 内切葡聚糖酶 Cel12B 基因带有信号肽,应用在线预测分析,通过 PCR 方法分别克隆 Cel12B 完整基因和不带信号肽基因至 pET-20b 载体, 构建重组质粒 pET-20b-Cel12B 和 pET-20b-Cel12B-WS,转化至大肠杆菌 JM109DE3诱导表达后,分析酶活,结果表明去除信号肽重组菌单位酶活是未去除信号肽重组菌11倍多。