PCR鉴别猪鸡兔肉方法的建立与应用

建立一种快速准确鉴别生鲜猪肉、鸡肉和兔肉,以及混合或加工过的肉制品中这3种肉成分的方法。以猪肉、鸡肉和兔肉的线粒体细胞色素b基因为特征靶基因设计3组特异性引物对:F/R猪、F/R鸡和F/R兔,通过PCR得到特异性扩增片段,分析电泳图中是否出现目标条带,进而检测肉样是否掺假。结果表明,所设计的引物特异性良好,猪肉DNA扩增后产生331 bp的特异性条带,鸡肉DNA扩增后产生148 bp的特异性条带,兔肉DNA扩增后产生258 bp的特异性条带,而其他肉类未见该特异性条带。该方法准确、稳定,可为猪肉鉴别真假提供技术支持。     

基于微管蛋白基因的烟草根黑腐病菌分子检测

建立一种烟草根黑腐病菌新靶标的分子检测方法。以β-微管蛋白基因为靶标设计了特异性引物Tbas-tub2F/Tbas-tub R用于根黑腐病菌的PCR检测,对其检测特异性、灵敏度、早期诊断技术进行了测试。结果显示,只有根黑腐病菌能扩增到一条254 bp的特异性条带,其他19种真菌、卵菌及阴性对照均无扩增产物,表明该对引物能特异性地检测根黑腐病菌。该引物对根黑腐病菌基因组DNA检测的灵敏度为10 fg/μL。Tbas-tub2F/Tbas-tub R可从接种侵染24 h后的烟草组织中检测到根黑腐病菌,从而对根黑腐病进行准确的早期诊断。开发了烟草根黑腐病菌新靶标的分子检测和早期诊断技术。     

黄瓜细菌性萎蔫病菌分子诊断研究

从田间黄瓜细菌性萎蔫病植株分离获得病原菌,比对其近源种的16S rDNA序列,确定该病原菌为嗜维管束欧文氏菌(Erwinia tracheiphila),并设计出特异引物ET-P1/ET-P2.经过对该引物的PCR扩增条件优化,扩增出一条794 bp的黄瓜细菌性萎蔫病菌特异条带,检测灵敏度达100 fg/μL,可准确扩增出黄瓜发病植株和根围土壤中的DNA片段.     

基于致病基因靶点的PCR法特异性检测土壤青枯菌

利用分子生物学手段,以R.solanacearum染色体上的16S rDNA ITS以及毒性质粒携带的致病性相关基因fliC为靶点,分别设计5对序列特异性引物,筛选得到了特异性扩增16SrDNA ITS保守序列的引物对RaITS-1/2以及特异性扩增病菌fliC基因片段的引物对RalfliC-F/R.比较这两对引物的扩增灵敏度、稳定性和特异性可以发现,它们均能够稳定、快速、灵敏地检测青枯菌DNA,检测灵敏度可以达到10 fg DNA/μL.在此基础上成功构建了直接检测土壤青枯菌DNA的PCR检测技术体系.     

FTA滤膜与多重PCR结合检测肉中3种食源性致病菌

采用FTA滤膜从肉中直接提取模板DNA,根据金黄色葡萄球菌的nuc基因、沙门氏菌的IpaB基因、福氏志贺氏菌的ipaH基因设计3对特异性引物,进行多重PCR检测.结果表明,3对引物能特异性扩增出210、280、393bp大小的目的条带;在不增菌的情况下,多重PCR同时检测肉中3种致病菌的灵敏度均为102 cfu/g,检测时间6 h.该检测方法准确、快速、高效,为同时检测肉中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、福氏志贺氏菌奠定了基础.     

基于16S rRNA基因序列鉴定秘鲁茎柔鱼和澳洲双柔鱼

通过对秘鲁茎柔鱼及澳洲双柔鱼的线粒体16S rRNA基因片段进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增和序列比对,确定2 种柔鱼品种的特异性位点,并由此设计品种特异性引物。利用多重PCR体 系对秘鲁茎柔鱼和澳洲双柔鱼进行快速、准确地鉴定和区分,并对该体系的灵敏度进行检验。结果表明：在多重 PCR体系下,秘鲁茎柔鱼和澳洲双柔鱼分别扩增出长度400、229 bp的品种特异性条带,2 种柔鱼的混合样品则同时 扩增出长度400、229 bp的条带;且该多重PCR体系可以检测澳洲双柔鱼中1%秘鲁茎柔鱼的掺入,检测限为0.1 ng。     

中药材五灵脂特异性PCR鉴别方法的研究

目的建立快速检测五灵脂中药材动物源性成分的特异性PCR法。方法从NCBI数据库下载复齿鼯鼠及相关混伪品的16S rDNA序列,通过比对获得特异性DNA片段,设计特异引物,从复齿鼯鼠的干燥粪便中提取DNA,优化PCR扩增条件,通过特异性、灵敏度实验验证,建立特异性PCR检测体系。结果 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后扩增出一条340 bp左右条带,而其他样品在相同条件下无扩增条带,该引物的灵敏度可达4.43ng/μl。对15种市售药材的检测结果证明该方法简便可行。结论此PCR法可快速鉴别五灵脂,不受材料和干燥程度的影响,具有操作简便、快速、特异性高的优点。     

PCR法快速检测耐热霉菌雪白丝衣霉

以耐热性霉菌——雪白丝衣霉为研究对象,根据Gen-bank公布的beta-tubulin基因序列,设计两对引物,经过PCR筛选,确定引物Bn-1用于建立雪白丝衣霉的PCR检测方法。对PCR法的扩增条件退火温度和引物浓度进行优化,59℃的退火温度和0.2μM/PCR反应体系的引物浓度为最佳条件;考察该PCR方法的灵敏度和特异性,基因组DNA的灵敏度为1ng/PCR反应体系,检测特异性好。该方法为雪白丝衣霉的快速检测提供了一种重要的技术手段。     

多重PCR快速检测婴幼儿奶粉中的病原菌

为了建立同时检测婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌的多重PCR方法,根据阪崎肠杆菌ompA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、蜡样芽孢杆菌hblA基因分别设计3对引物进行多重PCR扩增,并对反应条件进行优化。结果多重PCR扩增出长度为514、156、235bp的特异性目的条带。不增菌的情况下,多重PCR同时检测3种病原菌的灵敏度是103cfu/mL,3种病原菌在奶粉中的检出限是104cfu/g。建立的多重PCR反应准确、快速、高效,为同时检测婴幼儿奶粉中的阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌提供了新方法。     

德尔卑沙门氏菌血清型分子检测靶点筛选及多重PCR检测方法的建立

利用比较基因组技术筛选到德尔卑沙门氏菌(Salmonella Derby, SD)的血清型特异性基因,以此为靶点设计引物与139-141引物共同构建多重PCR检测体系,对其特异性、菌落灵敏度、抗干扰能力及人工污染等方面进行评价。当扩增出171、284和512 bp电泳条带时,检测结果为阳性。通过该方法检测39株沙门氏菌和18株非沙门氏菌,表现出100%特异性,该检测体系的DNA灵敏度为383.2 pg/μL,菌落灵敏度为52 CFU/mL。当SD与自然(猪肉、鸡肉和牛肉)的背景菌群浓度比为1∶10~4时,该检测体系能获得清晰、准确的3条扩增条带。在人工污染的猪肉、鸡肉和牛肉样品的检测中,增菌10 h,检测灵敏度为3.8 CFU/25g。该检测方法准确灵敏的检测SD,可在食品安全领域得到广泛应用。     

烟草五种土传病原菌的多重PCR快速检测

【目的】建立一种可同时检测烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica）、青枯病菌（Ralstonia solanacearum）、立枯病菌（Rhizoctonia solani）、根腐病菌（Fusarium oxysporum）和根黑腐病菌(Thielaviopsis basicola)5种烟草重要土传病原菌的五重PCR快速检测方法。【方法】筛选5种病原菌的特异性引物组合,通过不同的引物浓度和退火温度对多重PCR体系进行优化,检测体系的灵敏度,并对土壤和植株样品进行测试,验证其实用性。【结果】根据青枯病菌fliC基因、立枯病菌RPB2基因、根腐病菌COI基因以及根黑腐病菌TEF1基因设计特异性引物,并结合已报道的黑胫病菌parA1基因的特异性引物,成功建立5种烟草土传病害的多重PCR检测方法。反应体系(25μL):Sf1/Sr1、Ff1/Fr1、Pf1/Pr1每条引物分别0.3μL,Rf1/Rr1每条引物各1.8μL,TBf1/TBr1每条引物各1μL,2×PCR Mix 12.5μL,退火温度为58℃,灵敏度可达到100 pg/μL。【结论】本研究建立的多重PCR体...     

基于RAPD分子标记的烟草青枯病菌特异引物筛选及效果评价

为建立烟田土壤和烟株烟草青枯病菌的快速诊断方法,本研究采用RAPD方法筛选获得了6对可用于烟草青枯病菌PCR检测的特异性引物.经对6种细菌(烟草青枯病菌、多粘芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、节杆菌、荧光假单胞菌、野火病菌)和2个烟草品种(中烟100和云烟87)的检测验证,6对引物均具有良好的灵敏度、特异性和可靠性.对青枯菌菌液...     

多重PCR快速检测三种食品病原菌

建立一种快速、经济、实用的可以同步检测食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的方法。根据金黄色葡萄球菌的nuc基因,沙门氏菌的invA基因,小肠结肠炎耶尔森氏菌的ail基因,分别设计了三对引物,对单个基因PCR和单管多重PCR扩增进行特异性、灵敏性实验以及优化反应体系。三对引物能特异性扩增出236、475、127bp的目的条带。建立的多重PCR同时对3种食源性致病菌进行检测具有较高的灵敏度,灵敏度金黄色葡萄球菌为102CFU/mL、沙门氏菌为102CFU/mL、小肠结肠炎耶尔森氏菌为102CFU/mL。初步建立能同步、简便、快速、灵敏地检测食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌的三重PCR方法。     

多重位点特异性PCR快速检测牛肉中常见掺假动物源性成分

目的:基于动物线粒体cytb基因的多态性位点,建立一种特异性多重PCR体系检测牛肉、猪肉和鸡肉的方法。方法:提取肉类的基因组DNA,利用不同物种mtDNA cytb基因序列的SNP位点的差异,设计特异性引物。进行多重PCR扩增,利用扩增产物片段大小不同,检测牛肉中常见的掺假动物源性成分。通过灵敏性试验,确定最低检测量。结果:实验设计的引物特异性良好,在同一反应体系中,在同一退火温度52℃条件下,牛肉DNA扩增后产生149 bp的特异性条带,猪肉DNA扩增片段为261 bp,鸡肉DNA扩增片段为554 bp,未发生非特异性扩增。且检测的最低浓度达到100 pg/μL,具有高度的灵敏性和适用性。结论:根据动物线粒体cytb基因的差异性位点,开发的多重PCR体系,可一次性地同时检测牛肉、猪肉和鸡肉,可快速、灵敏、高通量地分析食品中掺假动物成分的来源。     

烟草白粉病抗性基因型的多重PCR检测体系及其在回交育种中的应用

为提高烟草白粉病隐性抗病基因（感病基因）NtMLO1（M1）和NtMLO2（M2）在分子标记辅助选择育种中基因型的选择效率,根据已报道的M1和M2突变基因序列,设计4对单基因特异性引物,组成2个双重PCR反应体系,分别用于同时扩增M1和M2突变型或M1和M2野生型等位基因。结果表明,建立的2个双重PCR体系扩增的特异性片段与单重PCR体系扩增的片段完全吻合,突变基因纯合体只在突变基因多重PCR体系中产生191和306 bp的特异性片段,野生基因纯合体只在野生基因多重PCR体系中产生437和652 bp的特异性片段,杂合体在2个反应体系中均有特异性片段。利用该体系可经过1次或2次PCR扩增准确检测出回交转育过程中回交或自交后代M1和M2的基因型,加快抗病品种育种进程。      

荧光定量PCR法定量检测混合烟叶中的红花大金元

为检测混合烟叶中红花大金元烟叶，设计了红花大金元品种特异性引物与TaqMan MGB探针，检测了引物和探针的特异性和灵敏性，确定了荧光定量PCR反应条件，并在此基础上建立标准曲线对混合烟叶中红花大金元单一品种进行定量检测。结果表明，引物与探针组合H1-R/F/T的特异性较好，建立了标准曲线方程，决定系数R2为0.997。当DNA（55 ng·μL-1）模板含量为2 μL时，红花大金元的检测限可达0.11 ng。利用该方法对混合烟叶样品中红花大金元含量进行检测，误差范围在2.5%~3.5%之间，表明该方法可应用于特定混合样品中红花大金元烟叶的定量检测。      

利用简并引物检测金黄色葡萄球菌肠毒素A、B基因

通过设计简并引物建立一种PCR技术同步快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素A和B基因的方法。根据金黄色葡萄球菌肠毒素A、B基因编码序列,设计一对特异性简并引物SEAB来扩增靶基因片段,长度分别为105bp和135bp,通过对金黄色葡萄球菌肠毒素A、B菌株和4株对照菌株进行PCR检测,评价该引物的特异性;对金黄色葡萄球菌肠毒素B的DNA系列10倍稀释,对其灵敏性进行PCR检测。结果显示,金黄色葡萄球菌肠毒素A和B菌株的DNA检测结果呈阳性,4株对照菌株的检测结果呈阴性,通过基因测序证实了PCR产物的特异性,SEB的DNA最低检测浓度为3.58ng,整个检测过程不超过20h。建立了一个特异、快速灵敏的在同一条件下,金黄色葡萄球菌肠毒素A、B基因的PCR检测方法。     

基于blaCARB-17和toxR基因的副溶血弧菌双重PCR检测方法的建立

建立一种针对副溶血弧菌bla_CARB-17和toxR基因的双重PCR检测方法。按照副溶血弧菌的bla_CARB-17和toxR基因序列设计并合成引物,于同一反应体系中进行PCR扩增,优化退火温度、退火时间和引物比例,确定双重PCR的特异性和灵敏性,最后用实验室分离鉴定的副溶血弧菌分离株验证。结果表明:建立的双重PCR最佳退火条件是52℃ 30 s,引物比例1:1,在同一体系中特异地扩增出副溶血弧菌的bla_CARB-17和toxR基因的303、350 bp片段,其它对照菌株均无扩增,表明该方法特异性良好。双重PCR的最低检测限达1×102 CFU/mL,对实验室鉴定的56个副溶血弧菌分离株验证均为阳性。建立的双重PCR方法操作简单、高效快速、特异性强,适用于副溶血弧菌的检测。     

多重PCR检测婴幼儿配方奶粉中3种食源性致病菌

为建立一种能够同时检测婴幼儿配方奶粉(Powdered Infant Formula,PIF)中克罗诺杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌3种食源性致病菌的多重PCR检测方法。通过单重PCR验证了9对引物的特异性,筛选出其中3对特异性好的引物建立了多重PCR体系,对其特异性和灵敏度进行评价,并将其应用于人工污染PIF中3种食源性致病菌的检测。结果表明,针对克罗诺杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等3种食源性致病菌所筛选的3对引物分别能扩增出469、638和796 bp的目的条带,具有高度特异性。多重PCR检测体系的最佳退火温度为55℃,最佳Mg2+浓度为2.00 mmol/L,最佳引物浓度为400 nmol/L。在此条件下3种目的菌在102 CFU/mL均可同时扩增出较清晰条带。将建立的多重PCR检测体系应用于人工污染PIF中3种食源性致病菌的检测,其检出限达到103 CFU/g。本研究初步建立了一种能准确、快速、特异性的检测PIF中克罗诺杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR方法,适用于PIF中3种常见的食源性致病菌的快速检测。