NtCycB2和NtJAZ1共敲除对烟草腺毛密度和烟碱含量的影响

为了提高烟草的腺毛密度、腺毛分泌物和烟碱含量,从而改善烟株抗性和烟叶品质,以NtCycB2突变的多腺毛K326突变株系（hairy K326）为材料,采用CRISPR/Cas9技术对NtJAZ1进行基因编辑,筛选出NtCycB2与NtJAZ1基因共敲除的纯合株系J-21,并以K326和hairy K326为对照,对J-21的农艺性状、腺毛发育、烟碱生物合成和烟叶化学成分进行了研究。结果表明,J-21植株生长发育正常,主要农艺性状与K326和hairy K326无显著差异,其叶片腺毛密度比hairy K326有所降低,但比K326显著提高,腺毛分泌物含量（质量分数）提高156.35%。J-21叶片烟碱含量在现蕾期比K326和hairy K326显著提高,在烟株打顶后提高幅度明显降低,成熟期叶片烟碱含量比K326和hairy K326分别提高37.14%和32.28%。J-21烤后烟叶化学成分协调,烟碱含量比K326和hairy K326分别提高39.81%和45.32%,西柏烷类降解产物茄酮含量比K326和hairy K326分别提高217.49%和48.45%。表明NtCycB2和Nt...     

NtJAZ1基因敲除对烟草MeJA应答反应的影响研究

【目的】探究NtJAZ1敲除对烟草响应外源茉莉酮酸甲酯（methyl jasmonate, MeJA）对生长发育、腺毛发生、烟碱生物合成的应答反应的影响。【方法】以野生型K326为对照，比较不同浓度MeJA处理下，NtJAZ1敲除的K326突变品系NK-9在种子萌发、根系发育、腺毛形态、烟碱生物合成等方面的差异。【结果】（1）MeJA处理显著抑制了种子的萌发，在100μmol/L MeJA处理条件下，K326的种子萌发率比未经MeJA处理的种子萌发率降低了85.72%,NK-9的种子萌发率比未经MeJA处理的降低了48.12%。（2）MeJA处理抑制根系发育，在300μmol/L MeJA处理条件下，K326幼苗主根比未经处理的缩短了83.33%,NK-9幼苗主根缩短了68.18%。（3）Me JA处理诱导腺毛发生，在5 mmol/L MeJA处理条件下，K326叶面长柄腺毛密度比未经处理的提高了42.55%,NK-9提高了21.05%。（4）MeJA处理促进烟碱生物合成，在5 mmol/L MeJA处理条件下，K326烟苗的烟碱含量比未经处理的提高了76.05%,NK-9提高了37....     

多腺毛烟草K326品种基因编辑材料的创制与分析

烟草腺毛与烟株抗性和烟叶品质密切相关。为了定向改良烟草腺毛密度、创制多腺毛烟草材料,以烟草品种K326为材料,利用CRISPR-Cas9技术对腺毛发生负向调控基因NtCycB2进行敲除,创制了多腺毛K326定向改良材料HK326(Hairy K326),并分析了NtCycB2基因敲除对烤烟农艺性状和化学成分的影响。结果表明:NtCycB2基因敲除后烟株发育正常,生长旺盛,农艺性状与对照相比无明显变化;烟草叶面腺毛密度显著提高,分泌型腺毛发育完善,物质合成和分泌旺盛,西柏烷二萜化合物含量显著提高;烤后烟叶中性香气成分总量增加,其中,茄酮及新植二烯类成分增幅最为明显。因此,NtCycB2基因的敲除,不仅能够提高烟草的腺毛密度,而且对烟株生长发育和重要香气物质的积累也有促进作用,在烟草品种改良中具有较大的应用潜力。     

烟草腺毛生物反应器材料的创制与性状分析

为提高烟草腺毛分泌物含量（质量分数），以高分泌型种质资源T.I.1068为材料，采用基因编辑技术敲除其腺毛发育负调控基因NtCycB2，获得了纯合突变株系TTB-1(tobacco trichome bioreactor-1)。结果表明：TTB-1植株生长旺盛，发育正常。显微观察发现与烤烟K326不同，TTB-1与T.I.1068表皮毛由腺毛组成，无保护毛；TTB-1腺毛密度比T.I.1068提高53.41%，是K326的7倍；与K326相比，TTB-1腺头更加饱满，罗丹明着色更深。烟株现蕾期中部叶片叶面化学成分检测结果显示，TTB-1与T.I.1068分泌物组分一致，但分泌物含量显著高于T.I.1068，分泌物总量比T.I.1068提高63.11%;TTB-1与K326分泌物组分不同，除西柏烷类二萜和Ⅰ～Ⅱ型蔗糖酯外，还含有赖百当类二萜和Ⅲ～Ⅴ型蔗糖酯，总量是烤烟品种K326的7.95倍。对上中下部成熟叶片进行分批采收和叶面化学成分萃取，浸膏产率分别为烟叶鲜质量的0.61%、0.43%、0.30%，平均每株浸膏产量为8.90 g；在盛花期进行一次性采收，浸膏产率为烟叶鲜质量的0.45...     

典型烤烟品种腺毛形态及分泌特性比较分析

为探讨烤烟叶面化学特征及其形成机制,本文以K326、红花大金元、中烟100、翠碧1号、豫烟11等代表性烤烟品种为试验材料,采用超景深显微技术、GC-MS分析检测技术和荧光定量PCR技术,对叶面腺毛形态、叶面化学成分以及腺毛分泌物合成关键基因表达进行了比较分析。结果发现:（1）烤烟腺毛由长柄分泌型腺毛、短柄分泌型腺毛和非分泌保护毛等不同类型组成,翠碧1号和豫烟11中分泌型腺毛含量较高,而中烟100中非分泌型腺毛相对丰富。（2）西柏烷类化合物是烤烟叶面的主要化学成分,以K326中的含量为最高;赖百当类化合物在烤烟中含量极少,但豫烟11中顺冷杉醇和赖百当二醇含量较高。（3）西柏烷类合成酶关键基因CYC和CYP71D16在K326中表达活跃,赖百当合成酶关键基因CPS2在豫烟11中的表达量明显高于其它品种。不同烤烟品种之间叶面腺毛形态、基因表达及分泌物含量所存在的明显差异,可能与品种特色密切相关。      

NtCycB2基因表达对烟草抗旱性的影响

NtCycB2参与调控烟草腺毛的发生与发育过程,并对多种非生物胁迫具有应答反应。为阐明NtCycB2表达对烟株耐旱性的影响,以敲除NtCycB2后的多腺毛株系ko(NtCycB2-ko)、NtCycB2过表达的少腺毛株系oe和烟草栽培品种K326为材料,使用不同浓度聚乙二醇(PEG-6000)在试管中模拟干旱胁迫,同时在漂浮育苗盘中进行干旱胁迫处理,对烟草3个株系的抗旱性进行分析。结果表明,与K326相比,不同浓度PEG-6000处理的ko株系烟苗生长状况明显优于K326,气孔开度显著低于K326;在干旱胁迫下,ko株系烟苗的生物量和叶绿素含量(质量分数)显著高于K326,死细胞和活性氧含量较低,抗氧化酶中超氧化物歧化酶(SOD)活性和过氧化物酶(POD)活性以及脯氨酸(Pro)含量显著增加,丙二醛(MDA)含量显著降低,且离体叶片失水率显著低于K326;RT-PCR检测结果表明,NtPR1a、NtDREB2C和NtNCED5的表达量均极显著高于K326。而oe株系烟苗萎蔫严重,气孔开度较高;且oe株系死细胞和活性氧含量较高,生物量、叶绿素含量、SOD活性、POD活性和Pro含量均显著低于K326,MDA含量和离体叶片失水率较高,NtPR1a、NtDREB2C和NtNCED5的表达量均极显著低于K326。因此,敲除NtCycB2基因后的ko株系烟苗能够通过一系列生理生化反应和提高抗旱相关基因的表达量来提高其抗旱性,而NtCycB2过表达则降低其抗旱性,表明NtCycB2不同基因表达水平对烟草抗旱性有重要调节作用。     

高分泌型K326近等基因系的创制和鉴定

烟草腺毛分泌物含量与烟叶品质和烟株抗性密切相关。本研究以K326为轮回亲本,以高分泌型烟草种质T.I.1068为供体亲本,通过对腺毛形态及腺毛分泌物含量的定向筛选,获得了高分泌型的K326近等基因系（High Secretory K326,HSK326）。形态观察发现,HSK326植物学性状与K326基本一致,但叶面腺毛密度提高、分泌囊膨大、罗丹明组织化学染色程度明显加深。GC/MS检测表明,HSK326叶面分泌物成分与K326一致,含有西柏烷二萜和I-II型蔗糖酯,缺少T.I.1068中所特有的赖百当二萜和III-V型蔗糖酯;但HSK326腺毛分泌物含量显著提高,西柏烷二萜是K326的1.91倍,蔗糖酯是K326的2.27倍。进一步分析表明,HSK326中赖百当二萜合成关键基因NtCPS2、西柏烷二萜合成关键基因NtCBT的表达水平均高于K326;但与T.I.1068相比,HSK326与K326中NtCPS2基因在1542 bp处均发生了相同的终止突变（G变成T）,导致了赖百当二萜化合物的缺失。另外,分子检测发现与BMVSE紧密连锁的分子标记在HSK326和K326中类型相同,但与T.I.1068不同。HSK326在不改变K326腺毛分泌物组成的前提下,显著提高了K326腺毛分泌物的含量,不仅为K326品质的进一步改良奠定了基础,也为烟草二萜及蔗糖酯合成调控基因的鉴定提供了理想材料。      

烟草“8306”NtCPS2基因敲除及叶面化学成分改良

8306是重要的高香气烤烟育种材料,因其腺毛分泌物中含有赖百当化合物而使其杂交后代具有晾晒烟香气特征。为此,本研究利用CRISPR/Cas9技术,对8306中赖百当生物合成途径的关键酶基因NtCPS2进行敲除,获得了gRNA区发生单碱基插入突变导致翻译提前终止的纯合突变体8306-1。与8306相比,该突变株系生长发育正常,腺毛类型和腺毛密度无显著变化;利用GC-MS技术对叶面化学成分进行检测,在8306-1中并未发现8306中所含有的顺冷杉醇和赖百当二醇等赖百当类化合物,而腺毛分泌物的其他主要成分,如西柏三烯一醇、西柏三烯二醇及蔗糖酯的含量与对照相比并无明显变化;RT-PCR检测分析显示,8306-1与8306中MEP途径及二萜生物合成途径的关键基因,如NtDXS、NtDXR、NtCMS、NtGPPS、NtGGPPS、NtCYC、NtCYP71D16等在转录水平上的表达均无明显差异。该研究结果表明,NtCPS2基因敲除能有效降低烟草赖百当类二萜化合物的含量,而对叶面其他化学成分及类萜途径基因表达无明显影响。因此,NtCPS2基因是进行烟草叶面化学成分定向改良的理想靶点,对烤烟高香气育种具有重要意义。      

外源EBR对烤烟成熟期氮代谢及烟碱代谢的影响

为探明外源2, 4-表油菜素内酯（2, 4-epibrassinolide,EBR）对烤烟成熟期氮代谢及烟碱代谢的影响,以清水为对照,比较了烤烟打顶后叶面喷施和灌根两种EBR施用方式下成熟期叶片光合特性、干物质积累、氮代谢相关酶活性、烟碱代谢相关基因表达量和烤后烟叶化学成分的差异。结果表明,与对照相比,叶面喷施和灌根两种EBR施用方式均可提升成熟期烟株的光合能力,增加烟株各部位的干物质积累量,显著提升中部和上部烤后烟叶总氮和烟碱含量（质量分数）,且叶面喷施处理的效果好于灌根处理。两种施用方式上部叶氮素吸收同化关键酶NR和GS活性显著高于对照处理,叶面喷施处理叶片中氮同化相关基因NtGS2、NtGDH1和NtNR的相对表达量显著高于对照和灌根处理。两种EBR施用方式烟株不同部位烟碱合成基因NtQPT、NtPMT和转运基因NtJAT1、NtJAT2和NtNUP1的相对表达量均极显著高于对照,且叶面喷施处理叶片中烟碱合成与转运基因的表达量均极显著高于对照和灌根处理。因此,外源EBR可促进烟株的生长发育、提高氮代谢及烟碱代谢水平,增加中部和上部烤后烟叶烟碱含量,叶面喷施的效果好于灌根。      

云南不同品种和产区烤烟烟碱含量的差异

为了给卷烟生产企业提供云南烟叶烟碱含量的特征情况,对2004～2007年云南省12个烟区4个主栽品种[云烟85,K326,红花大金元(红大)和云烟87]的13912个烤烟烟叶样品的烟碱含量检测数据进行了差异统计分析。结果表明:①云南省烤烟上部烟叶烟碱平均含量为3.31%,中部烟叶为2.56%,下部烟叶为1.77%,部位间差异达显著水平,总体上云南烤烟烟碱含量水平基本适宜;②州(市)间烤烟相同部位的烟碱含量的差异达到显著水平;③云南4个主栽品种上部和下部烟叶烟碱含量的高低顺序均为:红大K326云烟85云烟87,且差异达显著水平,中部烟叶烟碱含量的高低顺序为:云烟85K326红大云烟87,云烟87的烟碱含量显著低于红大、K326与云烟85,K326、红大和云烟85差异不显著。     

NtCycB2基因表达对烟草腺毛发生的影响

烟草腺毛是烟草表皮细胞的特化结构,对烟株抗性及烟叶品质具有重要影响。为探索烟草腺毛密度的分子调控途径,本文对烟草B型细胞周期蛋白基因NtCycB2进行了同源克隆和生物信息学分析,并对其表达特性和生物学功能进行研究。结果表明该基因包含333bp的编码区,编码110个氨基酸,该序列在栽培烟草不同类型、不同品种间高度保守,但与SlCycB2和AtCycB2同源性分别为71.05%和52.38%。RT-PCR分析表明NtCycB2在叶面腺毛和花中的表达水平较高,并受到盐、温度、MeJA等逆境信号的诱导;分别利用基因过表达和基因编辑技术获得了NtCycB2过量表达和敲除株系;植株腺毛形态学观察发现NtCycB2过表达植株腺毛密度显著减少,基因敲除植株分泌型腺毛密度显著增加,而非分泌型腺毛变化不大,该研究表明NtCycB2对烟草分泌型腺毛发生具有明显的负调控作用,在烟草腺毛密度分子调控和叶面化学定向改良中具有较大潜力。      

基于CRISPR/Cas9技术的烟草烟碱相关基因敲除及功能研究

CRISPR/Cas9是一种重要的基因组定向编辑技术,近年来在植物基因组的定向敲除和分子育种材料创制中得到了广泛应用。为了发掘可用于分子育种的低烟碱烟草,以烤烟品种K326为试验材料,利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对控制烟草烟碱合成和转运的5个基因（PMT1、QPT1、A622、NtNUP1和JAT1）进行定向敲除,并对T2代纯合基因型烟草植株进行烟碱含量检测。结果表明,定向敲除5个基因后获得100株成功编辑的T0代烟草植株,突变检出率为29.9%,突变类型以单碱基插入或删除为主。对定向敲除烟碱合成基因QPT1和转运基因JAT1的T1代纯合基因型烟草植株进行序列分析,发现存在4种突变类型,分别是插入一个T、C、A碱基的插入突变和一个缺失44个碱基的缺失突变,从而引发移码使得翻译的氨基酸链大幅缩短,其T2代植株上部叶烟碱含量显著低于野生型植株。综上所述,CRISPR/Cas9技术能够高效定向敲除烟碱关键基因,为低烟碱烟草分子育种提供了理论和技术支撑。     

海拔高度、品种和某些栽培措施对烤烟香吃味的影响

对湖北利川不同海拔高度和不同品种烤烟的研究表明,烟叶总氮和烟碱随海拔高度增加而降低,烟叶还原糖和钾含量随海拔的提高而增加。ＣＦ８０的香吃味随海拔高度升高而降低,ＣＴ９０和Ｋ３２６的香吃叶随海拔高度增加而改善。Ｋ３２６的烟碱含量显著高于ＣＦ８０和ＣＴ９０,还原糖含量显著低于ＣＦ８０和ＣＴ９０,评吸总分在低海拔时景差,高海拔时居中。地膜覆盖和良好的抹杈管理将提高烟叶香气品质。利川适宜的留叶数为２０片左右。造成１９９７年Ｋ３２６在利川表现一般的主要原因是留叶数偏少。     

典型生态区烟叶腺毛发育及其分泌物比较研究

以烟草品种K326为材料,分别种植在河南平顶山、贵州遵义和云南江川三个典型生态区,在烟草叶片发育过程中对叶面腺毛形态、密度、腺毛分泌物及基因表达水平进行了比较研究。显微观察发现腺毛类型在3个地区间变化不大,都以长柄多腺头腺毛为主,但腺毛密度以贵州遵义产区的烟叶最高,河南次之,云南最低;GC/MS检测表明,西柏三烯二醇含量以河南产区为最高。且河南和云南产区随叶龄变化趋势相同;RT-PCR分析表明,西柏烷类化合物合成关键酶基因CYC-1和CYP71D16转录水平的表达与西柏三烯二醇含量的变化趋势一致。该研究表明生态环境对烟草腺毛发育和物质代谢具有较大影响,典型生态区烟叶叶面化学的差异可能与烟叶的风格特色密切相关。      

NtSPX4基因敲除对烟草苗期磷吸收和生长发育的影响研究

[目的]为探究NtSPX4基因在烟草磷吸收转运中的作用.[方法]同源克隆了烟草(Nicotiana tabacum L.)K326中NtSPX4基因,通过CRISPR/Cas9技术获得了NtSPX4-1和NtSPX4-2均发生纯合突变的K326株系S42,在不同磷浓度的Hoagland溶液培养条件下,对S42株系的生长...     

烤后原烟物理性状与化学成分的相关分析

以烤烟品种云烟85、云烟87、南江3号、晚花K326为供试材料,采用简单相关分析和典型相关分析方法研究了烤后原烟物理性状与化学成分之间的关系.结果表明,叶片厚度与总氮含量(相关系数为0.936)呈极显著正相关;叶片厚度与烟碱含量(0.674),填充值与总糖含量(0.645)、钾含量(0.690),单叶重与烟碱含量(0.666)、总氮含量(0.684)均呈显著正相关;含梗率与烟碱含量(-0.687)呈显著负相关.在一定范围内,随着叶片厚度的增加和填充值的降低,总糖、还原糖和钾含量呈降低趋势,总氮含量呈升高趋势.     

种植海拔对烤烟石油醚提取物及常规化学成分的影响

为探讨种植海拔高度对烤烟烟叶品质的影响,测定了在相同的土壤基质、种植密度、施肥水平、施肥方案和农艺措施条件下于湘西北石门县与慈利县200~1200m海拔高度盆栽的烤烟品种新K326和云烟87初烤烟叶C3F的石油醚提取物总量、总烟碱、还原糖、总氮、氯和钾含量。结果表明:①海拔与烤烟石油醚提取物总量显著正相关(P<0.05);②海拔与烤烟总烟碱及总氮含量负相关,新K326和云烟87分别达显著(P<0.05)和极显著水平(P<0.01);③海拔与烤烟还原糖和糖碱比值均正相关,新K326和云烟87分别达极显著(P<0.01)和显著水平(P<0.05);④海拔对初烤烟叶钾含量和氯含量均无明显影响。结论:适当提高烤烟种植的海拔高度,有利于提高烟叶的香气量,并使烟叶主要化学成分的含量更加协调,从而提高烟叶的可用性。     

种植海拔对烤烟生物碱组成的影响

采用毛细管气相色谱法测定了湘西北200~1200m范围内不同海拔高度种植的新K326和云烟87的初烤烟叶C3F的总生物碱含量及烟碱、降烟碱、假木贼碱与新烟草碱含量。结果表明:①新K326与云烟87的总生物碱含量与种植海拔显著负相关(P<0.05);②新K326与云烟87的烟碱占总生物碱的百分率随种植海拔的上升而增加(P>0.05);③新K326与云烟87的降烟碱、新烟草碱及微量生物碱总量占总生物碱的百分率均与种植海拔负相关;④新K326与云烟87的假木贼碱占总生物碱的百分率受种植海拔高度的影响较小。结论:适当提高烤烟种植的海拔高度可提高烟叶烟碱占总生物碱的百分率,降低降烟碱、新烟草碱及微量生物碱总量所占百分率,从而降低烟气的刺激性,提高烤烟的品质。