过表达谷氧还蛋白基因GRX5提高酿酒酵母乙酸耐性

利用可再生的纤维素原料生产燃料乙醇是国内外研究的热点。但纤维素原料一些预处理过程产生的乙酸对酿酒酵母细胞生长和乙醇发酵产生强烈抑制,因此,提高酿酒酵母细胞的乙酸耐受性是提高纤维素乙醇发酵效率的重要手段。本文研究了谷氧还蛋白家族中GRX5p的编码基因的过表达对酿酒酵母在乙酸胁迫条件下细胞生长和发酵性能的影响。结果表明,过表达GRX5的重组菌株在含有5 g·L^-1乙酸的平板中生长优于对照菌株;在含有5 g·L^-1乙酸的培养基中进行乙醇发酵,过表达GRX5的重组菌株可在48 h基本消耗培养基中所有的葡萄糖,发酵周期比对照菌株缩短了12 h。过表达GRX5菌株的乙醇生产强度为0.897 g·L^-1·h^-1,比对照提高了28.5%。代谢物分析结果表明,过表达GRX5的重组菌株可产生更多的保护性物质海藻糖和甘油,有利于增强菌株胁迫耐受性。     

ORP调控对马克斯克鲁维酵母发酵纤维素水解液的影响

采用通气的方式进行氧化还原电位（oxidation-reduction potential,ORP）调控,研究在添加抑制物条件下Kluyveromyces marxianus 1727-5利用葡萄糖、木糖以及两者混合体系的发酵性能,在此基础上考察了ORP调控策略对玉米秸秆水解液发酵的影响。研究结果表明：在调控ORP策略下,多种混合抑制物对酵母生长代谢造成的损害得以有效改善,细胞活性高,木糖、葡萄糖代谢速率加快。葡萄糖与木糖共发酵时,ORP调控至-150 mV时,葡萄糖发酵时间缩短近30%,木糖醇浓度由3 g·L^-1增加到10 g·L^-1。ORP调控策略也同样能有效缓解玉米秸秆水解液中较高浓度的多种抑制物对酵母细胞的胁迫,ORP为-100 mV时,相比于对照组,在保持终点乙醇不变的情况下,葡萄糖的发酵时间缩短了22%;木糖消耗由4.88 g·L^-1增至10.27 g·L^-1,木糖醇得率也由0.20 g·g^-1提高至0.48 g·g^-1。     

发酵粗甘油产乳酸的戊糖乳杆菌代谢进化

以生物柴油产业的副产物粗甘油为底物,可降低乳酸发酵的生产成本。但是,粗甘油发酵生产乳酸存在菌体生长缓慢、菌浓较低、产酸速率和终产物浓度偏低等问题。以实验室筛选的一株戊糖乳杆菌 (Lactobacillus pentosus R3-8)为出发菌株进行代谢进化。通过在培养基中添加高浓度的粗甘油和乳酸,分别进行菌株耐底物和产物抑制的代谢进化。用粗甘油驯化的第60代菌株,可耐受130 g·L^-1的粗甘油,与出发菌株相比,生长速率提高, 且生物量是原始菌株的1.23倍。用乳酸驯化的第50代菌株可耐受20 g·L^-1的乳酸,生物量比初始菌株提升了18%。驯化菌株的5 L发酵罐分批发酵结果显示,以粗甘油驯化至 60 代的菌株的批次发酵水平相对较好,乳酸产量、甘油转化率以及生产强度分别为 45.0 g·L^-1、0.989 g·g^-1和 0.47 g·L^-1·h^-1。以粗甘油驯化至 60 代的菌株进行补料分批发酵,乳酸终浓度为83.8 g·L^-1,比分批发酵提高了近1倍。     

自产气气提与纤维床反应器耦合发酵生产丁醇

采用发酵产物中的二氧化碳（CO₂）和氢气（H₂）作为循环气提气源,对丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum CGMCC 5234）发酵产物进行原位气提,实现丙酮、丁醇和乙醇混合物（ABE）的连续纤维床固定化发酵生产。连续发酵实验进行了12批次共309 h,总溶剂ABE当量浓度为133.3 g·L^-1（其中丁醇 83.5 g·L^-1,丙酮38.4 g·L^-1,乙醇11.4 g·L^-1）,葡萄糖消耗率为1.29 g·（L·h） ^-1,总溶剂ABE产率为0.431 g·（L·h） ^-1,转化率为0.333 g·g^-1,其中丁醇产率为0.270 g·（L·h） ^-1,转化率为 0.209 g·g^-1,发酵液中丁醇浓度控制在8～12 g·L^-1,显著优于游离发酵的结果。气提提取之后冷凝的ABE溶液出现分层现象,其中丁醇相丁醇浓度高达603.7 g·L^-1,极大地减缓后续分离提纯的负担。结果表明,自产气循环气提与纤维床固定化耦合连续发酵生产ABE（特别是丁醇）的工艺具有可行性和竞争力。     

基于流动注射光度法同时测定催化剂浸渍液中CoO/MoO3

基于Mo（Ⅵ）-抗坏血酸、Co（Ⅱ）-KSCN反应体系和流动注射光度法,建立了一个全新的催化剂浸渍液中超高浓度CoO/MoO₃的同时测定系统。研究发现：Co（Ⅱ）与KSCN络合物是由K₂Co（SCN）₄和K₄Co（SCN）₆构成,利用后者可定量Co（Ⅱ）;Co（Ⅱ）对Mo（Ⅵ）-抗坏血酸反应有抑制作用,会干扰Mo（Ⅵ）测定;本研究利用Co（Ⅱ）的抑制作用,人为在测Mo（Ⅵ）的显色剂中加入一定量的硝酸钴,解决了该干扰问题。另外,对测定Co（Ⅱ）/Mo（Ⅵ）用的显色剂中的成分及浓度、进样体积、反应温度等相关影响因素进行了优选,得到的结果是：测定Mo（Ⅵ）的显色剂由15%（质量分数）抗坏血酸、10 g·L^-1硝酸钴（以CoO计）及0.1 mol·L^-1硫酸组成,测定Co（Ⅱ）的显色剂由37.5% KSCN、0.1 mol·L^-1 NaAc-HAc（pH 5.8）组成;MoO₃和CoO的测定范围分别为10~100 g·L^-1和5~50 g·L^-1,检出限分别为2.1 g·L^-1和1.3 g·L^-1,RSD<1.2%（n=11）,回收率为98%~104%,分析速度为20样/小时。     

双尾型丙烯酰胺类疏水缔合共聚物的合成与表征

通过光引发自由基聚合的方式,将双尾型丙烯酰胺类疏水单体(N-苯乙基-N-十四烷基甲基丙烯酰胺,PETMAM),与丙烯酰胺(AM)、丙烯酸(AA)等水溶性单体进行共聚,制备出双尾型疏水缔合水溶性共聚物(DTHAP),来解决丙烯酰胺类聚合物耐温抗盐性以及稳定性差的难题。通过测定聚合物溶液的表观黏度作为评价其性能的主要手段,考察了丙烯酸加量、盐、表面活性剂(SDS)含量、疏水单体含量等因素对聚合物性能的影响,从而确定了比较理想的反应条件。实验中发现:丙烯酸加量和表面活性剂含量的变化会影响聚合物的临界缔合行为;盐的引入能够显著降低表面活性剂的用量,提高聚合物的增黏效果;疏水单体含量较低时[0.35%～0.45%(mol)],聚合物可以表现出明显的增黏效果。当聚合物浓度为1 g·L^-1时,聚合物的黏度可以达到141.5 mPa·s,其临界缔合浓度(CAC)为0.75 g·L^-1左右。聚合物在120 g·L^-1的NaCl溶液和120 g·L^-1 NaCl、0.4 g·L^-1 CaCl₂溶液中,80℃下老化90 d,黏度分别为47.6 mPa·s和45.9 mPa·s。采用红外光谱、扫描电镜两种手段,表征了聚合物的结构。     

氧化还原电位调控混合糖为底物的丁醇发酵

控制丁醇发酵过程中的氧化还原电位（oxidoreduction potential, ORP）能够大幅提高丁醇产量和果糖利用率,并降低终点有机酸浓度。实验考察了以葡萄糖和果糖混合糖为底物,通过泵入无菌空气控制ORP分别不低于-490、-460、-430及-400 mV丁醇发酵情况。其中,控制ORP不低于-460 mV时,丁醇和总溶剂产量分别达到13.19 g·L^-1及19.71 g·L^-1,相对于不控制ORP的丁醇自然发酵分别提高了139.38%及117.07%,残糖浓度降低至3.20 g·L^-1,糖利用率高达94.18%。该调控策略有效地解决了以葡萄糖和果糖混合糖为底物的丁醇发酵过程中存在的残糖浓度高、丁醇产量低的问题。     

含硫酸亚铁废溶液的生物氧化过程中氮源对溶解性Fe（Ⅲ）生成量的影响

利用嗜酸性氧化亚铁硫杆菌将含硫酸亚铁废溶液中的Fe²⁺氧化成Fe³⁺后用于脱除H₂S,同时实现了含硫酸亚铁废溶液的循环利用和H₂S的脱除。而溶解性Fe³⁺较高的生成量是保证该处理系统连续高效运行的关键因素。但在充足氮源和K⁺条件下大量Fe³⁺以黄铁矾沉淀形式存在。因此,本文通过控制氮源种类及投加浓度,减少沉淀生成,增大溶解性Fe³⁺生成量,以期提高H₂S的去除效率。结果表明（NH₄）₂HPO₄可替代以往研究中的（NH₄）₂SO₄作为氮源,确定适宜菌体生长的氮源浓度范围为0.33～1 g·L^-1。在1 g·L^-1 （NH₄）₂HPO₄条件下细菌生长无明显停滞期、Fe²⁺平均氧化速率为0.221～0.229 g·（L·h） ^-1,Fe³⁺生成量为7.62～7.72 g·L^-1,沉淀量为1.17 g·L^-1,因此确定（NH₄）₂HPO₄为1 g·L^-1时最能保证H₂S的脱除效率。为降低工艺成本,最低可采用0.33 g·L^-1为运行浓度。该优化方案不仅保证了菌体的Fe²⁺氧化活性,而且有效地减少了菌体培养过程中沉淀的产生,获得了较高的Fe³⁺生成量和增速,为使用含硫酸亚铁废溶液处理H₂S的工艺条件优化提供了依据。     

双极膜电渗析法分离发酵液中乳酸及离子迁移规律

考察了双极膜电渗析法分离酒糟发酵液中乳酸的影响因素,结果表明:当进料浓度13.5 g·L^-1,工作电压27 V,进料浓度比1.3,流量20 L·h^-1,电渗析10 h,产品罐中的乳酸浓度增加至20.95 g·L^-1,是电渗析前进料罐中的乳酸浓度的1.6倍,具有显著的浓缩效果.酸根离子迁移规律的研究表明,乳酸根离子的迁移速率明显高于其他酸根离子,且丙酸和乙酸的乳酸分离率相对较低.     

无氟无铵铝合金表面预处理新工艺

针对铝合金表面预处理过程存在污染严重、水耗高等问题,研究开发无氟无铵铝合金表面预处理新工艺。考察了碱性药剂配方组成及浓度、温度和时间对铝耗和铝合金表面形貌的影响,并通过正交实验确定了新工艺的优化方案。研究结果表明,经过“预处理-中和”两个步骤,铝合金表面平整、起砂细腻,铝耗仅为 2.0%。新工艺起砂效果优于传统碱蚀工艺,与传统酸蚀工艺细腻砂面相近。新工艺铝耗比传统碱蚀工艺降低约71%,与传统酸蚀工艺相近。新工艺操作时间比传统碱蚀工艺和酸蚀工艺分别缩短了23%和31%。最佳药剂配方为Na₂CO₃（80 g·L^-1）, NaOH（8 g·L^-1）,Na₂SO₄（25 g·L^-1）, Na₃PO₄（20 g·L^-1）, SDS（0.6 g·L^-1）, 甘油（5 g·L^-1）。 最佳操作条件为55℃和10 min。新工艺不仅从工艺源头消除了氟和氨氮污染,还实现了除油-起砂-去机械纹等多功能一体化集成。具有低污染、低铝耗、低水耗、短流程、高效率等优点,兼具环境友好和资源节约等优势。     

固定床生物反应器模拟溶浸采铀吸附尾液中Fe2+的氧化试验

以活性炭作载体固定嗜酸氧化亚铁硫杆菌,构建固定床生物反应器,模拟溶浸采铀矿山吸附尾液全Fe浓度和溶液pH条件,对生物反应器氧化Fe²⁺工艺参数进行了试验研究。结果表明:活性炭作载体比无载体时生物反应器氧化Fe²⁺速率增加了1.4倍,由0.5 g·L^-1·h^-1增大至1.2 g·L^-1·h^-1;生物反应器运行过程中溶液中全Fe因生成铁钒而不断消耗,需要定期清理反应器中的铁矾和补充FeSO₄以保持溶液中全Fe浓度;生物反应器最优的操作条件是:底部通气,Fe²⁺浓度为5 g·L^-1时,溶液流量为1.2~1.4 L·h^-1;Fe²⁺浓度为1 g·L^-1时,溶液流量为5.4 L·h^-1。     

不同碳源对EBPR系统厌氧计量学参数的影响

采用乙酸/丙酸交替、葡萄糖、实际生活污水为碳源长期驯化的三个强化生物除磷系统,研究了不同碳源对磷的释放和聚羟基烷酸(PHA)转化的影响、聚磷菌种群结构以及微生物代谢PHA和糖原的厌氧化学计量学。结果表明,从182 d起三个系统均获得稳定的除磷性能,第300 d三个系统内聚磷菌所占全菌的比例分别达到:89%±3%、55%±3%、45%±4%。乙酸、葡萄糖、生活污水为碳源时,聚磷菌细胞内贮存聚羟基丁酸(PHB)和聚羟基戊酸(PHV),丙酸为碳源PHA完全由PHV组成,四种类型碳源都未检测到聚二甲基三羟基戊酸(PH2MV)的生成。计量学研究表明:聚磷菌吸收1 C-mol的乙酸,细胞内合成1.15 C-mol PHB,0.15 C-mol PHV,分解0.47 C-mol糖原;吸收1 C-mol的丙酸生成0.44 C-mol的PHV,分解0.271 C-mol的糖原;吸收1C-mol的葡萄糖生成极少量的PHB和0.16C-mol PHV,分解0.16 C-mol糖原;以实际生活污水为碳源,消耗1 mg的COD,合成0.98 mg PHB、0.13 mg PHV(以COD计)。当以乙酸为碳源时获得最高的厌氧释磷量及最大的释磷速率,分别为:134 mg·L^-1和23.80 mg P·(g VSS)^-1·h^-1。以丙酸与葡萄糖为碳源时释磷速率相似,以生活污水为碳源的情况下释磷速率最小。     

产青蒿二烯的人工酵母细胞的构建及发酵优化

为了异源合成抗疟疾药物青蒿素重要前体青蒿二烯, 以酿酒酵母作为底盘细胞, 利用基因工程手段构建功能人工酵母细胞。为提高基因拷贝数, 并增加重组菌株基因型的稳定性, 选择酵母基因组中多拷贝位点Delta为整合点, 实现酿酒酵母内源基因tHMGR和ERG20的过表达以及外源基因ADS的整合。过表达tHMGR和ERG20基因增加了酵母体内半萜类物质共同前体法尼基焦磷酸FPP的积累量;而导入外源基因ADS, 实现了酵母生产青蒿二烯。经过摇瓶发酵优化实验, 人工酵母菌株青蒿二烯产量为225.3 mg·L^-1;为了进一步提高青蒿二烯产量, 经过发酵过程优化和补料策略, 人工酵母菌株在5 L发酵罐中青蒿二烯产量达到1.05 g·L^-1。     

黄色短杆菌ilvN基因定点突变和ilvBN、ilvC串联表达对L-缬氨酸产量的影响

由ilvBN、ilvC基因编码的乙酰羟酸合成酶（AHAS）和乙酰羟酸异构还原酶（AHAIR）是L-缬氨酸合成途径的两个关键酶。本实验以黄色短杆菌Brevibacterium flavum MD515为出发菌株,通过PCR技术扩增其ilvBN和ilvC基因,对调节亚基ilvN进行定点突变,获得抗反馈抑制突变型编码基因ilvBN^rC;然后将其插入穿梭表达载体pZ8-1中,构建串联表达质粒pZ8-1-ilvBN^rC并转化出发菌株,筛选获得工程菌株B.flavum MD515/pZ8-1-ilvBN^rC。摇瓶发酵该工程菌株L-缬氨酸产量达29.5 g·L^-1,较出发菌株提高27.7%,同时生长速度和生物量也比出发菌株有所提高,丙氨酸含量降低,L-亮氨酸及L-异亮氨酸含量提高。在30 L发酵罐连续补料发酵60 h后L-缬氨酸产量达61.7 g·L^-1,糖酸转化率为39.2%。菌株MD515/pZ8-1-ilvBN^rC发酵液透光率较出发菌株高且蛋白含量低,这些特性有利于发酵液后期的分离提取。     

F/F对嗜盐污泥以乙酸钠为底物生产PHB能力的影响

嗜盐混合菌生产PHB具有较好的成本优势。本研究接种入海口底泥发展嗜盐活性污泥,利用嗜盐活性污泥以两步法工艺生产PHB。在连续300 d的试验中从长期试验、发酵生产PHB以及表观动力学等方面探索了不同盛宴期/饥饿期(F/F)下筛选菌群的PHB积累能力。研究发现F/F作为重要的参数直接影响嗜盐活性污泥的PHB积累能力。在高F/F下非PHB积累菌群成为优势菌,而低F/F下促进高聚PHB嗜盐菌的选择和富集。在F/F≤0.33条件下筛选的嗜盐活性污泥最大PHB含量可以达到细胞干重的46.7%,PHB产率为0.358 mg PHB·(mg Ac)^-1。研究结果将对进一步实现嗜盐污泥生产PHB提供有益的指导。     

Blautia coccoidesGA-1的传代培养及其同化H2/CO2产乙酸特征

为了解同型产乙酸菌异养代谢与自养代谢的相互作用与机制,并为快速获得具有较强自养代谢能力的菌体细胞提供培养方法,以H₂/CO₂和(或)葡萄糖为碳源,考察了Blautia coccoidesGA-1在连续传代培养中的代谢特征。结果表明,以H₂/CO₂作为唯一碳源进行连续传代培养时,菌株GA-1长势较弱,其子代的自养代谢能力也逐渐下降;在葡萄糖培养基中,菌株GA-1增殖旺盛,但高浓度的葡萄糖对其自养代谢能力有显著抑制作用,这种抑制作用可能是自养代谢和异养代谢对辅酶A和ATP的竞争、酸性环境造成的代谢抑制以及辅酶I的氧化还原平衡调节等综合作用的结果。以体积比为4:1的H₂/CO₂混合气为气相条件,用200mg·L^-1葡萄糖培养基对菌株GA-1进行传代培养,不仅可获得稳定的子代培养物,而且可以将其利用H₂/CO₂产乙酸的能力维持在2.16g乙酸·(g干细胞)^-1的水平。     

十二醇-癸酸-纳米粒子复合相变材料传热性能

针对有机相变材料热导率低的共性,以质量比为58.47:41.53的脂肪烃类低共熔有机物十二醇(DA)-癸酸(CA)为基液,添加纳米粒子MWNT、Cu、Al₂O₃及分散剂SDBS制备出纳米复合相变材料,从纳米粒子种类、添加浓度及超声时间方面研究其对复合有机相变材料热物性的影响。实验发现MWNT、Cu、Al₂O₃的添加都可以不同程度上提高DA-CA的热导率。当超声时间为50min、纳米粒子浓度均为0.1g·L^-1时3种纳米复合材料的热导率大小依次是:MWNT>Al₂O₃>Cu。最优例:超声分散时间90min,DA-CA+MWNT(0.1g·L^-1)+SDBS(0.2g·L^-1)的热导率最大,为0.3602W·m^-1·K^-1,相较DA-CA提高了20.5%,在不影响基液热物性的基础上具有良好的热稳定性。     

生物法拆分外消旋甲霜灵制备R-甲霜灵

从土壤和污泥样品中分离得到一株能不对称水解甲霜灵的革兰阴性菌。通过分子生物学鉴定,命名该菌株为Albibacters sp.zjut528。当底物浓度为50 g·L^-1,湿菌体（含水量81%）：底物=0.3：1（质量比）,反应28 h,产物得率为47.1%,主产物为R-甲霜灵酸,对映体过量值ee_p > 99.9%。将菌株细胞破碎得到的粗酶液分离纯化得到一个SDS-PAGE电泳纯的酯酶,分子量约为40×10³,酶的N端10个氨基酸序列为NH₂-Ala-Ala-Lys-Ala-Pro-Leu-Arg-Leu-Lys-Glu。该酶最适温度为40℃,20~40℃稳定性较好。最适pH为9.0,在pH 5.0~10.0范围内稳定。Fe²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺对酶活有促进作用,Fe³⁺对酶活有一定的抑制作用。在含有20%的乙腈、异丙醇、丙酮、二异丙醚、环己烷、正己烷的水溶液中,酶活均比在纯水相中有明显提高。该酶反应动力学符合米氏方程,V_m为0.18 mmol·L^-1·min^-1,K_m为2.29 mmol·L^-1,K_cat为0.85 min^-1。建立了一条利用Albibacters sp.zjut528细胞作催化剂拆分甲霜灵制备R-甲霜灵的工艺路线,终产品R-甲霜灵的纯度是96.2%,ee值为99.3%。     

甲硫醚降解菌JLM-8的分离鉴定与降解条件优化

从制药厂的活性污泥中分离到一株能以唯一碳源和硫源降解甲硫醚的菌株JLM-8,经过生理生化测试与16S rDNA系统发育树分析鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)。通过测定菌株的生长量、甲硫醚的降解率,利用响应面法优化最佳降解条件,并测定了该菌降解甲硫醚的动力学参数。结果表明:当接种量为25 mg·L^-1时,通过响应面法优化的最佳降解条件为温度31.3℃、pH 7.5,初始甲硫醚浓度50 mg·L^-1时最大预测降解率为98.2%,实验验证降解率为97.9%。菌株降解动力学参数最大比降解速率、半饱和系数、抑制系数分别为2.37 h^-1、143.55 mg·L^-1、51.35 mg·L^-1,临界抑制浓度为78.46 mg·L^-1。     

卡拉胶酶高产菌株YDK-6的筛选、产酶条件优化及酶学性质研究

从腐烂的角叉菜中筛选出卡拉胶酶高产菌株YDK-6,通过形态观察及16S rDNA序列分析对其进行鉴定,采用正交实验对其产酶条件进行了优化,并对其所产卡拉胶酶的酶学性质进行了研究。结果表明,菌株YDK-6为假单胞菌(Pseudomonas sp.);在葡萄糖加量为15 g·L^-1、酵母粉加量为10 g·L^-1、卡拉胶加量为2 g·L^-1、NaNO₃加量为2 g·L^-1、NaCl加量为15 g·L^-1、K₂HPO₄加量为1.00 g·L^-1、MgSO₄加量为0.05 g·L^-1、FePO₄加量为0.01 g·L^-1、CaCl₂加量为0.01 g·L^-1、起始pH值为7.5的条件下,于28℃摇床培养72 h,所产卡拉胶酶的活力达到111.33 U·mL^-1<...