实验设计在重组人生长激素-Fc融合蛋白纯化工艺建立过程中的应用

目的 通过实验设计(Design of Experiment,DOE)对重组人生长激素-Fc(recombinant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白纯化工艺中阴离子交换层析的层析条件进行优化,以降低蛋白原液中宿主蛋白(host cell protein,HCP)含量。方法 利用Minitab 19中DOE功能创建4因子2水平完全析因实验设计,通过DOE对rhGH-Fc纯化工艺中离子交换层析条件(流速、上样量、缓冲液pH、洗脱液盐浓度)进行优化,找出操作空间。结果 建立的DOE模型能准确预测实验结果,其中上样量、缓冲液pH、洗脱盐浓度以及缓冲液pH与洗脱液盐浓度的交互效应对收获液中HCP含量有显著影响。获得的最佳层析条件为：上样量15 mg/mL,流速120 cm/h,洗脱液pH 7.0～8.0,洗脱液盐浓度0.1 mol/L。该层析条件下洗脱液中HCP含量均<400 ng/mg,在确定操作空间的结果范围内满足验证要求。结论 本实验成功应用DOE确定了阴离子交换层析去除HCP的最佳层析条件,为其在生物制药领域的更多应用提供了参考。     

长效重组人生长激素-Fc融合蛋白纯化工艺的建立

目的建立长效重组人生长激素-Fc(recombiant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白的纯化工艺。方法 rhGH-Fc融合蛋白细胞培养液经离心、低pH处理、过滤、浓缩预处理后,再经Protein-A亲和层析、CM阳离子交换层析、Q HP阴离子交换层析进行纯化,同时检测rhGH-Fc融合蛋白的蛋白含量、纯度、等电点及宿主蛋白、宿主DNA、Protein-A残留量等指标。结果 Protein-A亲和层析、CM阳离子交换层析、Q HP阴离子交换层析纯化产物的蛋白含量分别为145、132、92.4 mg,纯度分别为95. 40%、95. 90%和99. 19%,宿主蛋白残留量分别为2 500、864和71 ng/mg,宿主DNA残留量分别为329、0. 56和0. 12 ng/mg,Protein-A残留量分别为24. 5、3. 2和0 ng/mg。rhGH-Fc融合蛋白相对分子质量约97 300,等电点范围为5. 5⁶. 5,可与鼠抗人生长激素(human growth hormone,hGH)抗体发生特异性结合。结论成功建立了...     

重组人生长激素Fc融合蛋白工程细胞染色体核型分析

目的分析重组人生长激素Fc融合蛋白工程细胞(rhGH-CHO细胞)染色体核型。方法采用0. 1μg/m L秋水仙碱处理分裂中期的细胞,经固定、染色,制片观察,选取染色体形态及分散度较好的视野拍照。应用Image-ProPlus 6. 0(IPP)软件打开图片,利用手动测量工具(manual measurements)随机测量50个2n=22的CHO-k1和rhGH-CHO细胞中染色体长臂和短臂长度,计算各染色体的相对长度(各染色体与最长染色体长度的比值)及短臂/长臂的比值,并绘制染色体核型的B-Spline特征曲线。结果 rhGH-CHO和CHO-k1细胞的染色体数目均为22条,且染色体核型特征曲线一致。结论 rhGH-CHO细胞来源于CHO-k1细胞,且未受其他细胞污染。     

实验设计法在优化表达Fc融合蛋白的CHO细胞发酵培养工艺中的应用

目的通过实验设计(Design of Experiments,DOE)分析优化重组CHO细胞在生物反应器中的培养工艺。方法以2 L生物反应器控制参数温度(T)、pH及溶氧(dissolved oxygen,DO)作为变量,以蛋白表达量、蛋白纯度及蛋白唾液酸含量为响应变量,应用Design Expert 10软件进行3因素2水平DOE拟合分析,筛选最适表达Fc融合蛋白的CHO细胞发酵培养工艺参数,并采用5 L生物反应器进行验证。结果蛋白表达量仅与T有关,且呈成正相关,pH和DO对其无显著影响,T与pH对其有交互作用;蛋白纯度受T和pH影响显著,T呈负相关,pH呈正相关,DO对其无显著影响,T与pH对其有交互作用;唾液酸含量受T和pH影响显著,T呈正相关,pH呈负相关,DO对其无显著影响。最适工艺参数确定T为(34±0.5)℃,pH为(7.05±0.02),DO为(45±5)%。采用最适工艺参数的反应器与优化前工艺比较,活细胞密度(viable cell density,VCD)增加;蛋白表达量、蛋白纯度、唾液酸含量分别提高了29.7%、8%和87.9%。结论通过DOE方法快速优化了生物反应器培养表达Fc融合蛋白的CHO细胞的工艺参数,在不降低蛋白产量及纯度的前提下,极大提高了融合蛋白唾液酸含量。     

疏水作用层析在重组大肠杆菌表达的rProEMAPⅡ/P43蛋白纯化中的作用

目的建立rProEMAPⅡ/P43蛋白的纯化工艺,明确疏水作用层析(HIC)在纯化中的作用。方法采用由疏水作用层析、离子交换层析、亲和肝素层析组成的工艺对rProEMAPⅡ/P43蛋白进行纯化,并与由离子交换层析和亲和肝素层析组成的工艺相比较,分别进行总蛋白含量测定、SDS-PAGE分析目的蛋白含量及纯度检测。结果在pH为7·4~7·5时,采用HIC方法纯化的蛋白较不采用HIC法回收率提高了28·4%,纯化后rProEMAPⅡ/P43蛋白纯度为92%。结论在rProEMAPⅡ/P43蛋白纯化过程中增加疏水作用层析,可以提高rProEMAPⅡ/P43蛋白收率。     

重组融合蛋白柱层析病毒去除工艺的验证

目的对重组融合蛋白柱层析病毒去除工艺进行验证。方法以脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)和猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)为指示病毒,考察重组融合蛋白生产中柱层析步骤(染料亲和层析、阴离子交换层析和凝胶层析)去除病毒的效果。结果经染料亲和层析、阴离子交换层析、凝胶层析后,EMCV滴度降低平均值分别为1.968、1.984和4.391 log10,3步柱层析共去除EMCV 8.343 log10;PPV滴度降低平均值分别为2.135、3.936和2.048 log10,3步柱层析共去除PPV 8.119 log10。结论染料亲和层析、阴离子交换层析、凝胶层析3步柱层析联合处理,在生产过程中可有效去除指示病毒(EMCV和PPV)及其所代表的相关病毒。     

ELPs标签纯化重组蛋白的研究进展

分离纯化是重组蛋白生产的重要步骤,纯化标签的应用大大简化了重组蛋白的分离纯化过程,降低了生产成本.类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptides,ELPs)是近十几年发展起来的一种不依赖层析柱的快速、低成本生产重组蛋白的纯化标签.该标签是利用EL Ps的可逆相变特性纯化重组蛋白,只需要离心即可进行大...     

嵌合蛋白sTNFRⅡ-IgG Fc纯化与生物学活性研究

目的　建立嵌合蛋白sTNFR IgGFc的纯化工艺 ,并对该蛋白的理化和生物活性进行研究。方法　嵌合蛋白sTNFRⅡ IgGFc经变性、复性后 ,用金属螯合层析进行纯化 ,纯化的蛋白进行配基结合实验和拮抗TNF活性检测。结果　该嵌合蛋白的纯度大于 95 % ,在体外能够二聚化 ,保留了sTNFRⅡ对hTNFα的结合特性 ,同单体sTNFRⅡ相比 ,对hTNFα的拮抗活性明显提高。结论　为进一步研究奠定了基础     

酰乙基苯丙氨酸型镍树脂在纯化融合蛋白中的应用

将聚苯乙烯作为载体,以氯乙酰化代替氯甲基化,制备了聚苯乙烯酰乙基苯丙氨酸-Ni2 树脂(PS-Phe-Ni2 ).该树脂合成方法简单,过程中不使用致癌物氯甲醚等;羰酰乙基可与苯丙氨酸上的氧与Ni2 形成2个五元环,使该树脂对Ni2 的螯合稳定且螯合量较高,有利于提高蛋白吸附量.以醛糖还原酶融合蛋白为对象,初步考察了该树脂在纯化融合蛋白中的应用.在合适的条件下纯化倍数可达30倍.     

重组人促红细胞生成素纯化工艺

目的 建立适合大规模生产重组人促红细胞生成素（EPO）的纯化工艺。方法 采用无血清培养分泌rEPO工程菌,收集培养上清,经离心、超滤、离心交换层析、分子筛层析纯化。结果 所纯化的rEPO纯度达99％以上,比活性为1.3×105IU/mg,活性回收率为47％,相对分子质量为40 000,等电点为 3.5。免疫印迹证明具有天然EPO的免疫原性。结论 该纯化工艺简便,时程短,重复性好,适合于大规模生产。     

重组B7-H1IgV融合蛋白的表达、纯化及活性鉴定

目的以B7-H1为靶点,研制肿瘤免疫治疗蛋白疫苗。方法将人B7-H1胞外片段IgV区基因插入pQE-30原核表达载体,转化大肠杆菌,经IPTG诱导表达。Ni2+-NTA亲和层析纯化蛋白,Westernblot鉴定。用纯化的rhB7-H1IgV蛋白免疫昆明小鼠,经ELISA、流式细胞术、免疫组化技术和CDC试验测定融合蛋白及其抗血清的生物学活性。结果所构建的pQE-30-TT-B7-H1IgV表达载体,能稳定表达rhB7-H1IgV蛋白,经纯化后免疫昆明小鼠,可获得高滴度抗B7-H1抗血清。经流式细胞术和免疫组化检测显示,其抗血清可与HT-29/B7-H1+及SP2/0肿瘤细胞结合,且在CDC试验中,可依赖补体杀伤HT-29/B7-H1+及SP2/0肿瘤细胞。结论rhB7-H1IgV融合蛋白不仅可引发小鼠体液免疫应答,而且其抗体还能与表达B7-H1的肿瘤细胞相结合,并介导补体依赖的体外杀伤作用。     

重组人B7-H4IgV融合蛋白的表达、纯化及活性

目的表达、纯化重组人B7-H4IgV融合蛋白,并检测其活性。方法将人B7-H4胞外片段IgV区基因插入pQE-30原核表达载体,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达。表达产物经Ni2+-NTA柱亲和层析纯化,并进行Westernblot鉴定。用纯化的rhB7-H4IgV蛋白免疫昆明小鼠,经ELISA、流式细胞术测定小鼠抗血清的活性;免疫SP2/0荷瘤小鼠,观察对肿瘤细胞生长的抑制作用。结果表达的rhB7-H4IgV蛋白约占菌体总蛋白的25%,纯化后蛋白纯度为93%,浓度约为0.5mg/ml,与抗His单抗可产生特异性反应条带。免疫昆明小鼠产生的抗血清效价可达1∶10000,可与SP2/0肿瘤细胞结合。rhB7-H4IgV蛋白对SP2/0移植瘤生长具有一定的抑制作用。结论已成功表达并纯化了重组人B7-H4IgV融合蛋白,纯化蛋白可诱发小鼠体内免疫应答,产生的抗体能与表达B7-H4的肿瘤细胞SP2/0结合,rhB7-H4IgV蛋白在一定程度上能抑制SP2/0移植瘤的生长。     

重组DT/bFGF融合蛋白基因表达载体的构建及表达产物的纯化

目的构建重组DT/bFGF融合蛋白表达载体,制备高纯度的DLF融合毒素。方法PCR扩增DT389和bFGF的编码DNA序列,经酶切和连接,克隆至表达载体pET-30a,转化E.coliBL21(DE3),鉴定阳性克隆菌落,经IPTG诱导表达融合蛋白DLF,镍离子螯合层析纯化,用Westernblot分析其抗原性。结果测序表明,插入片段可编码含545个氨基酸残基的融合蛋白DLF。SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白可在大肠杆菌中表达,其表达量约占菌体总蛋白的20%,表达形式主要为包涵体。纯化后纯度达90%以上。Westernblot证实,该融合蛋白同时具有DT和bFGF两种抗原性。结论已成功构建DT/bF-GF表达载体,并获得较纯的DLF融合毒素。     

重组结核杆菌Ag85a-ESAT6融合蛋白的原核表达、纯化及其生物活性

目的原核表达、纯化重组结核杆菌Ag85a-ESAT6融合蛋白,并检测其生物活性。方法将Ag85a-ESAT6融合基因片段插入pET-28a(+)载体中,构建重组质粒pET-28a-Ag85a-ESAT6,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物在变性条件下经Ni-琼脂糖凝胶层析柱纯化复性后,在体外对经5种不同类型的表达结核杆菌Ag85a和ESAT6的重组痘苗病毒免疫的小鼠脾淋巴细胞进行刺激,以MTT法检测脾淋巴细胞的增殖反应。结果重组质粒pET-28a-Ag85a-ESAT6经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量约41000,主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的55.65%;纯化复性的重组融合蛋白纯度达95%以上,表达量约为1.2g/L发酵液,且具有良好的反应原性;与空痘苗病毒或生理盐水免疫的小鼠相比,5种重组痘苗病毒免疫的小鼠脾淋巴细胞与Ag85a-ESAT6融合蛋白共培养后,增殖活性明显升高(P<0.01)。结论成功利用原核系统表达了结核杆菌Ag85a-ESAT6融合蛋白,纯化复性的Ag85a-ESAT6融合蛋白具有生物学活性。     

重组幽门螺杆菌粘附素的纯化工艺

目的纯化大肠杆菌表达的重组幽门螺杆菌粘附素。方法将表达HpaA蛋白的工程菌经高压均质机破菌获得包涵体,经洗涤、变性、复性,Q Sepharose High Performance阴离子交换层析和亲和层析分离纯化。采用SDS-PAGE和HPLC检测纯度,用Western blot检测其抗原性。结果纯化后HpaA蛋白纯度高达95％以上,具有良好的抗原性。结论建立了从包涵体中获得高纯度HpaA纯化工艺,为进一步的研究打下了基础。     

血浆特定蛋白检测在IgG层析法中试纯化工艺中的应用

目的通过血浆特定蛋白检测,对层析法纯化IgG的中试工艺进行质量控制。方法采用免疫散射比浊法及BNP特定蛋白分析仪及配套试剂,全面检测生产用和中试纯化工艺用原料血浆的组成,建立血浆中白蛋白(albumin,ALB)、IgG、IgA、IgM、补体3(compliment 3,C3)、C4、转铁蛋白(transferin,TRF)、α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,AAT)、α2巨球蛋白(alpha2-macroglobin,A2M)、触珠蛋白(haptoglobin,HPT)、α1酸性糖蛋白(alpha1-acid glycoprotein,AAG)、铜蓝蛋白(ceruloplasmin,CER)、纤维蛋白原(fibrinogen,FIB)、抗凝血酶Ⅲ(antithrombinⅢ,ATⅢ)、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4 18项特定蛋白分布的数据库;对3批中试纯化工艺各步骤中ALB、IgG、IgA、IgM、FIB、AAT的去除情况及IgG回收率进行监测,验证工艺的稳定性;将3批中试纯化工艺制备的原液及成品中IgG含量的检测结果与凯氏定氮法检测结果进行比较,验证免疫散射比浊法的准确度及不同人员重复检测的中间精密度;对中试纯化工艺及低温乙醇法制备的IgG原液的杂质含量及亚类进行比较分析。结果中试纯化工艺用原料混浆中仅TRF、A2M、ATⅢ含量与生产用原料混浆差异有统计学意义(P<0.05);中试纯化工艺用原料血浆经A2P亲和层析去除了大部分的ALB、AAT,辛酸盐沉淀去除了剩余的ALB、FIB和IgM,DEAE离子交换纯化去除了IgA和ALB,IgG总回收率高于70%,表明该工艺稳定性好,提高了目标蛋白的得率。中试纯化工艺制备的IgG原液及成品的检测CV值均<10%,回收率在90%¹10%之间,表明该方法准确度及精密度良好;与低温乙醇法制备的IgG原液相比,中试纯化工艺制备的原液杂质含量更低,IgG的亚类分布与所用的原料血浆相似。结论血浆特定蛋白检测在血浆蛋白纯化工艺的监控和优化中具有应用价值。     

基因重组钙调蛋白提取纯化的新方法

目的建立一个简捷高效的纯化基因重组钙调蛋白(Recombinant-calmodulin,CaM)的新方法。方法 培养CaM基因重组大肠杆菌,并用IPTG诱导CaM表达,将菌体冻融、超声破碎,再经三氯醋酸、硫酸铵沉淀及超速离心,获得CaM;经SDS-PAGE检测CaM的纯度与相对分子质量,用甘油电泳和Scoin Image密度扫描软件检测CaM激活肌球蛋白轻链激酶(MLCK),从而引起肌球蛋白轻链(MLC20)磷酸化的活性。结果SDS-PAGE显示,重组大肠杆菌表达了大量CaM,且所提取CaM的相对分子质量及纯度均与CaM标准品一致;甘油电泳结果显示,CaMO.1μg/ml即可激活MLCK,使MLC20部分磷酸化,至3μg/ml时使MLC20双重磷酸化,其所致磷酸化的程度与等剂量的CaM标准品基本相同。Scoin Image密度扫描结果显示,CaM激活MLCK引起MLC20磷酸化的百分率与等剂量CaM标准品差异无显著意义(P>0.01)。结论已建立了简捷高效纯化CaM的新方法。     

表达GLP-1融合蛋白的重组大肠杆菌分批补料培养工艺优化

人胰高血糖素样肽-1(Glucagon Like Peptide-1,GLP-1)是一种有潜在应用价值的治疗糖尿病的药物。今以一株表达GLP-1融合蛋白的重组大肠杆菌为研究对象,在分批培养条件下,通过流加甘油并在诱导前0.5h添加氮源使菌体密度、融合蛋白表达水平、融合蛋白体积得率和融合蛋白细胞得率分别提高了138.0%、29.5%、216.9%和29.6%。在此基础上,进一步考察了甘油补加策略、氮源补料方式以及补氮液浓度等过程因素对菌体生长以及GLP-1融合蛋白表达的影响,发现氮源流加过程是提高融合蛋白表达水平的关键因素。进而通过对补料过程的优化,建立了高密度高表达的分批补料培养工艺,最终使菌体密度、融合蛋白表达水平、融合蛋白体积得率和融合蛋白细胞得率分别达到51.93g·L-1、34.6%、2.937g·L-1和0.057g·g-1cell,较分批培养分别提高了314.5%、100.0%、784.6%和111.1%。研究结果对GLP-1融合蛋白的产业化开发有一定的指导意义。     

HEV部队ORF2重组蛋白的纯化及其在酶标试剂中的初步应用

目的 获得具有生物学活性的重组蛋白,用于制备抗-HEV酶标试剂盒。方法 将插入的含HEV部分开放读码框2（ORF2）的重组菌扩大培养,诱导表达,纯化,鉴定,组装酶标试剂盒。结果 纯化的重组蛋白经SDS-PAGE鉴定,在相对分子质量56000处有一明显的蛋白带,经CS-930薄层扫描纯度达95%以上,经免疫印迹分析。具有良好的免疫学特异性,此HEV试剂盒,检测阳性病人血清样品阳性率为94.74%,检献血员血清样品阳性率为5.43%。结论 该纯化的HEV部分ORF2重组蛋白组装的试剂盒特异性及敏感性均较好。     

HEV部分ORF_2重组蛋白的纯化及其在酶标试剂中的初步应用

目的 获得具有生物学活性的重组蛋白,用于制备抗－ＨＥＶ酶标试剂盒。方法 将插入的含ＨＥＶ 部分开放读码框２（ＯＲＦ２）的重组菌扩大培养,诱导表达,纯化,鉴定,组装酶标试剂盒。结果 纯化的重组蛋白经 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定,在相对分子质量５６０００处有一明显的蛋白带,经ＣＳ－９３０薄层扫描纯度达９５％以上,经免疫印迹 分析,具有良好的免疫学特异性。此ＨＥＶ试剂盒,检测阳性病人血清样品阳性率为９４．７４％,检献血员血清样品阳 性率为５．４３％。结论 该纯化的ＨＥＶ部分ＯＲＦ２重组蛋白组装的试剂盒特异性及敏感性均较好。