南极磷虾粉脱脂前后胰蛋白酶降解产物的变化

采用测序级胰蛋白酶酶解南极磷虾冻虾粉和脱脂南极磷虾粉,然后利用液相色谱-飞行时间质谱(LC-Q-TOF)对酶解产物进行扫描分析,寻找有差异的肽段,并用三重四级杆质谱进行验证。结果表明,共鉴定出四条肽段在南极磷虾加工成脱脂虾粉过程中丢失,其中有两条肽段来源于南极磷虾的精氨酸激酶,它们的序列分别为EDMELQK、ASVHVDLPGWAK,另外两条肽段来源于南极磷虾的原肌球蛋白,它们的序列分别为DQVSEALLK、LQNAEGEVAALNR。本文为利用质谱技术分析南极磷虾多肽提供了一定的理论基础。     

南极磷虾金属螯合肽蛋白基料的酶解制备工艺优化

建立南极磷虾金属螯合肽蛋白基料制备工艺,拓展南极磷虾蛋白资源应用领域。以脱脂南极磷虾粉为底物,以酶解产物的水解度及Zeta电位为指标,从5种蛋白酶中筛选确定制备南极磷虾金属螯合肽蛋白基料的最优酶为胰蛋白酶;通过单因素试验和响应面试验优化确定最佳工艺条件为:酶解时间2.75 h、加酶量2.50%、料液比为1:3,该条件下蛋白水解度(14.16±0.43)%,与理论值基本一致。酶解产物的Zeta电位(—29.83±0.66)mV,相对分子质量主要分布于3000 u以下,具有金属离子结合能力的氨基酸占总氨基酸的(31.91±0.45)%,是制备南极磷虾金属螯合肽的良好蛋白基料。研究将为南极磷虾蛋白资源的高效精准利用提供科学指导。     

南极磷虾原肌球蛋白纯化鉴定、理化特性及模拟表位肽预测

对南极磷虾原肌球蛋白（tropomyosin,TM）进行提取纯化与质谱鉴定,并对其热稳定性、pH值稳定性及消化稳定性进行研究,同时利用生物信息学对其进行序列同源性分析、空间结构同源建模及过敏原模拟表位肽识别。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳结果显示,经蛋白粗提、热除杂、等电点沉淀、硫酸铵盐析等多步提纯,最终仅在32 kDa附近得到一条清晰条带。利用超高效液相色谱-质谱联用对其进行扫描,经UniProt数据库检索确定该目的蛋白为TM（Euphausia superba）,蛋白分子质量32.6 kDa,肽段覆盖率达97%。同源性分析结果表明南极磷虾TM是一种高度保守蛋白,与26 种甲壳动物的TM序列同源性在88%～98.2%之间。南极磷虾TM对热、酸碱及胃液消化均具有较强的稳定性,而对肠液消化稳定性较差,易被胰蛋白酶和糜蛋白酶降解生成低分子质量肽段。通过DNAStar Protean、AntheProt、BepiPred 1.0 server、ABCpred server、Immunomedicine Group 5 种生物信息学工具最终预测识别出8 条南极磷虾TM模拟表位肽（EAQNKETNAKADKADDEVH、DLERSEERLN、TKLAEASQAADESER、EADRKYDE、ERAEERAEAG、VSEEKANQREEAYKEQI、RSVQKLQKEVDR、VNEKEKYKGI）,并在其空间结构中进行一一映射。本研究为南极磷虾TM模拟表位肽的精准预测识别及其相关低致敏性产品的开发提供了科学依据。     

南极磷虾酶解工艺优化及酶解产物对牡蛎肉的冷冻保护作用

为了开发安全高效的无磷抗冻剂,本研究以南极磷虾为原料制备酶解产物对其进行冷冻保护作用评价,为开发新型抗冻剂提供基础数据。以水解度为指标,对南极磷虾进行酶解,从4种蛋白酶中筛选得到碱性蛋白酶作为实验用酶,在单因素实验的基础上结合正交试验对酶解工艺进行了优化;并以解冻失水率、盐溶性蛋白含量、总巯基含量、Ca2+-ATPase酶活力为指标,考察了南极磷虾酶解产物对牡蛎肉的冷冻保护作用。结果表明,用碱性蛋白酶酶解南极磷虾的最佳条件为温度为55℃,酶解pH为8.5,加酶量2.6%,酶解时间为5 h;在此工艺参数下南极磷虾酶解产物相对分子质量主要分布在100~5500 Da,占总酶解产物的79.69%。南极磷虾酶解产物可以抑制牡蛎冻藏后失水,延缓盐溶性蛋白、Ca2+-ATPase酶活力、总巯基含量下降,其作用效果优于含磷抗冻剂。因此,南极磷虾酶解产物具有冷冻保护活性,可进一步对其进行分离鉴定研究。     

利用高效液相色谱-飞行时间质谱和高效液相色谱-三重四级杆质谱检测南美白对虾的过敏原

为检测南美白对虾的过敏原,并寻找表征过敏原的特征肽段,采用测序级胰蛋白酶对南美白对虾的蛋白进行酶解,经高效液相色谱-飞行时间质谱的分离检测和数据库检索,并建立了三重四级杆多反应监测(MRM)快速检测表征过敏原肽段的方法。结果表明,南美白对虾中共检测出7种过敏原,分别为原肌球蛋白、精氨酸激酶、肌球蛋白轻链、血蓝蛋白亚基L1、血蓝蛋白亚基L2、血蓝蛋白亚基L3、肌钙蛋白C1,对应的肽段条数分别为214、16、84、145、225、163和93条。MRM结果显示,该方法灵敏度高、选择性好,为分析南美白对虾过敏原提供了参考。     

异丁醇萃取三种酶解产物苦味肽的研究

以牡蛎、鸡肉和南极磷虾为原料,选用胰蛋白酶和风味蛋白酶组成复合酶对其进行酶解,以感官评分和肽分子量分布为指标,考察异丁醇萃取3种酶解产物苦味肽过程中感官评分和肽分子量分布的变化。研究结果表明:异丁醇萃取牡蛎、鸡肉和南极磷虾乙醇相上清液感官评定都具有苦味,苦味评分值分别为6.8,4.4,5.0分。多肽分子量测定表明异丁醇萃取牡蛎、鸡肉和南极磷虾乙醇相上清液分别含有94.86%,97.61%和97.44%小于5ku的多肽片段。采用80%乙醇萃取酶解产物,再经过异丁醇萃取乙醇相,是一种快速萃取牡蛎、鸡肉和南极磷虾酶解产物中苦味肽的方法。     

响应面法优化南极磷虾蛋白酶解物溶解性工艺

以南极磷虾蛋白酶解物的溶解性为指标,在单因素实验的基础上,采用响应面优化实验分析了南极磷虾蛋白酶解过程中酶与底物比、时间、温度、pH等因素对南极磷虾蛋白酶解物溶解性的影响,建立了南极磷虾蛋白酶解物溶解度与各因素的最佳工艺的回归模型并进行了验证。实验从4种酶中优筛选出木瓜蛋白酶作为酶解用酶,在此基础上,结合实际生产情况确定木瓜蛋白酶酶解南极磷虾蛋白的最适工艺为:酶与底物比0.25%(w/w)、酶解时间30 min、酶解温度55 ℃、酶解pH6.0,此时南极磷虾蛋白酶解产物的溶解度为12.06%±0.21%。因此,酶解改性能够改变南极磷虾蛋白的溶解性。     

乙醇萃取3种酶解产物鲜味肽的研究

以牡蛎、鸡肉和南极磷虾为原料,利用胰蛋白酶和风味蛋白酶组成复合酶对其进行酶解,以感官评分、肽分子量分布和氨基酸组成为指标,考察乙醇萃取3种酶解产物鲜味肽过程中感官评分、肽分子量分布和氨基酸组成的变化。研究结果表明:90%乙醇萃取牡蛎、鸡肉和南极磷虾3种酶解产物的上清液均具有较强的鲜味,分子量在5ku以下的肽比例分别为93.00%,86.82%,87.86%。3种酶解产物中分子量10ku和5~10ku的肽,经过90%乙醇萃取后明显减少。90%乙醇萃取3种酶解产物的上清液小分子肽中含有较高比例的甜味和鲜味氨基酸。90%乙醇萃取方法可用于牡蛎、鸡肉和南极磷虾酶解产物中鲜味肽的快速萃取。     

UPLC-Q-Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用鉴别掺假蜂蜜

为对掺假蜂蜜识别提供新思路和新方法,本研究应用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用的方法鉴定4种未掺假蜂蜜及2种掺假蜂蜜中肽类物质的组成和结构,并探讨未掺假蜂蜜和掺假蜂蜜多肽的差异。以20%的三氯乙酸溶液沉淀蜂蜜蛋白,所得蜂蜜蛋白以胰蛋白酶酶解,然后通过C₁₈固相萃取柱净化酶解肽段。采用0.1%甲酸和乙腈作为流动相进行梯度洗脱,以高分辨质谱(Q-Exactive)的Full MS/ddMS2模式对胰蛋白酶酶解后的蜂蜜多肽进行鉴定,MaxQuant软件分析质谱结果,分析所得肽段在Uniprot上进行Blast序列对比。结果显示,4种未掺假蜂蜜中均存在来自蜂王浆主要蛋白(MRJPs)的多肽,2种掺假蜂蜜中未检测出MRJPs,且4种未掺假蜂蜜中所鉴定出的多肽80%以上来自于蜜蜂(Apis cerana cerana、Apis cerana、Apis mellifera)。通过比对6种蜂蜜酶解肽段序列发现,肽段EYILVLSNK在4种未掺假蜂蜜中均有检测到,在2种掺假蜂蜜中未检出。因此,来自于Apis mellifera的MRJP1酶解产生的肽段EYILVLSNK或可作为辨别真伪蜂蜜的潜在肽段。     

响应面优化南极磷虾蛋白酶解工艺及蛋白肽组分分析

以南极磷虾蛋白酶解液中的氨基氮含量为指标,采用甲醛电位滴定法测定胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶6种生物酶在其最适酶解条件下对南极磷虾蛋白酶解效果,筛选出酶解南极磷虾蛋白最佳生物酶。在单因素试验基础上,以酶解液中氨基氮含量为响应值,选择酶解温度、时间、pH为自变量,通过三因素三水平Box-Bohnken响应面分析法对筛选出来的生物酶解工艺进行优化。在优化酶解工艺的基础上,利用SDS-PAGE凝胶电泳方法分析南极磷虾酶解蛋白肽及南极磷虾蛋白的分子量分布范围。结果表明:胰蛋白酶为酶解南极磷虾蛋白的理想蛋白酶;响应面分析法建立二次多项回归方程:Y=51.07-0.83A+1.72B-2.06C+0.25AC+1.15BC-3.06A2-2.77B2-3.69C2,模型p0.0001,而失拟项p0.05,表明模型极显著且比较稳定,通过模型分析得最佳条件:酶解温度44.48℃、酶解时间8.52 h、pH 7.88,考虑实际应用可行性,我们在酶解温度45.0℃、酶解时间8.5 h,pH 7.9条件下实验得到的氨基氮含量为50.96±1.07mg/g,与理论预测值51.57mg/g基本一致。通过电泳分析得到南极磷虾蛋白分子量范围在15 ku以上,主要集中分子量范围为15 ku～45 ku;胰蛋白酶解多肽分子量在25 ku以下,主要分子量分布在5 ku以下。     

响应面法优化南极大磷虾抗菌肽提取工艺

以南极大磷虾为原材料,提取抗菌肽,在单因素试验基础上,采用响应面法优化抗菌肽提取工艺条件。结果表明,抗菌肽最佳提取工艺条件确定为硫酸浓度0.28 mol/L、硫酸用量3倍、乙醇用量2倍、提取时间0.5 h,在此工艺条件下,得到南极大磷虾抗菌肽的得率为1.21%,比优化前提高了0.3%。表明响应面法南极大磷虾抗菌肽的提取工艺的优化是可行的。     

反相液相色谱-串联质谱法筛选牙鲆鱼蛋白质中潜在的过敏原

目的建立反相液相色谱-串联质谱法(reversed phase liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry, RPLC-MS/MS)筛选牙鲆鱼(Paralichthys olivaceus)中潜在过敏原。方法采用RPLC-MS/MS技术对牙鲆鱼的蛋白质样品进行蛋白质组学分析。再将牙鲆鱼蛋白质样品在体外模拟胃液中消化,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)电泳观察不同酶解时间下鱼蛋白的酶解情况,将耐酶解的蛋白通过胶内酶解处理后采用RPLC-MS/MS法进行分析。最后将鉴定到的蛋白质与已知过敏原进行序列同源性分析。结果在SDS-PAGE中酶解时间为3 h时位于40 kDa处的条带仍清晰可见,此处的蛋白为耐酶解的蛋白质,经胶内酶解后共鉴定到5种蛋白质。与已知过敏原蛋白进行蛋白序列同源性分析,牙鲆鱼的原肌球蛋白alpha-1与已知过敏原Ore m4的序列相似度较高。2种蛋白质的一致性和相似性分别为96.5%和97.9%。甘油醛-3-磷酸脱氢酶与已知过敏原Tri a 34序列对比一致性和相似性分别为72%和83%。肌酸激酶1与已知过敏原Penm2序列对比的一致性和相似性分别为42%和63%,2组序列相似度大于35%,说明也具有相似性。结论耐胃蛋白酶酶解的大部分蛋白质是潜在的过敏原,其序列与其他物种已知的蛋白过敏原高度相似。该方法可作为筛选食物中潜在过敏原的一种新方法。     

Isolation and Identification of Antihypertensive Peptides from Antarctic Krill Tail Meat Hydrolysate

ABSTRACT:  Antarctic krill ( Euphausia superba ) obtained from the huge biomass in Antarctic waters is an important food product in Japan. Antarctic krill peptide powder (AKPP) prepared from the tail meat by enzymatic hydrolysis significantly decreased the systolic blood pressure in spontaneously hypertensive rats by a single oral administration (1, 10, or 100 mg). Presumably, the effect of AKPP was through inhibition of the conversion of angiotensin, which mediates blood pressure elevation, from its inactive propeptide to the mature angiotensin. Two potent angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory peptides were isolated from AKPP by high-performance liquid chromatography (HPLC) and identified as Val-Trp (IC₅₀= 2.75 μg/mL; 12.9 μM) and Leu-Lys-Tyr (IC₅₀= 4.26 μg/mL; 10.1 μM). Val-Trp and Leu-Lys-Tyr comprised 0.025%± 0.0023% (w/w) and 0.018%± 0.0023% (w/w) of AKPP, respectively, as measured by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS). The contributions of Val-Trp and Leu-Lys-Tyr to the ACE inhibitor activity of AKPP were 17.7%± 1.60% and 8.04%± 1.03%, respectively, suggesting that these 2 peptides constitute a substantial portion of the overall ACE inhibitor potential of AKPP.     

小麦主要过敏原CM16线性B细胞表位的预测及初步鉴定

目的：探究小麦主要过敏原α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂CM16的线性B细胞表位。方法：通过提取小麦蛋白粗提物,进行体外模拟胃肠道消化,发现小麦过敏原中具有消化抗性的α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂CM16的片段;进一步通过生物信息学方法分析CM16的一级氨基酸序列、二级结构,并通过同源建模确定CM16的三级结构。结果：利用生物信息学法预测出CM16的4 条线性B细胞表位后,结合质谱得到的抗消化肽段信息进行比对分析,发现其中2 条肽段存在部分重合,也证明了生物信息学分析鉴定过敏原线性B细胞表位方法的可行性和应用性。结论：通过生物信息学预测小麦过敏原CM16线性B细胞表位有助于进一步认识小麦过敏原,对小麦过敏原的识别和检测具有重要的参考和借鉴作用。     

广式酱油中微生物蛋白组学分析样本的制备

广式酱油发酵周期长、微生物种群多样、代谢物复杂,缺乏微生物蛋白组学分析的样本制备方法。该研究通过比较改良的TCA浓缩法和超滤法两种蛋白纯化方法,利用SDS-PAGE凝胶电泳和LTQ Orbitrap Velos Pro ETD质谱检测酱油微生物宏蛋白组样本制备效果。实验结果表明：TCA浓缩法制备的蛋白样品,其SDS-PAGE凝胶图谱有26个清晰条带,比超滤法多13个;两种法所制备的蛋白经胰蛋白酶酶切后的质谱图可分别鉴定到的2 495和1 682个肽段,说明TCA浓缩法制备的蛋白样品酶切更充分;不同发酵时期（0、60、120 d）的酱油经TCA浓缩法制备的蛋白样品,烷基化、酶切后,通过LTQ Orbitrap Velos Pro ETD质谱检测和Proteome Discoverer 2.5软件分析,可分别鉴定到1 035、1 104、1 046种蛋白质。通过TCA浓缩法制备蛋白组分析样本,操作简便,实验速度快,蛋白质鉴定率高,适用于广式酱油微生物的蛋白质组学的检测分析,为利用蛋白组学分析广式酱油的微生物发酵分子机制打下了一定的基础。     

谷氨酰胺转氨酶对碱溶酸沉法提取南极磷虾(Euphausia superba)蛋白质得率的影响

通过碱溶酸沉法提取了南极磷虾蛋白质,研究了谷氨酰胺转氨酶的应用对蛋白质得率的影响。结果表明:碱溶酸沉法能够较好地回收南极磷虾蛋白质;在酸沉过程中,合理添加谷氨酰胺转氨酶能够提高蛋白质得率约5%。     

Mass spectrometric detection of marker peptides in tryptic digests of gelatin: A new method to differentiate between bovine and porcine gelatin

Gelatin is a mixture of polypeptides obtained by hydrolysis of collagen primarily from bovine and porcine skin and bones. The similarity between different gelatins makes it difficult to trace their species origin. In this work, a new method for differentiation between bovine and porcine gelatin was developed based on detection and identification of marker peptides in digested gelatins. Sequence alignment analysis indicates that bovine and porcine Type I collagen contain differential sequences. The gelatins were digested by trypsin, and the resulting peptides were analyzed by high performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry (HPLC–MS/MS). The marker peptides specific for bovine and porcine were successfully detected in the digested bovine and porcine gelatin, respectively. Comparative analysis indicated that more marker peptides could be detected in gelatin with a higher mean molecular weight. It was found that proline hydroxylation was a key factor affecting the peptide identification. For peptides such as GPPGSAGSPGK and GPPGSAGAPGK detected in digested bovine and porcine gelatin, respectively, the sequence should be verified manually since the mass shift caused by proline hydroxylation can be confused with the mass difference between Ser and Ala residues. The results indicate that detection of marker peptides in the digested gelatin sample using HPLC–MS/MS is an effective method to differentiate between bovine and porcine gelatin.