高产虾青素红法夫酵母菌株的选育和发酵参数优化

目的:选育出高产、稳产虾青素的红法夫酵母菌株,并对培养基进行参数优化。方法:以红法夫酵母（P.Rhodozyma 02）为出发菌株,分别进行紫外-氯化锂（UV-Li Cl）和⁶⁰Co-γ诱变,从中筛选出高产虾青素的突变株作为基因组重排育种的出发菌株;经过五轮原生质体融合,筛选得到的基因组重排最优菌株。通过富含虾青素合成前体的天然促进剂的添加及对发酵培养基的参数优化,得到最佳培养基条件。结果:最终筛选得到高产、稳产虾青素的融合菌株F5-9,在此基础上优化得到最佳培养基参数条件为葡萄糖30.0 g/L,蛋白胨3.0 g/L,酵母浸出粉7.0 g/L,（NH₄）₂SO₄5.0 g/L,Mg SO₄·7H₂O 2.75 g/L,KH₂PO₄1.5 g/L,Ca Cl₂·2H₂O 0.2 g/L,胡萝卜汁150 mg/L,最终虾青素的产量高达（83.39±1.03）mg/L,是原始出发菌株的17.56倍。结论:采用传统诱变和基因组重排技术,能显著提高虾青素产量,培养基中添加虾青素前体物质胡萝卜汁能进一步促进虾青素产量的提高。      

复合诱变选育高产虾青素的红法夫酵母菌株

以红法夫酵母野生型菌株(Phaffia rhodozyma 02)为原始出发菌株,依次进行2轮紫外(UV)-氯化锂(LiCl)和60Co-γ射线诱变,以40μmol/L二苯胺为抗性筛选剂,筛选得到1株遗传稳定的高产虾青素红法夫酵母突变菌株H4-4,命名为HSC-125,虾青素产量为25.36 mg/L,是原始出发菌株P.rhodozyma 02(4.75 mg/L)的5.34倍。采用2轮UV-LiCl和60Co-γ射线复合诱变结合二苯胺作为抗性筛选剂,选育得到的高产虾青素的红法夫酵母突变株,其遗传性质稳定,展现良好效果。     

高产虾青素红法夫酵母的选育和工艺优化

虾青素是目前世界上公认的一种抗氧化性能最强的抗氧化剂,研究表明:天然虾青素具有抗癌症、抗衰老、增强免疫力等重要的生理功能,而且对人体绝对安全无害,因此,在水产养殖、饲料、食品和医药工业中得到广阔的应用。本文通过两轮紫外诱变和光复活交替处理的方法,诱变选育虾青素的高产菌株,最终获得3株高产菌株;诱变菌株产虾青素的能力相对于原始菌株提高了46%。在筛选高产菌株的基础上,进一步又对其发酵工艺进行了优化,红法夫酵母的最佳培养条件为葡萄糖15g/L,酵母浸粉7.5g/L,磷酸二氢钾2.5 g/L,氯化钙3 g/L,硫酸镁0.5 g/L;在50L发酵罐中培养72h,最终虾青素的产量基本稳定在70mg/L左右。     

红发夫酵母生产虾青素的培养基优化

从提高虾青素产量和降低生产成本综合考虑。研究选择了混合碳源、混合氮源、柠檬酸铵((NH_4)_3C_6H_5O_7)、Na_2HPO_4、K_2HPO_4、MgSO_4·7H_2O组成培养基。正交设计优选出的培养基为混合碳源(糖蜜40%、淀粉塘60%)30 g/L、混合氮源(玉米浆40%、(NH_4)_2SO_460%)7 g/L、MgSO_4·7H_2O 1.5 g/L、(NH_4)_3C_6H_5O_7 2g/L、Na_2HPO_4 2.0 g/L,用此优化培养基摇瓶培养红发夫酵母获得生物量16.92 g/L,虾青素含量903μg/g和虾青素产量15 279μg/L。     

乙醇对法夫酵母发酵合成虾青素的影响

利用摇瓶培养法夫酵母JMU-MVP14菌株,通过乙醇传感器检测乙醇含量,研究乙醇对法夫酵母细胞生长及虾青素合成的影响。结果表明,在10 g/L和20 g/L葡萄糖初始培养基中分别添加1～2 g/L乙醇时,均可提高虾青素的产量;而添加高浓度乙醇,则会抑制细胞生长和虾青素的合成。以10 g/L葡萄糖为初始培养基,控制发酵中恒定乙醇浓度为2 g/L,虾青素质量浓度可达到50.1 mg/L,比只添加2 g/L乙醇提高了20.3%,且虾青素细胞产率达到13.1 mg/g,葡萄糖的利用率能达到77.2%以上,说明恒定乙醇控制策略更有利于法夫酵母虾青素的合成。在10 g/L初始葡萄糖浓度,恒定乙醇浓度2 g/L,并每24 h补加5 g/L葡萄糖的优化条件下,虾青素产量最大值达到55.3 mg/L,虾青素细胞产率为19.7 mg/g,比对照组(14.1 mg/g)提高了39.7%。     

超声波-LiCl对红法夫酵母复合的诱变效应

以红法夫酵母为出发菌株,研究了超声波和LiCl两种诱变因子对酵母菌体致突变的诱变效应。结果表明,超声波-LiCl复合诱变技术能够有效进行红法夫酵母菌株改良。超声波处理时间为60 min、LiCl的浓度为2g/L,采用二苯胺进行推理筛选,最终获得1株虾青素含量为856.72μg/g的突变菌株UL-2,比出发菌株提高了289.42%,且该菌株遗传性能稳定。     

微波对红法夫酵母的诱变效应的研究

利用微波诱变技术对红法夫酵母(Phaffia rhodozyma TY-Ⅰ)进行了诱变。结果表明,红法夫酵母TY-Ⅰ对微波辐照非常敏感(120s时菌株存活率只有4.67%)。在最佳处理时间100s,加盖冷却的条件下进行微波诱变、二苯胺推理筛选,最终筛选获得1株遗传稳定性良好,虾青素产量高的突变菌株TY-Ⅰ-8,虾青素含量较出发菌株提高了102.51%。     

随机诱变和基因组重排选育阿维拉霉素高产菌

以绿色产色链霉菌(Streptomyces viridoehrongenes 2-21)为原始出发菌株,依次进行常压等离子(atmospheric and room temperature, ARTP)和2轮~(137)Csγ诱变,从中筛选出高产阿维拉霉素的突变株,作为基因组重排的亲本菌株,以利福平为筛选剂,经过4轮原生质体递归融合,最终得到1株遗传稳定的高产阿维拉霉素重组菌株H_4-15。摇瓶发酵结果表明,阿维拉霉素产量可达到(2 155.48±7.81) mg/L,中试发酵结果表明,阿维拉霉素产量达到(2 356.44±6.34)mg/L,是原始出发菌株的3.47倍。高产菌株H_4-15发酵产物的LC-MS结果显示,其主要组分是阿维拉霉素A和阿维拉霉素B。综合表明,以利福平为筛选剂,结合传统随机诱变和基因组重排技术选育阿维拉霉素高产菌株,能大幅提升其生产能力,具有工业化生产的潜在价值。     

金属离子对法夫酵母产虾青素影响的研究

为了研究金属离子对法夫酵母产虾青素的影响并优化出有利于法夫酵母产虾青素的金属离子,用单因子实验方法研究不同离子对法夫酵母产虾青素的影响并用正交实验方法对金属离子进行了配比优化。在培养基中添加Zn2+和Mn2+能增加细胞干重,在培养基中添加Zn2+、Fe3+、Mn2+和Cu2+能使培养液中虾青素的浓度增加,在培养基中添加Fe3+和Cu2+能使细胞中虾青素的含量增加。在培养基中添加3μmol/L的Mn2+、1μmol/L的Zn2+、1μmol/L的Fe3+、5μmol/L的Cu2+有利于法夫酵母虾青素的合成,用这些金属离子批式培养法夫酵母,总细胞得率为0.349 g/g(葡萄糖),总虾青素得率为0.266 mg/g(葡萄糖),细胞内虾青素最高含量为0.81 mg/g。     

两阶段法培养红法夫酵母生产虾青素

在法夫酵母生长过程中,培养基组成是影响细胞生长和虾青素产量的重要因素。文中通过正交设计和响应面优化方法分别对红法夫酵母生长阶段培养基和虾青素合成阶段的培养基进行了优化研究。结果表明,碳源和氟源浓度对红法夫细胞的生长及虾青素的合成有明显影响,浓度为20 g/L的葡萄糖有利于细胞的生长;而50 g/L左右的葡萄糖和高C/N有利于虾青素的合成。在此基础上提出了两阶段发酵方案。经过两阶段发酵,红法夫酵母生物量和虾青素产量达到16.8 g/L和15.015 mg/L,分别比分批培养提高了56.3%和28.7%。     

法夫酵母高产虾青素复合诱变育种的研究

通过实验确定了紫外线最适诱变剂量为3min、亚硝基胍的最适诱变剂量150μg/mL以及筛选刑二苯胺、β-紫罗酮、硫酸铜、2-脱氧-D-葡萄糖、氯化锂的筛选剂量分别为0．01g/L、0．5g／L、0．6g／L、1g／L、3g/L。进行了紫外线-氯化锂复合诱变法夫酵母，经发酵培养，获得了一株遗传性状稳定在25℃条件下，虾青素高产的菌株UV-40。     

金属离子对红发夫酵母的生长、细胞形态及虾青素合成的影响

主要研究了Mn2+、Mg2+和Ca2+三种金属离子对红发夫酵母(Phaffiarhodozyma)的生长、细胞形态及虾青素生物合成的影响。结果表明,在种子培养基中添加Mn2+能明显提高红发夫酵母的β-D-葡萄糖苷酶的活性并改变细胞的形态;在发酵培养基中添加0.1g/LMn2+,能明显促进细胞生长及虾青素合成;用正交试验法优化得到发酵培养基中的金属离子浓度为:0.1g/LMn2+、0.7g/LMg2+、0.2g/LCa2+,在优化后的培养基中,细胞生长速度快,摇瓶发酵57h的虾青素产量达2.95mg/L,是不加金属离子情况下发酵产虾青素最大量(发酵72h)的1.31倍。     

传统诱变与基因组重排技术相结合选育耐高温酿酒酵母菌株

以酿酒酵母AY12为出发菌株,采用传统人工诱变育种与基因组重排技术相结合的方法选育出耐高温且高产乙醇的酿酒酵母菌株.通过将出发菌株进行紫外诱变,获得酿酒酵母突变群体,并从中筛选出耐高温且高产乙醇的23株突变株作为正向突变文库;将该文库通过酵母高效产孢与杂交反应实现突变文库的全基因组重排,筛选得到的基因组重排最优菌LYQ-F1的高温耐受性较出发菌株AY12明显提高,且在高温模拟发酵工艺中其乙醇产量较出发菌株提高了22.1％.     

果蔬汁发酵生产虾青素的研究

以菠萝汁、西红柿汁为主要原料,用法夫酵母(Phaffiarhodozyma)XYV3发酵生产虾青素。通过对法夫酵母XYV3的虾青素摇瓶发酵条件包括接种量、促进剂、培养基主要组分的优化,得到适宜培养基组分及发酵条件。结果表明:①适宜培养基组分:菠萝汁100mL/L,西红柿汁150mL/L(适宜添加时间为在发酵进行到60h时加入),糖含量50g/L,酵母膏6g/L,(NH4)2SO42g/L;②适宜发酵条件:接种量8%,培养温度22℃,摇床转速180r/min。在此基础上发酵78h,虾青素产量可达到8.25μg/mL(858.62μg/gCDW),较优化前提高36.4%。     

应用HMG-CoA还原酶抑制剂筛选虾青素高产突变株

研究了HMG-CoA还原酶抑制剂辛伐他汀对法夫酵母生长及其虾青素合成的影响,实验结果表明,当辛伐他汀浓度在4·78×10-6mol/L时对酵母细胞的生长的抑制表现不明显,但对虾青素合成具有显著的抑制作用。以此浓度作为筛选浓度,经亚硝基胍(NTG)诱变后,通过辛伐他汀平板初筛与摇瓶复筛,获得较高虾青素产率的突变株。实验结果表明,菌体生物量、类胡萝卜总量和虾青素产量都有明显的提高,其中NPX-3_05突变株类胡萝卜总量与虾青素产量分别达到3·823、2·755mg/L,比出发菌株依次提高了163%、143%(1·453mg/L、1·134mg/L)。菌株NPX-3_05经连续发酵5次的稳定性实验表明其性状稳定。目标产物经HPLC定性分析,确定为反式虾青素。因此,以辛伐他汀等HMG-CoA还原酶抑制剂作为选择压力,对虾青素高产突变株的筛选上具有较好的“筛分”能力。     

红发夫酵母利用黄浆水发酵产虾青素的研究

对红发夫酵母利用黄浆水发酵产虾青素的动态过程进行了研究，结果表明：发酵约16h生物量达最大值为5．84g／L；发酵60h-72h虾青素产量达最大值为2．43mg／L．虾青素的含量达最大值为512μg／g干菌体。通过比较黄浆水与合成培养基的发酵，发现黄浆水培养红发夫酵母获得的生物量、虾青素产量分别是合成培养基的1．85倍、1-30倍，而虾青素的干细胞含量为合成培养基的71％。     

虾青素高产突变株的选育

阐述了法夫酵母中从葡萄糖到虾青素的整条生物合成途径。用亚硝基胍 (NTG)作为诱变剂 ,2 脱氧 D 葡萄糖 (2 DG)作为“筛子” ,通过 3轮诱变和一次自然分离 ,得到高产虾青素的菌株 4 2 6 ,其类胡萝卜素总量提高了 371 % ,为 7 0 7μg/mL ,虾青素的比率从 75 %提高到 79% ,并且其稳定性良好。对 2 DG和二苯胺作为筛子的作用机理也作了初步探讨。     

法夫酵母发酵过程的pH值控制策略及对虾青素合成的影响

为了探索p H值条件对法夫酵母产虾青素的影响,对虾青素高产菌株法夫酵母JMU-MVP14罐上发酵p H值条件及控制策略进行优化,结果表明:7 L罐分批培养时,较高p H值有利于菌体生长以及其他类胡萝卜素(如β-隐黄质和β-胡萝卜素)的积累,较低p H值有利于虾青素的合成。当p H值恒定控制在5.0时,虾青素的产量达到最大值137.7 mg/L;p H值为3.0和4.0时,虾青素的细胞产率高,分别达到了6.42 mg/g和7.17 mg/g。在此基础上,分阶段控制p H值,即第1阶段(0~72 h)将p H值控制在5.0,第2阶段(72~144 h)将p H值控制在4.0,结果显示该发酵策略有利于虾青素的合成,至发酵终点其虾青素产量和细胞产率分别达到150.1 mg/L和7.11 mg/g,均高于对照组。     

菠萝皮渣生产虾青素的发酵条件研究

以菠萝皮渣为培养基的主要原料,采用法夫酵母（Phaffia rhodozyma）对其进行发酵生产虾青素,采用响应面分析法对法夫酵母的发酵条件进行优化研究。先用Plackett-Burman设计法实验确定重要因素,再用最陡爬坡实验法确定因素水平,最后用响应面分析方法求得的最佳发酵条件为：发酵温度为20.0℃,初始pH为5.29,糖度为6.1%,酵母膏2g/L,MgSO42g/L,（NH4）2SO44g/L,KH2PO41.5g/L,种龄36h。用此优化的发酵培养基培养法夫酵母,虾青素产量可达6.5751mg/L。     

氮饥饿/过氧化氢协同胁迫促进法夫酵母合成虾青素

虾青素是一种强抗氧化剂,在细胞抵御外界环境胁迫方面起到重要作用。研究了氮饥饿/过氧化氢协同胁迫对法夫酵母合成虾青素的影响,结果表明:低含氮量有利于虾青素的合成,随着碳氮比的降低,虾青素的合成受到抑制,最佳的碳氮比为3∶0.6,每克干细胞虾青素的含量最高达0.32mg/g;在此基础上添加5mmol/L过氧化氢协同胁迫法夫酵母可进一步提高虾青素的产量,在发酵24h(对数生长期)加入3mmol/L的H2O2,36h补加2mmol/L,虾青素产量达到0.59mg/g,比空白对照提高63.9%。