寡胺-葡聚糖类阳离子化合物合成及其在基因转染中的应用

应用氧化葡聚糖与精胺通过还原胺法反应,制备了聚阳离子非病毒基因载体葡聚糖-寡胺化合物;用红外光谱测定仪、核磁共振波谱仪、紫外光谱仪,激光纳米粒度测定仪、透射电子显微镜进行了表征.证实了该载体为葡聚糖-精胺化合物DSP.其平均粒径为170nm,Zeta电位为+31.1mV,镜下呈园球形状.将载体DSP与pCMV-GFP的质粒DNA以8:1(N/P)组成复合物时,对SMMC-7721人肝癌细胞进行体外转染,转染效率高于阳性对照组transfectine 2000,为31.1%.实验表明该材料有望成为临床的非病毒基因载体.     

聚电解质/陶瓷复合膜的制备及超滤性能

采用阳离子聚电解质聚丙烯氯化铵(PAH)、聚乙烯亚胺(PEI),阴离子聚电解质聚苯乙烯磺酸钠(PSS)、聚乙烯磺酸钾(PVS),通过静电自组装技术在多孔陶瓷支撑体上制备了聚电解质分离层,并对不同条件下所制备的复合膜超滤性能进行研究.膜表面的SEM表征显示,自组装过程在支撑体表面及孔道内同时发生,并且随组装层数的增加,聚电解质层在支撑体表面的沉积状态逐渐改善.对复合膜在葡聚糖溶液中的超滤研究表明,随着组装层数,组装时间和电荷密度的增加,膜的截留率随之增加;制膜溶液的pH在两种带相反电荷聚电解质材料电离平衡常数(pKα)之间选择时,膜的截留率有最佳值.     

聚丙烯胺衍生物自组装多层膜的制备及其阴离子传感应用研究

聚丙烯胺盐酸盐(PAH)与2-[{[2-(2-吡啶基)肼基]硫代羰基}氨基]乙酸(化合物2)经酰胺反应制得聚丙烯胺衍生物(PAH-S)。由聚乙烯亚胺(PEI)、PAH-S与聚苯乙烯苯磺酸钠(PSS)通过层层自组装制备聚电解质多层膜(PEMs)。采用质量敏感的石英晶体微天平技术实时监控聚电解质(PE)的静电层层自组装吸附过程。在PAH与化合物2摩尔配合比为10∶2,PO34-离子浓度达到10-2 mol条件下,频率降至150Hz,表明制得的PEMs对PO34-具有吸附响应性。     

水溶性的PEI化壳聚糖的合成

壳聚糖是天然聚多糖甲壳素的脱乙酰产物,具有生物兼容性、生物降解性、无毒性。作为天然阳离子聚合物,壳聚糖具有正电性和特殊性能,因而壳聚糖及其衍生物可广泛用作药物和基因载体。但是其水溶性不好,单纯壳聚糖转染效率也不高,这就大大限制其应用范围。为了提高壳聚糖的溶解性和转染效率,对壳聚糖进行化学修饰极其必要。聚乙二醇能够有效提高水溶性,当其与药物相连时能增大分子量,减少肾消除延长半衰期,增加药物稳定性,并且PEG链包裹在药物表面,能够遮蔽药物的抗原,降低药物的免疫原性。我们通过合成了O-聚乙二醇单甲醚-N-马来酸酐-聚乙烯亚胺壳聚糖衍生物。合成的最终产物,不仅提高壳聚糖的水溶性和稳定性,提高转染效率,而且由于引入大量的活性氨基,则便于壳聚糖的进一步修饰。反应合成的中间体和最终产物都通过1HNMR和FTIR表征。     

表面活性剂对金刚石在树脂中悬浮性及与树脂结合性的影响

用KH550硅烷偶联剂和聚电解质型表面活性剂聚乙烯亚胺(PEI)分别对金刚石进行表面改性,研究了KH550和PEI对金刚石表面电性、金刚石在聚酰胺酰亚胺树脂液中的悬浮性及与树脂结合性的影响.结果表明:改性后金刚石表面的电性能发生显著变化,在酸性条件下,zeta电位绝对值明显提高,颗粒间的静电斥力增强,改善了金刚石在树脂液中的悬浮稳定性;改善了树脂对金刚石表面润湿性及其界面结合性,提高了线锯的切割性能;KH550对金刚石的改性效果优于PEI的改性效果.     

生物活性玻璃纤维的基因转染研究

生物活性玻璃由于含有钙、磷成分, 因此在基因转染方面具有应用潜能。本研究通过溶胶-凝胶结合静电纺丝技术制备了具有连续介孔或分级纳米孔的微纳米生物活性玻璃纤维(BGF), 并将其用于基因转染。实验结果显示, BGF在无血清培养基中可大量释放Ca²⁺和PO₄^3-, 这些释放的离子在沉积的同时可装载质粒DNA, 起到基因转染载体的作用, 转染效率与BGF之间具有剂量依赖性。当质粒浓度为1 μg/mL、BGF浓度为1000 μg/mL时, 细胞的转染效率可达对照组(脂质体转染试剂)的50%以上。其转染机理与传统的磷酸钙基因转染类似, 而其较好的离子溶出保障了其使用的稳定性, 有望替代纳米磷酸钙转染体系用于基因传输。     

共价层层自组装纳滤膜的制备及性能研究

纳滤膜目前多采用界面聚合的方法制备.层层自组装是近年来发展的一种新型制膜方法,但层层自组装所制备的纳滤膜大多需要5个以上双层,制备过程繁琐,同时,以静电力结合的阴阳离子聚电解质在水中存在一定程度的解离和溶胀,结构不稳定.本文提出用静电组装与化学交联相结合的方法制备纳滤膜,增强膜的稳定性.以改性的聚丙烯腈(PAN)为基膜,以聚丙烯酸(PAA)和聚乙烯亚胺(PEI)分别为阴阳离子聚电解质,以戊二醛(GA)为交联剂,制备了共价层层自组装纳滤膜(PEI/PAA/GA)n,研究了双层数、交联剂浓度、交联时间等因素对膜性能的影响.结果表明,当制备两个双层时,(PEI/PAA/GA)_2纳滤膜对2 000 mg/L Na_2SO_4溶液中的Na_2SO_4的截留率就能达到98.1%,水通量为12.6 L/(m~2·h·MPa);对2 000 mg/L NaCl溶液中的NaCl的截留率达到82.9%,水通量为16.8 L/(m~2·h·MPa).交联后的纳滤膜有良好的耐溶胀性和长期运行稳定性.     

基于含二硫键的小分子单体合成新型转基因载体的研究进展

含有二硫键(S-S)的小分子二丙烯酰胺与氨基化合物发生Michael加成反应,可以聚合成含有多重二硫键的聚氨胺(SS-PAAs)。由于主链上含有对细胞氧化还原环境具有响应性的二硫键,SS-PAAs能够被细胞内的谷胱甘肽降解成为小分子链段,从而在保持基因转染效率的前提下大大降低对细胞的毒性。因此,SS-PAAs有望成为新一代高效安全的转基因载体。本文综述了含有多重二硫键的SS-PAAs这一类新型载体的合成、表征、应用等方面的研究进展,并展望了下一步的研究方向。     

猪、牛成纤维细胞α-1,3-半乳糖基转移酶基因的敲除以及人白细胞抗原-G1基因的敲入

构建了敲除猪α-1,3-GT并敲入人白细胞抗原HLA-G1基因的打靶载体pZJ,其中以新霉素抗性基因(Neo)为正筛选基因,绿色荧光蛋白基因(GFP)为负筛选基因.采用优化的脂质体转染法将打靶载体pZJ转染于一个长势良好的胎猪成纤维细胞系中,经7天G418(600 μg/ml)药物筛选,共获得30个Neo抗性细胞克隆,其中12个为非绿色荧光细胞克隆,7个扩大培养良好,提取阳性克隆细胞的基因组DNA并进行PCR检测.经PCR结果检测,打靶载体转入到胎猪成纤维细胞中,其中3个非荧光阳性单克隆细胞在细胞基因组中进行了定点整合.以同样的脂质体转染条件将pZJ转染牛胎儿成纤维细胞,经筛选并对其进行PCR检测,其中2个均为定点整合阳性.该研究为今后克隆出表达HLA-G1而不表达α-1,3-GT基因的个体猪,从而提供可以真正用于临床的异种器官打下了基础,也为猪牛之间的跨物种敲除提供了一个佐证.     

聚乙烯亚胺/聚磷酸铵复合聚电解质对脲醛树脂固化行为的影响及其阻燃木质刨花板

木质复合材料的阻燃处理和力学增强一直受到广泛的关注。阻燃剂的加入不仅会增大胶黏剂的黏度，而且阻燃剂中的活性基团可以通过化学交联键合到树脂分子上，阻碍胶黏剂的聚合过程，从而对树脂的固化过程产生不利影响。通过对阻燃剂的改性，使其能够提高胶黏剂的固化反应性，增强胶黏剂的粘接强度，同时可以最大限度地减少阻燃剂的迁移，有效提升材料的阻燃性能和力学强度。鉴于此，本文以聚磷酸铵(Ammonium polyphosphate,APP)和聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine,PEI)为阴、阳离子聚电解质，通过自组装制备复合聚电解质(PEI/APP)，并进一步将其应用于木质刨花板中。PEI/APP提高了脲醛树脂(Ureaformaldehyde resins,UF)的固化反应性，同步赋予了刨花板优异的力学强度和阻燃性能。基于Kissinger和Ozawa动力学方程计算了不同添加量的PEI/APP与UF交联体系的活化能(E_a)，重点研究了PEI/APP对UF固化动力学的影响。结果表明：PEI/APP能够通过酰胺键和氢键作用与UF形成分子交联网络，促进UF的缩聚固化过程，使E<...     

利用Cre/lox重组系统在转基因动物中筛选高效表达外源基因的"友好"基因座

本实验的目的是利用Cre／lox重组系统进行“友好”基因座的筛选,即利用一个两端带有lox位点的标记基因去转染动物细胞或生产转基因动物,获得可以高效表达外源基因的“友好”基因座。一旦筛选到好的基因座,就建成了一个可以在动物体稳定地高效表达外源基因的技术平台。为此,利用野生型loxP位点和含有一个点突变的lox511位点分别构建两个载体pSL-loxGFP和pSL-loxIFN。首先将含有GFP和新霉素基因的质粒pSL-loxGFP DNA转染牛胎儿成纤维细胞,并用G418筛选,挑选出发绿色荧光的细胞克隆。经增殖培养之后,再将含有鸡γ-干扰素基因的质粒pSL-loxIFN和含有Cre重组酶基因的质粒pBS185 DNA共转染发荧光的细胞克隆,筛选出发生重组后不再发光的细胞克隆。用PCR法检测了两个不发荧光的细胞克隆及发荧光的细胞克隆,并使用质粒pSL-loxIFN、质粒pSL-loxGFP及牛基因组作为对照。检测结果显示,在Cre重组酶的作用下,两个不发荧光的细胞克隆中,一个发生了基因置换,另一个发生了基因删除。以上实验表明,巧妙地用Cm／lox重组系统,可以构建一套使外源基因在动物体内定点地高效表达的技术体系。     

用弱化dhfr双顺反子载体在CHO细胞中高效表达低分子量尿激酶突变体

将二氢叶酸还原酶基因(dhfr)克隆至pIRES载体中弱化的脑心肌炎病毒(ECMV)内部核糖体进入位点(IRES)的下游,构建了含有弱化dhfr筛选标记和可用氨甲蝶呤(MTX)加压提高表达水平的双顺反子真核表达载体pIRES-dhfr.利用该表达载体表达了一种无糖基化和具有凝血酶抗性的低分子量尿激酶型纤溶酶原激活剂(LMW-uPA)突变体(缺失尿激酶原的1-143位氨基酸,Arg156→Lys,Asn302→Ala),用脂质体转染方法将表达载体pIRES-dhfr/LMW-UK转染CHO-dhfr-细胞后经过一轮MTX筛选,几乎所有获得的单克隆细胞株都表达LMW-UK,其中约50%为表达水平较接近(500-5000 IU/106cells/d)的高表达阳性克隆.用转瓶无血清培养表达水平约为17.5pg/cell/d的rCHO细胞系LB2-UK,收集的上清经过阳离子交换柱和凝胶过滤层析两步纯化后,获得的重组蛋白的纯度可以达到99%.用S-2444发色底物法检测,所获得的突变体双链UK比例大于98%.     

基于动态可逆非共价体系的自愈合水凝胶构建方法研究进展

材料的完整性是保证其呈现应有性能的前提,任何破损或缺陷都可能导致材料性能不能满足使用需求。在众多材料中,用作药物缓释载体、组织工程支架和功能器件涂层的水凝胶因其特殊的应用环境而对自我修复性能需求迫切。自愈合水凝胶在受到外界破坏后能自我修复以维持初始性能,保证了使用过程中材料的安全性和可靠性。因此,具有自愈合性能的新型功能材料是目前重要的研究方向。基于高分子链之间相互作用力形成的自愈合水凝胶分为两类:(1)通过动态共价键形成的水凝胶,包括双硫键、Diels-Alder环加成反应、亚胺键/席夫碱作用等;(2)通过范德华力或氢键等非共价键作用,即物理交联形成的水凝胶,包括氢键作用、主体-客体之间力的作用、聚阴阳离子间的相互作用、金属配体的相互作用、疏水缔合等。由于共价键的稳定性,大多数共价键交联所形成的水凝胶稳定存在并表现出良好的力学性能。然而,这些水凝胶存在对外界刺激反应性低、制造之后不能被重塑、受到破坏之后不能自我修复等局限性,因此发展基于动态共价键或物理交联的自愈合水凝胶已成趋势。自愈合水凝胶不仅具有水凝胶独特的溶胀性能、极高的含水量、良好的生物组织相似性,而且具有自我修复断层的能力,可用于组织工程、伤口敷料、药物缓释、生物传感等生物医学研究领域,可有效延长材料的使用寿命,具有极好的应用前景。本文介绍了近年来基于动态可逆非共价体系构建自愈合水凝胶的研究进展,按照不同的愈合机理对自愈合水凝胶进行分类,分别讨论了基于氢键、可逆金属配位作用、疏水缔合以及多种作用力相结合等作用机理构建自愈合水凝胶的方法和应用进展,分析了基于动态可逆非共价构建自愈合水凝胶可能面临的问题,并对其发展前景进行了展望,以期指导此类水凝胶的设计、制备与应用。