胞苷产生菌的选育

选育胞苷高产菌株是实现发酵法生产胞苷的前提.本文分析了枯草芽孢杆菌的嘧啶生物合成途径及其代谢调控机制.提出了胞苷高产菌株的育种思路:采用具有天然的磷酸单酯酶活力很高的野生型枯草芽孢杆菌为出发菌株,选育具有胞苷脱氨酶缺失(CRDAE-)、6-杂氮尿嘧啶(6-AUr)、2-巯基尿嘧啶(2-TUr)、5-氟胞苷(5-FCr)等结构类似物抗性标记及高丝氨酸缺陷(HAD-)遗传标记的突变株.     

尿苷产生菌的选育

以野生型枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TJ374为出发菌株, 采用DES(硫酸二乙酯)及UV(紫外)诱变处理,筛选具有2TUr(2-硫尿嘧啶抗性)和6AUr(6-氮尿嘧啶抗性)及UP-(尿苷磷酸化酶缺失)标记的菌株,获得一株尿苷产生菌Tc142, 36℃摇瓶发酵72h最高可产尿苷3.34g·L-1.     

微生物发酵法生产胞嘧啶核苷的研究进展

胞嘧啶核苷又名胞苷,其在食品工业和医药行业上应用广泛。简单介绍了国内外微生物发酵法生产胞嘧啶核苷的方法;重点阐述了胞苷生产菌种的选育研究进展等,并以胞苷生产菌的选育为例,根据代谢控制发酵原理和基因重组技术,对胞嘧啶核苷生产菌枯草芽孢杆菌与大肠杆菌的育种实例进行了综述。     

利用重组嗜热栖热菌尿苷-胞苷激酶生产尿苷酸

尿苷-胞苷激酶(Uridine/cytidine kinase,UCK)作为生物体核苷酸代谢补偿途径中的重要催化剂,可以催化尿苷和胞苷磷酸化成为尿苷酸(5'-uridine monophosphate,5'-UMP)和胞苷酸(5'-cytidine monophosphate,5'-CMP)。利用大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)分别成功克隆表达了来源于嗜热栖热菌(Thermus thermophilus HB8)以及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)的尿苷-胞苷激酶。对比分析了不同重组尿苷-胞苷激酶的催化特性发现,来源于嗜热栖热菌的尿苷-胞苷激酶能以鸟苷三磷酸(Guanosine 5'-triphosphate,GTP)或者腺苷三磷酸(Adenosine 5'-triphosphate,ATP)作为磷酸供体催化尿苷生成尿苷酸,而来源于枯草芽孢杆菌的尿苷-胞苷激酶只有以GTP作为磷酸供体时的催化效果较好。在优化的反应条件下,使用来源于嗜热栖热菌的尿苷-胞苷激酶,6 h可催化10 mmol/L的尿苷和10 mmol/L的ATP生成8.74 mmol/L尿苷酸。研究结果表明,以ATP作为磷酸供体的尿苷-胞苷激酶可作为一种新型的催化剂用于尿苷酸的研制与生产。     

尿苷菌种选育及发酵条件优化

以野生型枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）TJ374为出发菌株,根据代控制发酵原理,采用DES（硫酸二乙酯）及UV（紫外）诱变处理,定向选育出一株尿苷产生菌Tc142（2TU。＋6AU％UP^-）,在培养基未经优化的情况下产尿苷2．3-2．4g／L。同时,考察了培养基对菌株产苷的影响,在优化的培养基中发酵积累尿苷3．4g／L,最高可产尿苷3．6g／L。     

紫外诱变选育高产3-羟基丁酮枯草芽孢杆菌

选育高产3-羟基丁酮的枯草芽孢杆菌新菌株。采用紫外诱变(15W,25cm),对一株产3-羟基丁酮枯草芽孢杆菌YD-1进行紫外诱变处理,并对菌株的遗传稳定性进行测定。筛选获得4株高产菌MB-2、MB-6、MB-10和MB-11,经过20代传代培养后MB-2的遗传稳定性最好,其遗传物质经RAPD分析,与出发菌株YD-1相比有较大差异。该菌遗传性状稳定,是一株高产3-羟基丁酮的新菌株。     

基于分子生物学技术的胞苷生产菌的育种研究进展

胞苷是一种重要的抗肿瘤、抗病毒药物的中间体。传统的胞苷生产菌的育种策略多采用物理或化学诱变的方法,结合代谢产物类似物的抗性筛选手段,得到能够有效积累胞苷的菌株。随着分子生物学的发展,利用基因敲除技术,通过阻断细胞的代谢旁路或引入突变位点,能够有效改变目的产物的产量或质量。对代表性的胞苷生产菌株枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的胞苷生物合成途径进行分析,并对其分子生物学育种策略进行了综述。     

尿苷产生菌枯草芽孢杆菌Tc142分批发酵动力学研究

通过建立菌体生长、产物形成和基质消耗的动力学模型,并应用MATLAB软件进行模型拟合分析,对枯草芽孢杆菌Tc142(6-Aur 2-Tur Upase-)5L罐尿苷分批发酵实验教据讲行分析,建立尿苷分批发酵动力学模型.结果是拟合模型能较好地反映尿苷产生菌Tc142的分批发酵过程.结论是以发酵动力学为指导,应用Matlab分析方法对尿苷发酵动力学模型进行拟合,其结果与实验结果相符.     

β-葡萄糖苷酶的枯草芽孢杆菌表达、酶学性质分析及其在宝藿苷Ⅰ制备中的应用

为获得安全高效的β-葡萄糖苷酶用于生物催化淫羊藿苷水解制备宝藿苷I,通过大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pMA5在食品安全菌株枯草芽孢杆菌WB600中异源表达Thermotoga petrophila来源的耐热β-葡萄糖苷酶TpBgl3,研究了所表达重组酶的酶学性质及其水解宝藿苷制备宝藿苷I的工艺条件.结果表明,菌株在3...     

常压室温等离子体与5-溴尿嘧啶复合诱变及快速选育腺苷高产菌株

采用常压室温等离子体(atmospheric room temperature plasma, ARTP)与5-溴尿嘧啶(5-bromouracil, 5-BU)对枯草芽孢杆菌B-0进行复合诱变,通过磺胺胍(sulfaguanidine, SG)抗性初筛、48孔板定量复筛的培养方法快速选育腺苷高产菌株。结果显示,48孔板在枯草芽孢杆菌发酵过程中存在边缘孔效应,并应用2 mL无菌水填充可消除边缘孔效应,且通过6轮复合诱变最终获得1株较出发菌株腺苷产量提升35%且遗传稳定的突变株B-6。ARTP与5-BU复合诱变结合48孔板快速选育,显著提高腺苷高产菌株选育效率与选育的准确率,也为其他核苷类菌株的选育提供了理论参考。     

高产溶纤酶菌株的选育

以枯草芽孢杆菌 YL-P2、YL-F2作为出发菌株,分别采用紫外线诱变、硫酸二乙酯诱变以及紫外线和硫酸二乙酯复合诱变,以脱脂牛奶平板法为初筛方法结合纤维蛋白平板复筛的方法选育出溶纤酶活力高的菌株, 获得了高产溶纤酶菌株 UV-8。UV-8溶纤酶活力达到2 314 IU/mL,与出发菌株相比,酶活力提高了2倍。结果表明,经多次传代后菌株 UV-8的溶纤酶酶活达到稳定,具有很好的潜在开发前景。     

耐高糖、高渗透压D-核糖高产菌株的选育及其发酵培养

以产D-核糖40g/L-45g／L的枯草芽孢杆菌突变株BFD-100810为出发菌株通过紫外线、硫酸二乙酯等方法诱变处理,获得一株核糖高产突变株BFD-101106。对该突变株的产核糖能力进行了验证,并对发酵条件进行了研究。     

1株高产凝乳酶菌株的鉴定及N~+注入诱变选育

为获得高产凝乳酶的菌株,以市售干酪为原料,从中分离得到1株具有高凝乳活力的菌株XC-1。通过生理生化实验、16S rDNA同源性序列分析,鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。采用N+注入法对筛选出的菌株进行诱变,确定最佳诱变条件为能量20 keV、剂量2.08×1015ions/cm2,获得1株特性优良的诱变菌株XCYB-6,其凝乳活力达到2 181.82 SU/mL,比出发菌株提高65.63%,蛋白水解活力为2.53 U/mL,凝乳活力与蛋白水解活力的比值高达862.38。传代(6代)实验表明,诱变菌株具有良好的遗传稳定性。     

紫外诱变选育高产蛋白酶枯草芽孢杆菌

紫外线辐射是目前最为广泛的物理诱变因子之一,其引起菌体DNA结构变化的形式很多,如DNA链的断裂、碱基的破坏等,但最主要的作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体,阻碍碱基间的正常配对,从而引起微生物突变或死亡.以实验室保存的枯草芽孢杆菌为出发菌株,利用紫外诱变的方法,以获取可高效发酵生产蛋白酶的突变株.通过大量筛选及连续传代实验,确定了一株突变性状能稳定遗传的突变株,其蛋白酶产量较出发菌株有大幅度提高.     

折多山纳豆生产菌株的分离与筛选

从四川康定附近著名的高海拔大雪山、生态环境极为特殊的折多山山顶分离到 2株性能各异的枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis)Z2 1和Z31。Z2 1具有枯草芽孢杆菌的典型性状 ,而Z31却与枯草芽孢杆菌的典型性状有明显差异 :不易生芽孢 ,菌落浅黄半透明且不易起皱。发酵试验表明 ,Z31是 1株优良的纳豆生产菌株 ,并可用于浓味纳豆生产。     

常压室温等离子体诱变选育高产核黄素枯草芽孢杆菌

该研究以BS120作为出发菌株,通过常压室温等离子体诱变(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)技术进行诱变处理,第一轮以40 mg/L 8-氮鸟嘌呤为筛选拮抗物进行筛选,得到核黄素产量和得率分别提升61.60%和58.12%的菌株BSG1。第二轮诱变以300 mg/L寡霉素为筛选拮抗物进行筛选,筛选获得菌株BSG3,核黄素产量和得率较BS120分别提升83.59%和78.76%。将核黄素操纵子表达质粒pMX45转入BSG3中,得到菌株BSG5,核黄素产量达到(4467.08±99.47)mg/L,得率为(42.56±1.25)mg/g葡萄糖,较BS120分别提高140.94%和120.52%,展现了良好的核黄素发酵性能和遗传稳定性。     

复合诱变定向选育腺苷生产菌

以枯草芽孢杆菌HJ-9（Xan）为出发菌株，根据代谢工程原理，采用原生质体紫外诱变和微波诱变相结合的方法，定向筛选出了具有黄嘌呤缺陷、腺嘌呤脱氨酶阴性、磺胺胍抗性的腺苷生产菌HS-5，其摇瓶发酵产量由出发菌株的1.06mg／m：L，提高到3．15mg／mL。     

基于液相色谱/四极杆飞行时间质谱法的产龙牙 草酚A芽胞杆菌的筛选

目的筛选产龙牙草酚A的芽胞杆菌菌株。方法采用液相色谱/四级杆飞行时间质谱的方法分析了35株芽胞杆菌菌株的发酵液的胞外成分。结果筛选出含龙牙草酚A的芽胞杆菌菌株6株,分别为马丁教堂芽胞杆菌FJAT-14258、枯草芽胞杆菌枯草亚种FJAT-14254、枯草芽胞杆菌斯氏亚种FJAT-14250、马氏芽胞杆菌FJAT-14248、甲醇芽胞杆菌FJAT-14249和硒砷芽胞杆菌FJAT-14262。其中龙牙草酚A含量最高的为马丁教堂芽胞杆菌FJAT-14258,占其发酵液总代谢物相对含量的0.1 8%。结论本研究为芽胞杆菌来源的产龙牙草酚A的开发与利用提供了理论依据。