溴氰菊酯人工抗原及多克隆抗体制备

以二溴菊酸和4-[(4-硝基苯)氧基[苯甲醛为原料经4步反应合成了溴氰菊酯半抗原1-氰基[4-(4-氨基苯)苯基]甲基-2,2-二甲基3-(2',2'-二溴乙烯基)环丙烷羧酸酯;用重氮化法将溴氰菊酯半抗原分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)相偶联制备免疫抗原和包被抗原,紫外吸收法估算偶联比分别为11:l和8:1;以BSA偶联物作免疫抗原免疫日本大耳白兔制备溴氰菊酯多克隆抗体,间接非竞争ELISA法测定两个抗血清效价分别为100000和80000,间接竞争ELISA法测定抗体特异性结果表明所制备的抗体测定溴氰菊酯的IC50值为0.16 mg/L,与其他供试农药的交叉反应率均≤1%.制备的溴氰菊酯人工抗原和多克隆抗体为研究建立溴氰菊酯农残免疫快速测定方法奠定了基础.     

氰戊菊酯免疫分析关键试剂人工抗原的合成与应用效果

以氰戊菊酸、间苯氧基苯甲醛为原料,利用酰氯与伯胺的活泼反应,合成了一种含有3个碳原子长度连接臂的氰戊菊酯半抗原,并通过核磁共振鉴定;用活泼酯法将合成的氰戊菊酯半抗原分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联制备免疫抗原和检测抗原,紫外-可见连续光谱扫描结果显示,所制备的人工抗原的图谱具有载体蛋白和半抗原的特征峰叠加现象,表明偶联成功;人工抗原的免疫结果显示,以BSA偶联物免疫小鼠后获得抗血清效价分别为160 000、140 000和110 000,间接竞争ELISA(酶联免疫吸附分析)测定抗体IC50(半数抑制浓度)值为35.1 μg/L,与其他供试农药的交叉反应率均＜1%,为氰戊菊酯抗体研制及免疫分析检测技术研究提供了关键试剂.     

T-2毒素人工抗原的制备

在蒸气浴条件下,T-2毒素与琥珀酸酐(HS)反应合成了T-2HS,薄层层析显示,目标半抗原合成成功;然后通过碳二亚胺法将半抗原与载体蛋白偶联制备人工抗原,采用紫外扫描及SDS-PAGE鉴定。结果显示,T-2HS能与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)结合生成T-2毒素抗原。紫外扫描分析表明,T-2毒素与牛血清白蛋白的偶联比为6.66∶1、与卵清蛋白的偶联比为10.11∶1,表明此完全抗原能够用于免疫动物。为进一步制备T-2毒素抗体奠定了基础。     

毒死蜱人工抗原的合成及多克隆抗体制备

由毒死蜱与3-巯基丙酸在碱性条件下反应,合成了毒死蜱半抗原。然后通过碳二亚胺法将毒死蜱半抗原分别与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)共价偶联,得到了免疫抗原和包被抗原。用免疫抗原免疫兔子获得了高效价的多克隆抗体,抗血清效价达到了1:160000。通过试验确立了毒死蜱标准曲线,检测限为0.5μg.L-1,抑制中浓度I50为18.2μg.L-1,检测线性范围为1.8～1000μg.L-1。     

三聚氰胺完全抗原的制备与表征

采用戊二醛法将三聚氰胺(Melamine,MEL)偶联到牛血清白蛋白(BSA)上制备完全抗原MEL-BSA,并用紫外扫描、红外扫描及SDS-PAGE电泳试验进行了鉴定。结果表明,半抗原MEL和BSA偶联成功,紫外光谱分析法计算得其偶联比为7.9∶1。通过免疫动物获得效价为1∶25 600的抗体,间接竞争ELISA测定抗体IC50值为39 ng/mL,与三聚氰酸及其他几种常用抗菌素的交叉反应率均0.2%,为下一步研制三聚氰氨单克隆抗体,建立三聚氰氨免疫速测技术奠定了基础。     

苯胺嘧啶类杀菌剂嘧霉胺人工抗原的合成与鉴定

[目的]合成嘧霉胺完全抗原并加以鉴定。[方法]对嘧霉胺的结构进行设计,合成N-(4,6-二甲基嘧啶基-2-基)-1,4-苯二胺,通过与琥珀酸酐合成引入羧基得到嘧霉胺的半抗原。用混合酸酐法将半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备免疫原,用活泼酯法将半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联制备包被原。[结果]半抗原的结构经~1H NMR以及HPLC-MS确证。经紫外光谱分析,计算得出半抗原与牛血清白蛋白和卵清蛋白的结合比分别为14∶1和8∶1。[结论]通过嘧霉胺半抗原的合理设计,建立快速有效的嘧霉胺ELISA检测方法。     

烟嘧磺隆人工抗原的合成与鼠源多克隆抗体的制备

为了制备烟嘧磺隆的多克隆抗体、建立烟嘧磺隆残留的免疫分析方法,以2-氨基磺酰基-N,N-二甲基烟酰胺(ASDM)和琥珀酸酐为原料合成半抗原,采用活泼酯法制备人工抗原并免疫小鼠。结果表明:经紫外可见吸收光谱扫描和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,人工抗原合成成功,半抗原与卵清蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)的偶联比分别为10.5∶1和26.9∶1。5次免疫后小鼠抗血清的效价均达到1∶16 000以上,以ASDM-BSA为免疫原的小鼠产生了抑制烟嘧磺隆的多克隆抗体,建立的间接竞争ELISA方法对烟嘧磺隆的检测范围是1ng·mL-1~10μg·mL-1。为进一步建立更为高效、灵敏和方便的烟嘧磺隆ELISA检测方法提供了参考。     

咪唑乙烟酸人工抗原的合成与鉴定

[目的]合成咪唑乙烟酸完全抗原并加以鉴定。[方法]以除草剂咪唑乙烟酸原药、草酰氯以及六氨基己酸等为起始原料,通过亲核取代、水解等反应合成了咪唑乙烟酸的半抗原。用碳二亚胺法将半抗原与牛血清白蛋白偶联制备免疫原,用混合酸酐法将半抗原与鸡卵清蛋白偶联制备包被原。[结果]半抗原的结构经IR、UV、1H NMR以及HPLC-MS确证。经紫外光谱分析,计算得出半抗原与牛血清白蛋白和鸡卵清蛋白的结合比为18∶1和7∶1。[结论]紫外光谱分析证实咪唑乙烟酸抗原合成成功,该抗原可用于咪唑乙烟酸多克隆抗体和ELISA检测试剂盒的研制。     

一种新型氰戊菊酯农药人工抗原的合成鉴定与免疫效果的探索

文献报道的氰戊菊酯半抗原结构有多种,分别从氰戊菊酯二苯醚和α-氰基部位引出连接臂合成人工抗原。为了探寻抗体与目标分子互作取向规律,以氰戊菊酯为载体,基于半抗原不同连接臂位点,同时也考虑到二苯醚和α-氰基结构为多种菊酯农药所共有,因此从其特征结构氰戊菊酸苯环结构上引出连接臂位点设计了一种新半抗原,采用α-异丙基苯乙腈等为主要原料,分别经过6和7步反应合成了两种连接臂不同的新结构的半抗原,并采用质谱和核磁共振手段对该新化合物进行结构表征;然后通过重氮化和活泼酯法将两种半抗原共价偶联到牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA),经过紫外光谱扫描、电泳进行鉴定,证明偶联成功,免疫小鼠结果 IC50值为δ2.4,与相关拟除虫菊酯农药有一定交叉反应,为抗原抗体识别位点和机制的探索提供了新的数据支撑。     

4-甲基苯酚多克隆抗体的制备及应用

针对4-甲基苯酚(4-MP)的结构特点及半抗原设计原则,选择对羟基苯丙酸(34-HPA)作为半抗原,通过活化酯法与牛血清白蛋白(BSA)偶联合成人工免疫原,免疫3～4 m的雄性大白兔,制得多克隆抗体效价为1∶204 800。同时采用混合酸酐法合成半抗原-卵清蛋白(OVA)偶联物作为包被原,以4-MP为竞争的抗原,建立间接竞争ELISA检测方法。实验结果表明,理想工作条件为:包被原浓度1.05μg/mL,抗体稀释倍数1∶12 800,酶标二抗稀释倍数1∶1 000,0.1%明胶封闭1.5 h,竞争时间与酶标二抗反应时间均为1.0 h。4-甲基苯酚在δ1.0×10-2～1.0×103的范围内呈线性相关,得标准曲线方程y=-12.76x+66.66,最低检测限δ0.02,板内差异为7.0%,板间差异为8.4%。     

西维因人工抗原的合成新方法

用对硝基苯氯甲酸酯活化萘酚并与6-氨基己酸反应,合成了完全保留氨基甲酸酯结构的半抗原6-(1-萘氧基甲酰胺基)己酸(CNH),并采用活化酯法与载体蛋白共价连接制备了突出西维因结构特征的抗原. 用正交实验选择活化酯法的最佳实验条件,并进一步详细考察了半抗原与载体蛋白结合率随外界条件的改变,从而制得不同结合比的抗原. 用紫外和红外对制得的抗原进行了鉴定.     

邻苯二甲酸酯类半抗原的设计合成与抗原制备

4-硝基邻苯二甲酸分别与正丁醇和2-乙基己醇发生酯化反应,再经Fe粉还原,制备两种邻苯二甲酸酯类(PAEs)半抗原——4-氨基邻苯二甲酸二丁酯(Ⅱa)和4-氨基邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(Ⅱb),再将半抗原Ⅱb与戊二酸酐进行酰胺化反应,制备出第3种PAEs半抗原4-戊二酸单酰胺邻苯二甲酸(2-乙基己)酯(Ⅱc),产品结构经熔点、1HNMR和MS表征。将半抗原Ⅱa~c分别与牛血清载体蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联,制备得到6种PAEs人工抗原Ⅲa~c和Ⅳa~c,并用紫外吸收光谱进行分析表征。     

Effects of Hapten Density on the Induced Antibody Repertoire

Small peptides and oligosaccharides are important antigens for the development of vaccines and the production of monoclonal antibodies. Because of their small size, peptides and oligosaccharides are non‐immunogenic on their own and typically must be conjugated to a larger carrier protein to elicit an immune response. Selection of a suitable carrier protein, conjugation method, and hapten density are critical for generating an optimal immune response. We used a glycan array to compare the repertoire of antibodies induced after immunizing with either low or high‐density conjugates of the tumor‐associated Tn antigen. At high hapten density, a broader range of antibodies was induced, and reactivity to the clustered Tn antigen was observed. In contrast, antibodies induced by the low‐density conjugate had narrower reactivity and did not bind the clustered Tn antigen.     

Characterization and comparison of fumonisin b(1)-protein conjugates by six methods

In order to generate an antibody against a small hapten molecule, the hapten is cross-linked with carrier protein to make it immunogenic. In this study, the hapten (Fumonisin B(1), FB(1)) was coupled to ovalbumin (OVA) and bovine serum albumin (BSA), respectively by a short cross-linker reagent (glutaraldehyde, GA). To develop a technique for detecting the conjugation, the hapten-protein conjugates (FB(1)-OVA and FB(1)-BSA) were characterized thoroughly by ultraviolet (UV) spectroscopy, Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy, gel electrophoresis and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS), respectively. The molecular weights of FB(1)-BSA and FB(1)-OVA were 74,355.301 Da and 48,009.212 Da, respectively determined by the method of MALDI-TOF-MS. The molecular coupling ratios were 11 and 5 in FB(1)-BSA and FB(1)-OVA, respectively. In this experiment, MALDI-TOF-MS was selected as the most efficient method to evaluate the cross-linking effect and calculate the molecular coupling ratio.     

农药人工抗原的合成研究进展

免疫分析法是以抗原、抗体的特异性识别和可逆性结合反应为基础,以抗体作为生物检测器而建立的一种灵敏、简便、快速的超微量分析方法。抗原的质量决定了抗体的特异性和亲和性,最终影响免疫分析的质量。在农药残留的分析中,建立免疫分析方法的关键是农药人工抗原的合成,包括半抗原的设计(强调连接臂的位置、长度、性质和功能基团的引入)、半抗原的合成、载体的选择、半抗原与载体的偶联方法和条件、最佳结合比的讨论、人工抗原的纯化与鉴定。     

Production of antiserum for sensitive enzyme-linked immunosorbent assay of 3-carboxy-4-methyl-5-propyl-2-furanpropanoic acid by chemiluminescence

To obtain a specific antiserum for use in enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) of 3-carboxy-4-methyl-5-propyl-2-furanpropanoic acid (CMPF), we prepared a haptencarrier conjugate in which the CMPF hapten was linked to a carrier protein through the 5-(1-hydrazopropyl) group. The antisera raised against this antigen in guinea pigs had excellent specificity for CMPF, showing little cross-reactivity with closely related compounds and no significant cross-reactivities with other furan compounds. The results indicated that a specific antiserum to CMPF could be produced by an antigen whose CMPF moiety is linked to a carrier protein through a position remote from the inherent functional groups. A standard curve of CMPF by ELISA using a chemiluminescence system showed a high sensitivity and a linearity in the range of 5–100 ng/mL.