D-阿洛酮糖3-差向异构酶在枯草芽孢杆菌中的表达

D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase, DPE)可以催化D-果糖转化为稀有糖D-阿洛酮糖,是生产D-阿洛酮糖过程中的关键酶。为了提高DPE的表达水平,该研究以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) WB800为宿主菌,异源表达Clostridium scindens ATCC 35704来源的DPE。首先,构建不同单启动子和串联启动子介导DPE表达的重组菌,通过摇瓶培养,发现由单启动子P_hag介导的重组菌株经发酵后酶活力最高,最高酶活力为19.62 U/mL,是P₄₃介导的原始菌株酶活力的1.3倍。最后对P_hag的核糖体结合位点(ribosome binding site, RBS)序列进行突变,突变后的菌株酶活力再次提高了29.4%,是原始菌株酶活力的1.69倍。该研究结果为工业化生产DPE提供了方法学参考。     

谷氨酰胺酶基因的克隆、表达和酶学性质研究

以枯草芽孢杆菌基因组为模板通过PCR扩增获得谷氨酰胺酶基因ylaM,构建重组质粒p MA5-ylaM,将其转化到枯草芽孢杆菌168中获得重组菌BS168/pMA5-ylaM,并在宿主菌成功得到表达,纯化后的谷氨酰胺酶比酶活大小为939.48 U/mg。谷氨酰胺酶的反应最适pH为7.5,反应最适温度为55℃,La~(3+)、Zn~(2+)、Fe~(3+)和Al~(3+)对谷氨酰胺酶活力具有一定的抑制作用,在NaCl浓度为15%～17.5%的条件下,该酶酶活力可以保留50%以上。在5 L罐中,通过分批补料发酵,其最高酶活力产量为215.06 U/mL。     

大麦β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中异源表达

该研究拟采用枯草芽孢杆菌异源表达大麦来源β-淀粉酶。选择枯草芽孢杆菌WB800作为宿主,采用同源重组的方法构建表达载体p P4 3NMK-amy B,获得重组枯草芽孢杆菌WB-amy B。重组枯草芽孢杆菌在摇瓶发酵条件下酶活最高可达386 U/m L,纯化后测得其比酶活为613 U/mg。重组酶的最适温度为55℃,最适p H值为5. 0。重组β-淀粉酶水解产麦芽糖能力与大麦β-淀粉酶相当,与普鲁兰酶联用时麦芽糖最大转化率可达81. 8%。重组枯草芽孢杆菌摇瓶发酵水平产酶量高于类似文献报道,重组β-淀粉酶的酶学性质与大麦β-淀粉酶相比几乎相同,完全可以替代大麦β-淀粉酶在工业上的应用。     

D-阿洛酮糖3-差向异构酶的异源表达和酶学性质

克隆了来源于Clostridium bolteae ATCC BAA-613的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因,利用重叠延伸PCR技术在Cb-dpe基因的上游加入了P43启动子,形成P43-Cb-dpe,再将P43-Cb-dpe连接到p MA5载体上构建出双启动子表达载体,并导入到Bacillus subtilis WB800中进行表达;与单启动子表达系统相比,双启动子表达载体能够显著提高Cb-dpe的表达量。对重组Cb-DPE酶进行了分离纯化和酶学性质的研究,结果表明:重组Cb-DPE的最适温度为55℃,最适pH为7.0,在温度30~40℃范围内和pH 6.5~7.5之间有良好的稳定性;Co~(2+)、Mn~(2+)可显著增强酶活;D-阿洛酮糖为底物时,K_m为26.68 mmol/L,小于果糖的61.80 mmol/L,说明该酶对D-阿洛酮糖的亲和性比对D-果糖的高。而在动力学参数方面,以D-阿洛酮糖为底物对应的催化效率K_(cat)/K_m为95.8 L/(mmol·min),大于以果糖作为底物时的54.1 L/(mmol·min)。     

海藻酸钠固定细胞产D-阿洛酮糖的研究

D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPEase)是一种能催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖的异构酶。本实验采用海藻酸钠作为载体,包埋重组大肠杆菌催化D-果糖生成D-阿洛酮糖。以固定化细胞的酶活活力回收率为指标,优化出最佳固定化条件为:海藻酸钠浓度3%,细胞包埋量60g/L,Ca Cl2浓度2%,固定化时间4h,0.01%浓度戊二醛溶液中交联4h。该条件下所得固定化细胞的酶活回收率高达76%,且具有较好的操作稳定性,重复操作8次后酶活回收率仍然保持61%。固定化后DPE细胞的最适酶反应温度提高了5℃、最适pH与游离细胞基本一致,耐热性明显提高,p H稳定性与游离细胞一致。     

重组枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因工程菌构建与表达

根据GenBank枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因序列设计引物,以枯草芽孢杆菌基因组为模板,PCR克隆α-淀粉酶基因(amy),将α-淀粉酶基因插入穿梭表达载体pP43C,构建重组质粒pP43Camy。随后将重组质粒转化八种蛋白酶缺陷的宿主枯草芽孢杆菌WB800,经筛选获得重组枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因工程菌WB800/pP43Camy1026,工程菌摇瓶发酵酶活力达960U。性质研究表明,重组α-淀粉酶的最适作用温度为70℃,最适反应pH为6.0,具有良好的应用潜力。     

嗜热内切-1,4-β-木聚糖酶在枯草杆菌中的表达及酶学性质

首先根据Thermopolyspora flexuosa的内切-1,4-β-木聚糖酶基因设计了引物,PCR扩增成功后进行酶切消化,连接载体质粒pHT43,经大肠杆菌DH5α扩增后,挑选阳性克隆,经菌体PCR及测序验证后,将基因序列测序正确的质粒大量抽提,经过转化导入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilius WB800N宿主,培养并经过1 mmol/L IPTG诱导表达后,发酵胞外上清经SDS-PAGE电泳证明重组蛋白质成功获得表达。其相对分子质量为27 kD,最适反应温度为80℃,最适反应pH为6.0。由此得知,分泌表达的嗜热内切-1,4-β-木聚糖酶的枯草芽孢杆菌工程菌株构建成功,这为未来该酶的产业化生产奠定了基础。     

利用枯草芽孢衣壳蛋白表面展示β-半乳糖苷酶

分别将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)芽孢衣壳蛋白CotB、CotC、CotG和CotX的启动子和编码序列与来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus IAM11001)的β-半乳糖苷酶基因bgaB进行重组,构建融合表达cotB-bgaB、cotC-bgaB、cotG-bgaB和cotX-bgaB的整合型重组质粒。将4种重组质粒分别转入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168(trp-),获得了能在芽孢表面展示的重组菌株PB701、PB702、PB703和PB704。经Western blot检测,4种重组菌株均表达了预期分子量的融合蛋白,初步表明β-半乳糖苷酶被锚定在重组菌株的芽孢表面。以oNPG为底物测定4种重组菌株芽孢表面展示β-半乳糖苷酶的水解能力,得到的酶活分别为0.14、0.06、0.22和0.20 U/mL。     

耐热耐碱木聚糖酶在大肠杆菌中的高效分泌表达及酶学性质研究

目的研究枯草芽孢杆菌来源的木聚糖酶基因在大肠杆菌BL2l中的高效分泌表达并对其产木聚糖酶进行酶学性质分析。方法全基因合成枯草芽孢杆菌木聚糖酶基因序列并进行密码子优化,经大肠杆菌BL2l表达后获得基因工程菌株,通过SDS-PAGE电泳检测、硫酸铵分级沉淀和AKTA系统分离纯化,分析表达产物的酶学性质。结果重组木聚糖酶为胞外分泌性表达,相对分子质量约43×103;酶促反应最适温度为65℃,最适p H为10.0,最适条件下酶活最高可达1201.5 IU/ml。结论成功获得高效分泌表达重组木聚糖酶的基因工程菌株,该木聚糖酶具较好的耐热性和耐碱性。     

枯草芽孢杆菌普鲁兰酶基因的分泌表达及其在粉丝制作中的应用

作者旨在研究枯草芽孢杆菌普鲁兰酶的分泌表达及表达产物的应用性能.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168菌株的普鲁兰酶编码基因BsP分别在大肠杆菌(Escherichia coli和枯草芽孢杆菌中进行表达,重组酶在两种宿主中均能利用自身结构分泌到细胞外.重组酶分泌到枯草芽孢杆菌细胞外的产物的酶学性质与积...     

新型甜味剂D-阿洛酮糖研究进展

稀有糖是在自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物。D-阿洛酮糖是一种重要的稀有糖,在食品、保健和医疗领域具有重要的应用价值。文中对D-阿洛酮糖的研究进展进行了综述,并展望了发展趋势。     

D-阿洛酮糖的分离纯化

通过生物法以D-果糖为原料生产D-阿洛酮糖,产物的分离纯化采用阴阳离子交换树脂脱色脱盐,再通过DTF-Ca2＋型离子交换树脂进行分离纯化。最佳分离条件：柱温60℃,10mL进样量,1mL/min流速。通过高效液相色谱测定,分离得到的D-阿洛酮糖纯度为98.3%。     

L-鼠李树胶糖激酶在D-阿洛酮糖合成中的应用

D-阿洛酮糖-3-差向异构酶（D-psicose-3-epimerase,DPE）可以催化D-果糖和D-阿洛酮糖之间的可逆反应,但D-阿洛酮糖的产率较低。L-鼠李树胶糖激酶（L-rhamnulose kinase,RhaB）具有磷酸化酮糖类物质的活性,将其与DPE偶联,可以打破DPE的可逆平衡,从而提高D-阿洛酮糖的产率。在反应体系中引入多聚磷酸盐激酶（polyphosphate kinase,PPK）,可实现ATP的再生,降低反应的成本。本实验在大肠杆菌Rosetta（DE3）中分别过表达DPE、RhaB和PPK,优化其反应条件,计算产物得率。结果表明,RhaB的相对分子质量约为5.3×104,最适pH和温度为8.0和35 ℃。将DPE和RhaB偶联,最适条件如下：pH 8.5,温度35 ℃,最适金属离子Mg2+,DPE和RhaB酶量比（质量比）1∶2,产物得率为70%。将DPE、RhaB和PPK偶联,ATP浓度降为D-果糖的1/5,D-阿洛酮糖得率为50%。本研究为工业化生产D-阿洛酮糖提供理论依据。     

D-阿洛酮糖及其合成研究进展

D-阿洛酮糖是一种具有保健功能的己酮糖,可以预防糖尿病、维持正常血脂水平,避免传统甜味剂对人体造成的代谢负担,具有重要的应用价值,但在自然界中含量稀少,近年来涌现多种D-阿洛酮糖的合成方法.文章围绕D-阿洛酮糖的功能、化学合成法和生物酶异构化法等内容开展综述,重点阐述了D-阿洛酮糖3-差向异构酶的来源及性质、结构及催化...     

Clostridium cellulolyticum D-塔格糖3-差向异构酶基因的克隆、表达及酶活性

D-塔格糖3-差向异构酶是生物法生产新型功能性因子D-阿洛酮糖最为有效的酶。作者克隆到一种新型的D-塔格糖3-差向异构酶基因,来源于微生物Clostridium cellulolyticumH10。以pET-22b(+)为载体质粒,E.coliBL21(DE3)为宿主细胞,构建了基因重组菌,IPTG可诱导目的蛋白质的过量表达;经亲和层析纯化的重组蛋白质样品进行SDS-PAGE分析,在约31 000处出现显著的特征蛋白质条带;活性检测结果表明:该重组酶具有较高的转化活性。     

D-塔格糖-3-差向异构酶及其应用

D-塔格糖-3-差向异构酶（D-tagatose-3-epimerase,DTE）家族,是催化酮糖类单糖C-3位置的差向异构化反应的一类酶,也是稀有糖生产中的核心酶.随着稀有糖在食品、保健品、医药中间体等领域的广泛应用,利用DTE酶家族制备稀有糖备受关注.本文对DTE酶家族的DTEase和DPEase的来源、酶学特性、蛋白结构以及DTE酶家族在稀有糖生产中的应用现状等方面进行了综述,最后对DTE酶家族的研究趋势进行了展望.     

Bioproduction of D-allulose: Properties,applications, purification,and future perspectives

D-allulose is the C-3 epimer of D-fructose, which rarely exists in nature, and can be biosynthesized from D-fructose by the catalysis of D-psicose 3-epimerase. D-allulose is safe for human consumption and was recently approved by the United States Food and Drug Administration for food applications. It is not only able be used in food and dietary supplements as a low-calorie sweetener, but also modulates a variety of physiological functions. D-allulose has gained increasing attention owing to its excellent properties. This article presents a review of recent progress on the properties, applications, and bioproduction progress of D-allulose.     

Clostridium bolteae ATCC BAA-613 D-塔格糖3-差向异构酶的诱导表达、纯化及活性研究

D-塔格糖3-差向异构酶是生物法生产新型功能性因子D-阿洛酮糖最为有效的酶。一种新型的能够编码D-塔格糖3-差向异构酶的基因CLOBOL₀0069被克隆,它来源于Clostridium bolteae ATCC BAA-613。以pUC57为克隆载体,以pET-22b（+）为载体质粒,E.coli BL21（DE3）为宿主细胞,构建了基因重组工程菌。IPTG诱导剂诱导目的蛋白的表达;通过镍柱亲和层析,杂蛋白与目的蛋白得到了很好的分离。对纯化的重组蛋白样品进行SDS-PAGE分析,在约32ku处出现明显的特征条带。通过活性研究表明,Clostridium bolteae ATCC BAA-613 DTEase属于DTEase家族,并具有较高的生物转化率,反应10h后转化率达到20%。     

根癌农杆菌D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因克隆、 结构预测及原核表达

D-阿洛酮糖-3-差向异构酶能够催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖。为实现D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的异源表达,设计引物,克隆并分离其序列,通过生物信息学软件分析D-阿洛酮糖-3-差向异构酶DNA和蛋白质的结构特点。结果表明,该基因开放阅读框870bp,编码289个氨基酸;蛋白质二级结构中α-螺旋占38.41%,β-折叠占47.06%,无规则卷曲占14.53%;该蛋白为亲水性蛋白,不含信号肽,无跨膜区,定位于细胞膜;构建原核表达载体并导入E.coliBL21宿主中,表达的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶分子质量约为33kDa,1mmol/LIPTG诱导E.coliBL21重组菌28h后,目的蛋白表达量和酶活分别为0.32g/L和3.8U/mL。根癌农杆菌D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因能够在大肠杆菌中实现表达。     

Antioxidative Activity and Gelling Rheological Properties of Dried Egg White Glycated with a Rare Keto-hexose through the Maillard Reaction

ABSTRACT: The functional properties of egg white (EW) glycated with a rare D-psicose and 2 alimentary sugars (D-fructose and D-glucose) were investigated. Glycation led not only to the formation of cross-links but also to the formation of antioxidative substances to EW, the extent of which depended on the sugar used, modification, and incubation time. The temporal development of browning and fluorescence of psicose-EW was relatively faster than those of fructose-EW and glucose-EW. The psicose-EW showed the greater 2,3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5carboxanilide (XTT) reducibility, 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid radical scavenging activity, and gelling rheological properties. These results indicated that psicose-EW as a food ingredient might have the ability to improve gelling behavior and decrease oxidation reactions during food processing and storage.