乳酸片球菌素PA-1在大肠杆菌中的表达与纯化

为了实现该细菌素的外源表达,本实验首先利用聚合酶链式反应从乳酸片球菌PAF中扩增出乳酸片球菌素PA-1的结构和免疫基因,然后克隆到表达载体pGEX-6p-1,构建了N端含有GST-His-DDDDK标签的重组质粒pGEX/his-pedAB,然后转化进入大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞,经异丙基硫代半乳糖苷诱导,重组乳酸片球菌素PA-1在大肠杆菌胞内成功表达。表达的融合蛋白先经过镍亲合层析柱纯化,然后注入谷胱甘肽S-转移酶亲和色谱柱用肠激酶处理,释放出成熟的乳酸片球菌素PA-1。利用高效液相色谱和质谱技术检测乳酸片球菌素PA-1纯度。以单核细胞增生李斯特氏菌CMCC54004为指示菌,利用琼脂扩散法检验乳酸片球菌素PA-1活性。结果表明,携带GST-His-DDDDK标签的融合蛋白无活性,标签切除后其抑菌活性恢复,且其纯度达90%以上。     

片球菌素的研究进展

片球菌素是片球菌分泌到胞外的一种小分子多肽,可以抑制单核细胞增多症李氏杆菌等多种病原菌和食品腐败菌,具有食品防腐保鲜的巨大潜力。本文对片球菌素的研究历史、基本理化性质、发酵条件、提取纯化方法、抑菌机理以及应用研究几方面进行了综述。      

片球菌素的研究进展

片球菌素是片球菌分泌到胞外的一种小分子多肽,可以抑制单核细胞增多症李氏杆菌等多种病原菌和食品腐败菌,具有食品防腐保鲜的巨大潜力.本文对片球菌素的研究历史、基本理化性质、发酵条件、提取纯化方法、抑菌机理以及应用研究几方面进行了综述.     

片球菌素的纯化及稳定性研究

片球菌素是一类具有良好热稳定性的未修饰的小分子蛋白质。其理化性质稳定,能抑制多种革兰氏阳性菌,对单核细胞增多症李氏杆菌抑制作用最为显著。文中着重总结了近年来在片球菌素稳定性及分离纯化方法领域的研究进展,同时也对其研究过程中存在的问题进行了探讨。     

广谱抗菌肽——片球菌素pediocin PA-1

片球菌素PA-1是一种广谱的乳酸菌细菌素,它对食品工业中的腐败菌单核细胞增生李斯特氏菌有强烈的抑制作用,是Ⅱa类细菌素中研究最深入的一种抗菌肽,具有很好的作为食品生物防腐剂开发的应用前景。对近年来关于片球菌素PA-1的结构、作用方式及在食品中的应用作一综述,并对其未来的应用前景,在蛋白质工程、基因工程和化学合成方面进行性质改进做出了展望。     

乳酸片球菌细菌素的活性及特性的研究

试验采用TGE（trypticase glucose yeast extlact）肉汤培养基作为乳酸片球菌的培养基，培养条件为37℃过夜静止培养。利用改变pH的方法，即通过菌体对细菌素的吸附与解吸，对细菌素进行分离纯化，试验表明细菌素对植物乳杆菌，绿脓杆菌，单核细胞增多症李氏杆菌，沙门氏菌，枯草杆菌，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157均有抑制作用。并且还具有耐热，耐盐的特性．     

对大肠杆菌异源表达乳酸片球菌素包涵体复性方法的研究

本研究对E.coli BL21（DE3）基因工程菌高效表达的乳酸片球菌素融合蛋白包涵体进行了提取和变性溶解,并采用稀释复性,反稀释复性,透析复性,CTAB辅助复性和CTAB和β-CD结合辅助复性五种方法对乳酸片球菌素融合蛋白包涵体的变性溶液进行了复性的研究。结果表明CTAB和β-CD结合辅助复性的复性方法优于其它的复性方法,可以实现以较高浓度的包涵体变性蛋白溶液,较小体积的复性液来获得较高浓度的复性产物和达到相对稳定的复性率。      

产片球菌素的乳酸片球菌培养条件的优化

通过正交实验对从泡菜中分离出的一株乳酸片球菌进行发酵条件的研究,结果发现乳酸片球菌素的产量除了与菌株自身性质有关外,其他发酵条件对片球菌素的产量和活性也有影响,包括培养基组分、培养基pH、培养温度以及培养时间,实验确定了产片球菌素的最佳培养基成分、最佳培养pH、最佳培养温度和最佳培养时间。      

乳酸片球菌素的抑菌方式

以单核细胞增多症李氏杆菌CVCC1595为指示菌,通过对乳酸片球菌素吸附率的研究,发现乳酸片球菌素的吸附受盐浓度、pH和细胞膜的成分影响显著.NaCl和磷酸盐浓度越高,吸附作用越小,在400mmol/LNaCl溶液中,乳酸片球菌素对菌体的吸附率为0;在pH 6.0吸附率最高(100%),pH 2.0和8.0的吸附率为24.4%,pH 10.0时乳酸片球菌素在菌体上无吸附.温度对吸附影响很小,在100℃时吸附率比室温时下降了1.56%;时间对吸附没有影响,乳酸片球菌素对指示菌的吸附作用应是由静电引力引起,其杀菌作用是使细胞膜形成孔洞,胞内物质外泄,从而导致细胞的死亡.     

pH吸附法纯化乳酸片球菌素的研究

将乳酸片球菌PA003接种于MRS液体培养基,37℃静置培养16h产生片球菌素.通过建立效价标准曲线来测定片球菌素的效价,为了确定片球菌素对产生菌细胞的pH吸附特性,研究在不同的pH条件下,片球菌素对产生菌细胞吸附率的大小.结果表明,在不同的pH条件下片球菌素活性较为稳定,而且对产生菌细胞的吸附率不同,pH6.0时吸附率可达60%,而在pH小于3.0或pH大于10.0时,吸附率为0.这一结果表明了片球菌素对细胞的吸附是具有pH依赖性的,这一特性将有助于对片球菌素的分离纯化.     

pH吸附法纯化乳酸片球菌素的研究

将乳酸片球菌PA003接种于MRS液体培养基,37℃静置培养l6h产生片球菌素。通过建立效价标准曲线来测定片球菌素的效价,为了确定片球菌素对产生菌细胞的pH吸附特性,研究在不同的pH条件下,片球菌素对产生菌细胞吸附率的大小。结果表明,在不同的pH条件下片球菌素活性较为稳定,而且对产生菌细胞的吸附率不同,pH6.0时吸附率可达60%,而在pH小于3.0或pH大于10.0时,吸附率为0。这一结果表明了片球菌素对细胞的吸附是具有pH依赖性的,这一特性将有助于对片球菌素的分离纯化。      

片球菌素产生菌的筛选及发酵条件优化

【目的】鉴定一株来源于泡菜能够产片球菌素的乳酸菌L131-1,并优化其产片球菌素的发酵条件。【方法】采用形态学观察、16S r DNA序列比对及生理生化实验鉴定;通过碳源、氮源、温度、初始p H、发酵时间的单因素优化实验以及响应面法获得最佳发酵条件。【结果】菌株L131-1被鉴定为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici),其最优发酵产酶条件为:蛋白胨16.59 g/L、酵母膏1.13g/L、牛肉膏16.37g/L、葡萄糖20g/L、无水乙酸钠2.6g/L、吐温801ml/L、七水硫酸镁0.58g/L、一水硫酸锰0.19g/L、三水磷酸氢二钾2.6g/L。培养基初始p H 6.0,37℃培养18h。在此条件下,片球菌素最大活性可达到820AU/m L,比优化前提高了近8倍。【结论】实验结果为片球菌素产生菌的筛选鉴定提供了经验,为片球菌素的应用提供了基础。     

产细菌素的戊糖片球菌的筛选及其细菌素的理化性质研究

从牛肉丸中分离筛选到1株具有抑菌活性的乳酸菌菌株N463,对单核细胞增生李斯特菌ATCC54003的生长具有良好的抑制作用.16S rDNA序列同源性分析鉴定乳酸菌N463为戊糖片球菌.在排除有机酸、过氧化氢的干扰后,确定该抑菌物质为蛋白类物质,即细菌素,命名为细菌素N463.理化性质研究表明细菌素N463具有较好的热...     

乳酸片球菌素二级结构与抑菌活性的关系

通过圆二色光谱法对乳酸片球菌素的二级结构进行研究,发现乳酸片球菌素的α-螺旋含量约为6.8%,β-折叠含量约为20%,转角所占比例为20%。当乳酸片球菌素的α-螺旋含量增加,β-折叠、转角含量降低时,细菌素活性随之降低,在pH6.0的低盐溶液中,乳酸片球菌素的结构稳定,此时抑菌活性最高;在pH12.0或者高浓度的盐溶液中,乳酸片球菌素α-螺旋含量增加至58%,β-折叠结构消失,细菌素活性丧失。      

蒙古干酪中产细菌素戊糖片球菌的筛选及其细菌素理化特性研究

利用打孔法从蒙古农户自制干酪样品中分离得到1株具有抑菌活性的乳酸菌C-2-1。在排除有机酸、过氧化氢的影响后,通过酶敏感性实验确定此抑菌物质为蛋白质类物质,即细菌素。经16S rDNA序列同源性分析鉴定其为戊糖片球菌。以单核细胞增生李斯特菌ATCC19114为指示菌,当戊糖片球菌C-2-1生长到稳定期22~26 h时,达到最大抑菌活性5 120 AU/mL;细菌素C-2-1对多种革兰氏阳性菌有较强的抑制作用,对供试的革兰氏阴性菌和酵母菌无明显抑制作用;对指示菌单增李斯特菌的作用方式为杀菌;在60~90℃及pH=2.0~9.0条件下抑菌活性稳定;对SDS、吐温-20、吐温-80、尿素、NaCl、EDTA不敏感;对其产生菌细胞表面无吸附性;通过Tricine-SDS-PAGE确定其分子质量在5.8~7.8 kDa。从蒙古干酪中筛选出的戊糖片球菌所产的细菌素C-2-1具有良好的热、酸稳定性,具有作为乳制品生物防腐剂的潜在应用价值。     

乳酸片球菌素二级结构与抑菌活性的关系

通过圆二色光谱法对乳酸片球菌素的二级结构进行研究,发现乳酸片球菌素的α-螺旋含量约为6.8%,β-折叠含量约为20%,转角所占比例为20%。当乳酸片球菌素的α-螺旋含量增加,β-折叠、转角含量降低时,细菌素活性随之降低,在pH6.0的低盐溶液中,乳酸片球菌素的结构稳定,此时抑菌活性最高;在pH12.0或者高浓度的盐溶液中,乳酸片球菌素α-螺旋含量增加至58%,β-折叠结构消失,细菌素活性丧失。     

戊糖片球菌表面蛋白性质及抑菌作用研究

以戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus) F28-8为研究对象,菌株的生长情况与产酸能力分析表明,F28-8具有良好的酸适应能力,透射电镜(TEM)观察表明其存在蛋白层结构。应用5 mol/L LiCl提取菌株表面蛋白并进行SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS分析,发现该菌株表面含有主要组分为分子量83.5 kDa的N-乙酰基胞壁酿-L-丙氨酸酰胺酶和分子量51. 1 kDa的LysM肽聚糖结合域蛋白。进一步的菌株表面性质测试、胶原蛋白黏附实验以及抑菌实验结果显示,表面蛋白的剥离显著降低了菌株F28-8的表面性质(自动聚集能力、表面疏水性和表面电荷),降幅达到19.0%～56. 1%;LiCl提取的F28-8表面蛋白能显著降低沙门氏菌(Salmonella enterica subsp. CICC 21513)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CICC 21600)对胶原蛋白的黏附力,降幅分别为74. 59%和81. 16%;LiCl提取的F28-8表面蛋白对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别达到31. 5%和15. 6%。研究结果表明,戊糖片球菌F28-8表面蛋白能改变菌体表面性质,增强其抑制致病菌黏附的能力并表现出一定的抑菌能力,在抗菌剂开发领域具有一定的应用潜力。     

从酸白菜中分离出一株产细菌素的乳酸片球菌

本试验从酸白菜中分离出一株有抑制单核细胞增多症李氏杆菌作用的菌株,经鉴定为乳酸片球菌,还对植物乳杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌等革兰氏阳性细菌有抗菌作用。该抗菌物质对蛋白水解酶敏感、对过氧化氢酶不敏感、耐热、在较宽的pH范围内保持活性。在排除是有机酸和过氧化氢后,初步认为该菌产生的抗菌物质为抗菌肽,即细菌素。     

发酵生产乳酸片球菌素的工业培养基及发酵条件优化

乳酸片球菌素对革兰阳性菌有很高的抑菌活性,作为天然防腐剂前景广阔。实验通过均匀设计的方法筛选了适合乳酸片球菌高密度发酵生产片球菌素的工业培养基,并在发酵罐上利用正交实验研究其最适的发酵条件。通过单因素实验在摇瓶的条件下考察了工业碳源、氮源以及无机盐对乳酸片球菌发酵生产片球菌素的影响,单因素实验结果显示糖蜜、玉米浆及磷酸氢二钾对乳酸片球菌素的效价影响显著。以上述显著因素作为随机因子,进行均匀设计实验,采用逐步回归方法对实验结果进行分析,实验结果表明,在糖蜜36.13 g/L、玉米浆9.00 g/L,磷酸氢二钾0.60 g/L时,乳酸片球菌素效价达到最大,即1309.60 AU/mL,是未优化前的2倍。在最佳工业培养基的条件下利用正交实验通过1 L的Li Flus GM发酵罐优化发酵条件,包括接种量、通风量及转速。实验结果表明:当接种量为2%、通风量为6 vvm、转速为150 r/min时,发酵生产的乳酸片球菌素效价达到最大为2347.28 AU/mL。     

乳酸片球菌R-4细菌素PA-1原核表达及其理化特性

为实现原核表达产出细菌素并检测其理化特性,作者将乳酸片球菌 R-4细菌素pedA基因进行扩增回收,与pMD19-T载体连接后转入E.coli DH5α感受态细胞进行克隆。提取克隆后的pedA基因与表达载体pET-32a（+）连接,形成重组质粒pET-32a-pedA并转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代半乳糖苷诱导,乳酸片球菌R-4细菌素PA-1在大肠杆菌细胞进行表达。表达蛋白质经Ni-NTA柱纯化后,以金黄色葡萄球菌为指示菌检测其理化特性。结果表明,在E.coli BL21(DE3)细胞中成功表达相对分子质量为26 000的乳酸片球菌R-4细菌素PA-1并完成纯化。纯化后的乳酸片球菌R-4细菌素PA-1在40~121 ℃作用20 min、在pH 2~12、紫外线照射0~10 h、过氧化氢酶作用2 h后,其抑菌范围分别为14.7~15.6 mm、14.0~16.5 mm、15.1~15.8 mm和14.9 mm,而分别经胃蛋白酶和胰蛋白酶作用2 h均失去抑菌作用。这表明乳酸片球菌R-4细菌素PA-1对高温、强酸强碱、紫外线和过氧化氢酶均具有较好的稳定性,而胃蛋白酶和胰蛋白酶会使其失活。