高产细菌素植物乳杆菌的诱变选育研究

为获得细菌素高产菌株,以植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JLA-9为出发菌株,对其进行亚硝基胍(NTG)诱变、常压室温等离子体(ARTP)诱变,以及基因组改组。结果表明,亚硝基胍诱变的最佳浓度为4 mg/m L,经筛选得到两株突变株N4-26、N4-27,其抑菌效价分别为2531.93、3057.32 IU/m L;常压室温等离子体诱变最佳时间为10 s,经筛选得到两株突变株ARTP10-37、ARTP10-61,其抑菌效价分别为2974.27、3261.62 IU/m L。将上述抑菌效价提高的菌株经四轮基因组改组后,得到一株突变株F4-2,其抑菌效价达到7374.76 IU/m L,相对于原始菌株提高了2.35倍,且遗传稳定性良好。研究表明理化诱变结合基因组改组的方式是快速获得理想菌株的有效方法。     

基因组改组快速提高谷氨酸棒杆菌L-鸟氨酸产量

以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌,应用基因组改组技术快速提高L-鸟氨酸产量。经过紫外线、亚硝基胍和甲基磺酸乙酯分别诱变处理,获得6株产量有所提高的突变株,以此构建用于基因组改组的候选菌库。考察培养基成分对原生质体再生率的影响。经过两轮的灭活原生质体递推式融合,以磺胺胍和氟化钠为双抗性筛选标记,共筛选出2株遗传性能稳定的改组菌株。其中改组菌株F2-6摇瓶发酵72h,积累L-鸟氨酸产量为2.99g/L,是出发菌株的13.6倍。结果表明基因组改组技术能够在短期内使谷氨酸棒杆菌的L-鸟氨酸产量得以提高。     

基因组改组选育氨肽酶和自溶度高的植物乳杆菌

利用基因组改组方法筛选出促进干酪成熟的非发酵剂乳酸菌。采用紫外线和亚硝基胍两种传统的诱变方法对植物乳杆菌进行诱变,通过检测自溶度、氨肽酶、产酸能力指标获得6株氨肽酶活性和自溶度均有所提高的突变菌株。以获得的突变菌株为出发菌株,应用灭火双亲原生质体融合后致死损伤得到的互补获得活性融合子的方法,对其进行基因组改组,经自溶度、氨肽酶、产酸能力筛选,获得1株遗传性能稳定的菌株,其氨肽酶活力为34.01个酶活单位,比出发菌株提高了3.09倍,自溶度为56.45%,比出发菌株提高了3.16倍。     

植物乳杆菌细菌素高产菌株的诱变选育及其对肉丸的防腐保鲜作用

为了提高细菌素产量并研究细菌素对肉制品的保鲜效果,本研究以植物乳杆菌JL-A65为出发菌株,对其进行常温等离子(ARTP)诱变、甲基硝基亚硝基胍(MNNG)诱变与基因组改组,并将细菌素与双乙酸钠复配后添加到肉丸中。结果表明,ARTP诱变最佳处理时间为40 s,经筛选得到两株突变株A7-10和A8-110,细菌素产量提高率分别为45.1%和48.9%。MNNG诱变的最佳处理浓度为1.5 mg/mL,经筛选得到两株突变株M2-58和M7-111,细菌素产量提高率分别为46.6%和31.3%。对植物乳杆菌进行基因组改组最终得到一株融合菌株F4-23,细菌素产量为413 mg/L,较原始菌株提高了103.48%。细菌素与双乙酸钠之间存在协同作用,可以使肉制品保质期较对照延长5 d。结论:利用理化诱变结合基因组改组可以获得细菌素高产菌株,细菌素与双乙酸钠复配后可以使肉丸保质期较对照延长5 d。细菌素对肉丸具有较好的防腐保鲜效果。     

应用基因组改组选育耐糖L-乳酸高产菌株

本研究应用基因组改组提高鼠李糖乳杆菌的耐糖能力,进而提高L-乳酸的产量。通过紫外线和亚硝基胍诱变方法获得8株改良出发菌株。考察了氨基酸前处理和变溶菌素对原生质体形成的影响。利用双亲灭活的原生质体进行递进式融合,经过两轮基因组改组和碳酸钙高糖平板及瓶筛选,选育出了耐糖改组菌株F2-2。在初糖浓度为150g/L发酵罐中,F2-2的乳酸产量为140g/L,是野生型乳杆菌的1.8倍。结果表明基因组改组技术能够快速提高乳酸菌耐糖和产酸能力两个表型。     

基因组改组快速提高日本小球藻脂肪产量

以日本小球藻为出发藻株,经过紫外线和甲基磺酸乙酯分别诱变处理,获得4株总脂产量有所提高的突变株。以聚乙二醇作为融合剂,对获得的突变株进行两轮递归式原生质体融合,筛选到遗传稳定的改组藻株F2C2,其总脂含量为59.01%,较原始藻株提高了101.4%。对日本小球藻的原始藻株和改组藻株F2C2的油脂含量进行分析,结果表明改组前后日本小球藻的总脂组成成分没有变化,但各组分含量有较大差别。     

发酵肉制品中益生性乳酸菌的快速筛选

利用一种快速的分离筛选法,即利用pH 2.5和1% 胆盐的MRS液体培养基,对自然发酵肉制品中耐高酸耐胆盐的乳杆菌进行富集,从中分离纯化得到77株乳杆菌.通过对分离菌株进行耐高酸(pH值2.5)、0.3%胆盐的生长的进一步测定,筛选出了21株耐酸及胆汁酸盐菌株,最后运用API 50CHL对筛选菌株进行了鉴定.这些菌株可活体摄入人体肠道,发挥其益生性,为益生性发酵剂开发奠定了基础.     

基于基因组改组的米曲霉沪酿3．042多亲株PEG介导融合育种

利用经过分生孢子的原生质体紫外线-氯化锂、NTG复合诱变得到的米曲霉沪酿3.042的8株突变株作为候选株文库,采用基因组改组(genome shuffling),利用原生质体,进行多亲株双灭活PEG介导融合,优化融合条件.以酪蛋白平板初筛,以及固体发酵测定中性蛋白酶酶活复筛,通过2轮融合操作,筛选出6株高产中性蛋白酶的融合株.其中融合菌株FII-41酶活达到7412U/g(干基),比原始出发菌株4212 U/g(干基)提高1.76倍,且遗传稳定.     

基于基因组改组的米曲霉沪酿3.042多亲株PEG介导融合育种

利用经过分生孢子的原生质体紫外线-氯化锂、NTG复合诱变得到的米曲霉沪酿3.042的8株突变株作为候选株文库,采用基因组改组(genome shuffling),利用原生质体,进行多亲株双灭活PEG介导融合,优化融合条件。以酪蛋白平板初筛,以及固体发酵测定中性蛋白酶酶活复筛,通过2轮融合操作,筛选出6株高产中性蛋白酶的融合株。其中融合菌株FII-41酶活达到7412U/g(干基),比原始出发菌株4212U/g(干基)提高1.76倍,且遗传稳定。     

基因组改组技术对L-乳酸产生菌耐热性的影响

采用紫外线与亚硝基胍(NTG)两种诱变方法获得用于基因组重组的出发菌株,应用灭活的多亲原生质体再融合获得活性融合子的方法,有效地提高了基因组改组后的筛选效率.采用低pH值平板和碳酸钙平板连续筛选的方法,筛选得到干酪乳杆菌改组菌株,具有较强耐酸性能,够在pH3.6 MRS平板上生长繁殖,产酸量为原始菌株的3.4倍,发酵温度提高到40℃,摇瓶发酵结果表明,改良菌株的代谢途径未发生变化.     

自然发酵东北酸菜中抗氧化乳酸菌的筛选及其益生性研究

目的 从自然发酵酸菜样品中筛选具有抗氧化活性的乳酸菌为蔬菜发酵提供优良菌种。方法 将筛选获得的71株乳酸菌经平板划线纯化培养,去除生长性差和遗传性能不稳定的菌株,筛选出23株乳酸菌进行抗氧化性能初筛,经初筛得到6株具有较好抗氧化潜力的乳酸菌。基于还原能力和自由基清除能力复筛并将具有最强抗氧化能力的菌株与常用的天然抗氧化剂,即抗坏血酸做对比,同时进行益生性研究,最后利用16S rRNA基因的序列对其进行鉴定。结果 初筛得到的6株乳酸菌均具有较好的抗氧化能力,且大部分菌株的菌体悬液抗氧化能力大于无细胞提取物。经益生性分析,所筛选6株乳酸菌理论上可通过胃肠环境定植于肠道并都属于高疏水性菌株。具有较高抗氧化活性的乳酸菌为SC3,其还原能力相当于270.58μmol/L L-半胱氨酸,其菌体悬液清除羟基自由基的能力(45.28%)显著高于0.1 mg/mL抗坏血酸(P<0.05),清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基的能力(43.66%)与0.1mg/mL抗坏血酸相近,其发挥抗氧化作用的关键为菌体悬液。结论 SC3经鉴定为植物乳杆菌(Lactiplantibacillus planta...     

多亲本原生质体融合构建高产谷胱甘肽菌株

基于多亲本原生质体融合技术提高酿酒酵母Y518产谷胱甘肽能力。结果表明,酿酒酵母Y518培养8h,经0.15%巯基乙醇前处理,酶解(酶浓度17.5g/L)60min,原生质体形成率达90%以上;在40% PEG6000(含5g/LCaCl2)诱导下融合,融合率可达2.6×10-5;通过4轮基因组改组,得到2株GSH产量提高的突变菌株,最高可达15.92mg/g,为原始菌株的2倍。     

发酵香肠益生型乳酸菌发酵剂的筛选

从主要自然发酵肉制品中分离、纯化得到77株耐酸耐胆汁的乳酸菌,并进一步对分离菌株进行了耐高酸(pH2.5)、0.3%胆盐的生长实验.25株在pH值2.5,培养3 h后表现出较高存活性,21株经低酸预处理后在0.3%胆盐存在的情况下生长良好.最后运用API 50CHL对筛选菌株进行了鉴定.这些菌株可作为进一步筛选发酵香肠优良乳酸菌种的出发菌株,以便筛选品质优良的益生性乳酸菌,作为新型发酵香肠发酵剂.     

高产EPS乳酸片球菌的航天育种及其EPS性能研究

本文旨在对乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）进行航天诱变，筛选高产胞外多糖（Exopolysaccharide,EPS）的诱变菌株，并探究其产EPS的功能特性。通过测定EPS产量和遗传稳定性，筛选出一株性能稳定并高产EPS的L21-49菌株，比较了原始菌株及突变菌株的自聚性和疏水性，以及对酸、胆盐及人工模拟胃、肠液的耐受性，并分析其产EPS的抗生物被膜、抗氧化活性和对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制效果。结果表明，菌株经航天诱变后，EPS产量为196.23 mg/L，比原始菌株L21产量提高了26.54%；该菌株的自聚性和疏水性良好；体外耐受性较好，在pH为2、3的条件下其活菌数可维持在107 CFU/mL；在胆盐浓度为4.00 g/L时，其活菌数可保持在107 CFU/mL；经过人工模拟胃肠液处理，该菌株活菌数可维持在106 CFU/mL，其所产EPS具有良好的体外抗氧化能力：浓度为8.0 mg/mL时，对DPPH自由基、OH自由基、ABTS+自由基和O 2-自由基的清除率分别为91.75%、38.44%、54.71%、58.84%；对金黄色葡萄球菌（St...     

基因组改组技术快速提高拟微绿球藻油脂含量

以拟微绿球藻(Nannochloropsis oculata)为原始藻株,经过紫外线和甲基磺酸乙酯分别诱变处理,获得5株油脂含量有所提高的出发藻株。以PEG作为融合剂,对获得的5株出发藻株进行两轮递归式原生质体融合,筛选到遗传稳定的改组藻株F2N2和F2N4,其油脂含量分别达到55.32%与57.75%,较原始藻株分别提高了69.07%与76.50%。对拟微绿球藻的原始藻株和改组藻株的油脂脂肪酸组成及含量进行分析,结果表明改组前后拟微绿球藻的油脂脂肪酸组成变化不大,但脂肪酸含量有较大差别。     

基因组改组技术选育苯基乳酸高产菌株

以Lactobacillus paracaseiW2为出发菌株,应用紫外诱变和亚硝基胍诱变筛选出5株突变菌株（U4、U7、U12、N3、N6）．采用突变菌株进行多母本递推式原生质体融合,最终筛选出一株正向突变株F8,其发酵液中苯基乳酸含量为1．92g／L,比原始菌株提高了1．37倍。并且确定了最佳破壁条件为：溶菌酶浓度20g/L,变溶菌素浓度为15ug／mL;最佳融合条件为：常温下,聚乙二醇的浓度为50％,作用时间为10min。     

弱后酸化保加利亚乳杆菌突变菌株的遗传稳定性研究

对从传统乳制品中筛选得到的德氏乳杆菌保加利亚亚种自发突变株KLDS 1.9201-4的遗传稳定性进行研究。将突变菌株进行连续传代,观察形态学变化,利用HPLC分析葡萄糖和乳酸的代谢情况,RAPD分析基因组DNA的稳定性。结果表明,突变菌株KLDS1.9201-4能够稳定遗传至第8代,在传代过程中菌落和菌体特征没有发生明显变化,KLDS 1.9201-4对初始葡萄糖的代谢率逐渐升高,终产物中乳酸的浓度也逐渐升高。KLDS 1.9201-4的基因组DNA相对稳定,没有发生明显变异。弱后酸化德氏乳杆菌保加利亚亚种的自发突变株KLDS 1.9201-4具有适宜的遗传稳定性,可被用于制作弱后酸化的酸奶发酵剂。     

随机诱变和基因组重排选育阿维拉霉素高产菌

以绿色产色链霉菌(Streptomyces viridoehrongenes 2-21)为原始出发菌株,依次进行常压等离子(atmospheric and room temperature, ARTP)和2轮~(137)Csγ诱变,从中筛选出高产阿维拉霉素的突变株,作为基因组重排的亲本菌株,以利福平为筛选剂,经过4轮原生质体递归融合,最终得到1株遗传稳定的高产阿维拉霉素重组菌株H_4-15。摇瓶发酵结果表明,阿维拉霉素产量可达到(2 155.48±7.81) mg/L,中试发酵结果表明,阿维拉霉素产量达到(2 356.44±6.34)mg/L,是原始出发菌株的3.47倍。高产菌株H_4-15发酵产物的LC-MS结果显示,其主要组分是阿维拉霉素A和阿维拉霉素B。综合表明,以利福平为筛选剂,结合传统随机诱变和基因组重排技术选育阿维拉霉素高产菌株,能大幅提升其生产能力,具有工业化生产的潜在价值。     

高产红曲色素和Monacolin K红曲霉菌的诱变选育

采用紫外-氯化锂复合诱变方法筛选高产红曲色素及Monacolin K的红曲霉菌株,最佳诱变条件为紫外诱变时长2min,氯化锂浓度0.6‰。对突变株菌落形态进行初筛,对红曲色素和Monacolin K含量检测进行复筛,并进行遗传稳定性实验,得到了高产红曲色素、Monacolin K且遗传稳定性能好的突变菌株QH12,其红曲色素色价达到2450U/g,Monacolin K产量达1.68mg/g,分别是原始菌株的1.84倍和4.67倍,相对于原始菌株有较大提高。     

采用全基因组改组技术选育蛋白酶高产菌株

为了提高枯草芽孢杆菌B4的蛋白酶产量,采用全基因组改组技术进行菌株选育,先通过紫外诱变构建了B4菌的突变体库,在优化其原生质体制备和再生条件的基础上,以其中4株诱变菌株(BRS1、BRS2、BRS5、BRS6)作为亲本,采用PEG介导的方法进行两次多亲本的全基因组改组,同时,结合双亲灭活的筛选方法,共筛选出3株酶活力大幅度提高并能稳定遗传的优良菌株,为BRS1、BRS5、BRS6,酶活力最高达2175.81U/mL,达到原始菌株的3.01倍。