重组SARS病毒N蛋白的制备及其初步应用

目的在大肠杆菌中表达重组SARS-CoVN蛋白,并进行纯化,为进一步研制SARS早期诊断试剂奠定基础。方法通过RT-PCR获得SARS-CoVN蛋白基因片段,并克隆至大肠杆菌表达载体pQE30中,构建重组质粒。转化E·coliM15,IPIG诱导表达。经SDS-PAGE和Western blot鉴定,采用Chelating-Sepharose Fast Flow纯化融合蛋白,并免疫BALB/c小鼠,检测小鼠血清抗体水平。结果所构建的重组表达载体pQE30-N经诱导可表达重组SARS病毒N蛋白。该蛋白纯化后,纯度可达90%左右。Western blot检测表明,重组SARS病毒N蛋白可与SARS患者恢复期血清呈现特异的免疫反应。免疫BALB/c小鼠可获得高效价抗血清。结论重组SARS-CoV N蛋白具有良好的抗原性,可用于SARS-CoV感染的早期诊断。     

输血传播病毒ORF2基因的克隆和原核表达

目的克隆输血传播病毒(TTV)兰州株ORF2的基因,并构建原核表达载体。方法通过巢式PCR,从一份兰州地区无偿献血员血清中扩增TTV病毒的ORF2基因,并克隆到pGEM-T载体中,进行核苷酸序列分析。然后亚克隆到高效表达质粒pET22b(+)中,构建表达载体ORF2-pET22,在大肠杆菌中诱导表达带有6个组氨酸标签的ORF2融合蛋白。用纯化的重组ORF2蛋白作为抗原,ELISA检测人血清样本中的TTV-IgG抗体。结果ORF2基因与日本TA287株的同源性为99.3%。用TTV-PCR阳性的血清对重组蛋白进行了Western blot,结果在表达蛋白位置处出现了特异性反应条带。以ORF2蛋白为抗原的ELISA检测结果具有较好的准确性。结论已成功克隆了ORF2基因,并在原核细胞中表达。     

呈现埃博拉病毒包膜糖蛋白抗原表位重组病毒样颗粒的构建

目的构建呈现埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)包膜糖蛋白(glycoprotein,GP)抗原表位的病毒样颗粒(viruslike particles,VLPs)。方法通过EBOV GP抗原性预测,并结合其功能结构域分析获得潜在的B细胞表位,经基因重组将该抗原表位插入至乙肝核心抗原(HBcAg)的优势表位区域,SDS-PAGE法分析重组HBcAg抗原表位嵌合蛋白的表达。重组菌体破碎上清经硫酸铵沉淀和蔗糖密度梯度离心纯化后,通过电镜观察VLPs形态。将VLPs与Alum佐剂按1∶1的比例混合,经背部皮下免疫小鼠。ELISA及Western blot法检测小鼠血清的特异性。结果重组HBcAg抗原表位嵌合蛋白的相对分子质量约19 300,纯化后蛋白浓度为1.244 mg/ml,镜下可见其以VLPs形式存在。VLPs免疫小鼠血清可与GP发生特异性免疫反应。结论成功构建了呈现EBOV GP抗原表位的VLPs,其可有效诱导小鼠产生特异性免疫应答。本实验为EBOV基因重组疫苗的研究及特异性抗体的制备奠定了基础。     

狂犬病病毒CTN-1株G蛋白的原核表达及基本功能评价

目的原核表达狂犬病病毒(rabies virus,RV)CTN-1株G蛋白,并评价其基本功能。方法采用RT-PCR法扩增RV CTN-1株G蛋白基因,插入原核表达载体p GEX-5X-1,构建重组表达质粒p GEX-5X-1-CTN,转化入Rosetta(DE3)p Lys S,IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经亲和层析纯化后,采用间接ELISA法检测其与阳性血清的结合性能及亲和力。结果重组表达质粒经双酶切及测序证实构建正确;纯化的重组蛋白RV-G相对分子质量约85 000,纯度可达85%,能与阳性血清特异性结合,且具有较好的区分性,与阳性血清的亲和力常数为1.2×1010 M-1。结论成功原核表达、纯化获得了纯度较高、特异性较好、亲和力较强、灵敏度较高的RV CTN-1株G蛋白,为研究G蛋白的抗原表位、建立针对RV G蛋白的ELISA抗体检测方法及其中和抗体的分选检测奠定了基础。     

结核分枝杆菌肝素结合血凝黏附素的原核表达及其在结核病血清学诊断中的应用

目的原核表达与纯化结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)肝素结合血凝黏附素(heparin-binding haemagglutinin adhesion,HBHA),并初步评估其在结核病血清学诊断中的价值。方法采用PCR法从M.tb H37Rv基因组中扩增hbha基因,克隆至原核表达载体p ET-28a(+),构建重组表达质粒p ET-28ah,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组HBHA(r HBHA)蛋白经Ni2+亲和层析柱纯化后,Western blot法分析其抗原特异性。收集71例确诊的结核病患者和30名健康体检者血清,采用ELISA法检测血清中的抗HBHA Ig A、Ig G抗体水平,并以ESAT-6、Ag85A作为对照抗原,评估r HBHA在结核病血清学诊断中的价值。结果重组表达质粒p ET-28ah经酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在,经Ni2+亲和层析柱纯化,可得到高纯度的r HBHA蛋白;纯化的r HBHA蛋白可与小鼠抗His-tag单克隆抗体特异性结合;结核病患者(TB)组血清中抗r HBHA、ESAT-6、Ag85A抗原特异性Ig G水平均显著高于健康对照(HC)组(P0.05),且TB组的r HBHA抗原特异性Ig A水平也显著高于HC组(P0.05),而两组间ESAT-6、Ag85A抗原特异性Ig A水平差异无统计学意义(P0.05);ROC曲线分析显示,r HBHA抗原检测Ig A的诊断效能较好,曲线下面积为0.711,其他两种对照抗原ESAT-6、Ag85A的Ig A诊断效能一般,曲线下面积分别为0.512和0.531。结论 r HBHA抗原用于结核病的诊断效能较好,可作为结核病血清学诊断的备选抗原之一。     

HCV核心区全基因片段的表达及产物抗原活性分析

目的 表达并纯化核心基因全片段,以得到良好特异性的核心蛋白。方法 自克隆载体pUC19/HCV-C中切下核心基因全片段,将其插入带有His 6纯化标签的融合表达质粒pTrcHisA中,转化入大肠杆菌,经IPTG诱导,通过SDS-PAGE、中和抑制ELISA和Western blot对占菌体总蛋白15％以上的表达产物进行鉴定,用IMAC一步法纯化,纯化产物检测HCV阴阳性血清标本,并与日本东燃公司核心抗原C_(11)检测结果进行比较。结果 核心基因全片段插入pTrcHisA载体,转化入大肠杆菌TOP10后构建成功稳定的表达株PTrcHisA/HCV-C/TDP10,用纯化产物检测血清标本,与日本东燃公司核心抗原C_(11)检测结果的阳性均值与阴性均值之比及A值分布基本相同。结论 表达抗原具有良好的免疫反应性和特异性。     

呼吸道合胞病毒F2蛋白与结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6蛋白的融合表达及纯化

目的在大肠杆菌中融合表达呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)F2蛋白与结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)早期分泌抗原靶6(Early secretory antigenic target-6,ESAT-6)蛋白,并进行纯化。方法分别从MTB标准菌株H37Rv及含F蛋白全长基因的pMD18-T-f质粒中扩增esat-6-f2基因,插入原核表达载体pET-30a中,构建重组表达质粒pET-30a-esat-6-f2,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,经镍离子亲和层析柱纯化。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;重组融合蛋白ESAT-6-F2相对分子质量约为21 000,主要以包涵体形式表达,可与小鼠抗His单克隆抗体特异性结合;纯化的融合蛋白纯度可达90%以上。结论成功在大肠杆菌中表达并纯化了重组融合蛋白ESAT-6-F2,为进一步研究其免疫原性和免疫保护性奠定了基础。     

人胎盘泌乳素的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化人胎盘泌乳素(Human placenta lactogen,hPL)。方法从正常产妇新鲜胎盘组织中提取组织总RNA,PCR扩增hPL基因,将其亚克隆至pQE-30载体,构建重组表达质粒,转化感受态大肠杆菌M15(pREP4),经IPTG诱导表达。表达产物经Sephacryl S-200层析柱纯化,纯化产物经SDS-PAGE和western blot鉴定其纯度和特异性。结果重组菌pQE-hPL/M15(pREP4)经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约23 000,主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的67%;纯化后目的蛋白纯度可达90%以上;纯化蛋白和hPL包涵体均可与羊抗hPL多克隆抗体特异性结合,具有较强的特异性和抗原性。结论已成功制备了纯度较高的hPL蛋白,为基因工程制备抗体提供了抗原。     

弓形虫信号转导蛋白14-3-3的高效表达及免疫学诊断的初探

目的　构建弓形虫信号转导蛋白 14 -3- 3基因的重组质粒 ,并在E .coli中高效表达 ,用于免疫学诊断。方法　以限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切质粒pGEM T/Toxo 14 - 3- 3,获得弓形虫信号转导蛋白 14 - 3 -3编码基因片段 ,插入载体pET2 8a ,转化E .coliBL2 1,IPTG诱导表达 ,在非变性条件下纯化融合的表达产物 ,通过Westernblot和ELISA检测其特异的免疫反应性。结果　所构建的弓形虫信号转导蛋白 14 -3 -3(rToxo 14 - 3- 3)在原核系统中的重组表达质粒 ,以 6个His融合蛋白的形式得到高效表达 ,其表达量占细菌裂解液中总蛋白量的 4 9 .2 %。该重组抗原经纯化能被弓形虫感染的人血清所识别。用rToxo 14- 3 -3作为抗原 ,ELISA检测弓形虫病具有高度的敏感性和特异性。结论　rToxo 14 - 3- 3在大肠杆菌中已得到高效表达 ,该重组抗原能有效检测弓形虫的感染 ,可用于弓形虫病诊断试剂盒的研制。     

肠道病毒71型3C基因原核表达质粒的构建表达及纯化

目的构建肠道病毒71型(Entervirus71,EV71)3C基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中进行表达并纯化。方法以病毒的反转录产物为模板,PCR扩增EV71 3C基因,克隆至pGEx-4T-1载体中,构建重组表达质粒pGEx-3C,转化大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达的重组融合蛋白GSR-3C经GST-Agarose亲和层析和分子筛层析纯化后,Western blot检测其反应原性。结果重组表达质粒pGEx-3C经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量约46 000,表达量约占菌体总蛋白的50%,主要以可溶性形式表达;纯化后的重组融合蛋白纯度大于90%,可与小鼠抗EV71单克隆抗体特异性结合。结论成功构建了重组表达质粒pGEx-3C,在大肠杆菌中高效分泌表达并纯化了重组GST-3C融合蛋白,为EV713C蛋白酶结构与功能的研究及3C靶向药物和疫苗的研究奠定了基础。     

重组猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白的原核表达及鉴定

目的原核表达猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白,并对其反应原性进行分析。方法通过PCR从已构建的猪源戊型肝炎病毒全基因克隆扩增ORF2编码382~674位氨基酸序列的基因片段,将扩增产物插入到pMD18-T载体中,亚克隆至原核表达载体pET28a(+),构建pET28a-293表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTA层析柱纯化后,进行SDS-PAGE、Western blot及ELISA鉴定。结果成功扩增到904bp的目的基因。重组载体pET28a-293经双酶切鉴定及序列测定,证实构建正确。SDS-PAGE分析表明表达产物的相对分子质量与预期相符,表达量可占菌体总蛋白的66.15%。Western blot分析表明目的蛋白具有较好的反应原性。ELISA试验证实目的蛋白能与阳性猪源和标准HEV血清发生反应。结论已成功构建了猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白的pET28a-293原核表达载体,并得到了有效表达,为进一步建立猪源戊型肝炎的诊断方法奠定基础。     

狂犬病病毒糖蛋白富集表位基因克隆及其在原核系统中的表达

目的构建狂犬病病毒标准强毒株(CVS-24)糖蛋白富集表位基因原核表达系统。方法通过RT-PCR扩增CVS-24株糖蛋白两段表位富集区基因,并将其克隆至载体pET-28a(+),构建重组表达质粒pET-G1和pET-G2,转化大肠杆菌Rosetta,IPTG诱导表达。表达产物分别经12%SDS-PAGE和Western blot检测。结果大肠杆菌可高效表达目的基因,所表达的蛋白可被狂犬病病毒标准阳性血清所识别。经薄层扫描分析,目的蛋白表达量可占菌体总蛋白的42%(G1)和34%(G2)。结论已成功构建了狂犬病病毒标准强毒株(CVS-24)糖蛋白富集表位基因原核表达系统,所表达的目的蛋白具有良好的免疫反应性,有可能作为检测狂犬病病毒血清抗体的候选基因。     

戊型肝炎病毒ORF2蛋白与新型融合标签Halo Tag的融合表达

目的在大肠杆菌KRX中表达戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)ORF2与新型融合标签Halo Tag融合蛋白。方法采用RT-PCR法从4型HEV毒株中扩增ORF2基因部分片段(aa 382~620),插入含新型融合标签Halo Tag的原核表达载体pFN18the中,构建重组表达质粒pFN18the-ORF2,转化大肠杆菌KRX,鼠李糖诱导表达Halo-ORF2融合蛋白,纯化后Western blot分析融合蛋白的反应原性。结果经RT-PCR扩增出717 bp的目的基因片段;重组表达质粒pFN18the-ORF2经双酶切和测序鉴定构建正确;表达的融合蛋白Halo-ORF2相对分子质量为57 900,表达量约占菌体总蛋白的15%,以包涵体形式表达,纯化后纯度达90%以上,可与HEV IgG阳性血清特异性结合。结论在大肠杆菌KRX中表达了Halo-ORF2融合蛋白,为HEV结构蛋白抗原表位的筛选及戊肝血清学诊断的研究奠定了基础。     

C型口蹄疫病毒VP1基因的串联与原核表达

目的构建C型口蹄疫病毒VP1基因原核表达系统,并鉴定其表达产物的免疫反应性。方法首先合成C型口蹄疫病毒C-S8C1株VP1基因的3个抗原表位,并克隆到pMD18-T载体上,再按设计的酶切位点酶切后连接,构建出C型VP1双拷贝基因片段(VP1C)。将VP1C基因连接到原核表达载体pET-CKS上,构建重组质粒pETCKS-VP1C,转入BL21菌中进行原核表达。采用SDS-PAGE和Western blot检测其表达产物,并利用包涵体洗涤法对表达产物进行初步纯化。结果VP1C基因在大肠杆菌中获得表达,产量占沉淀蛋白的45%,且表达产物可以被C型口蹄疫病毒标准血清所识别。VP1C重组蛋白纯度达84.1%。结论已成功构建了C型口蹄疫病毒VP1基因原核表达系统,所表达的VP1C有良好的免疫反应性,可以作为检测C型口蹄疫病毒的候选基因。     

弓形虫亲环蛋白基因的克隆及原核表达

目的克隆并原核表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)亲环蛋白(Cyclophilin,CyP)基因。方法收集、纯化Rh株弓形虫速殖子,提取总RNA,应用RT-PCR技术扩增TgCyP基因,插入原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-TgCyP,转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果测序结果与GenBank中登录的基因序列同源性为100%,重组表达质粒pET-28a-TgCyP经PCR及双酶切鉴定证明构建正确。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白的相对分子质量约为26000,表达量约占菌体总蛋白的40%,Western blot显示其能被鼠抗弓形虫免疫血清识别。结论已在E.coliBL21(DE3)中表达了Rh株TgCyP,其有望作为弓形虫疫苗的候选抗原。     

幽门螺杆菌粘附素基因hpaA的克隆、表达及鉴定

目的　克隆幽门螺杆菌粘附素基因hpaA ,构建其原核表达系统并鉴定融合蛋白免疫原性。方法　采用PCR技术从幽门螺杆菌总DNA中扩增hpaA基因 ,T -A克隆后测定核苷酸序列 ,构建pET30a的HpaA表达载体 ,在E .coliBL2 1DE3宿主菌中用IPTG诱导表达 ,Ni2 + 柱纯化后经Westernblot鉴定其免疫原性。结果　所克隆的hpaA基因与报道的相应核苷酸序列同源性为 94 . 8%～ 97. 3% ,氨基酸序列同源性为 94 . 6 %～ 97 .7% ,在 134～ 139位存在一段KRTIQK结构 ,HpaA融合蛋白在pET30a载体中可高效表达 ,经纯化后可获得高纯度的重组蛋白。结论　成功构建HpaA原核表达系统 ,所表达的融合蛋白具有较好的免疫原性 ,可作为Hp疫苗的候选抗原。     

汉坦病毒SEO型S基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

目的构建汉坦病毒SEO型S基因原核表达载体。方法应用RT-PCR方法扩增汉坦病毒SEO型的YZG-Changchun株S基因,克隆至pMD18-T载体中,经酶切鉴定及PCR分析后,定向克隆入原核表达载体pET-28a中,转化E.coliRosetta,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析外源蛋白的表达情况。结果表达载体经双酶切和测序证明构建正确。IPTG浓度为1.0 mmol/L,诱导4.5 h时,S基因在原核细胞中得到了高效表达,表达的蛋白占菌体蛋白总量的37%,纯化后的蛋白具有良好的抗原活性。结论已成功构建了汉坦病毒SEO型S基因原核表达载体,并得到高效表达。     

结核分枝杆菌ATP依赖的丝氨酸蛋白酶蛋白水解亚基1基因的原核表达

目的构建结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)ATP依赖的丝氨酸蛋白酶蛋白水解亚基1(ATP-dependent Clp proteolytic subunit 1,ClpP1)基因重组原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达重组蛋白。方法从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中PCR扩增ClpP1基因,插入原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a(+)-ClpP1,转化大肠埃希菌B21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒pET-32a(+)-ClpP1经双酶切和测序鉴定,证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约35 000,可与鼠抗His单克隆抗体特异性结合。结论成功构建了重组表达质粒pET-32a(+)-ClpP1,并在大肠埃希菌中表达了重组蛋白,为进一步研究ClpP1蛋白在MTB中的生物学特性奠定了基础。     

西方马脑炎病毒E2基因的克隆与原核表达

目的克隆并原核表达西方马脑炎病毒(Western equine encephalomyelitis virus,WEEV)E2基因。方法采用PCR法从重组质粒pVL1393-C-E中扩增E2基因,插入原核表达载体pET-30a(+)中,构建重组表达质粒pET-30a(+)-E2,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒pET-30a(+)-E2经PCR、双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为52 900,诱导6 h目的蛋白的表达量较高,约占菌体总蛋白的23.5%,重组蛋白主要以包涵体形式存在,可与鼠源His单克隆抗体特异性结合。结论克隆并原核表达了WEEV E2基因,为E2蛋白免疫原性及WEEV亚单位疫苗的研究奠定了基础。