化学酶法合成γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸

以Bacillus subtilis NX-2产γ-谷氨酰转肽酶为催化剂,以L-谷氨酰胺和S-苄基-L-半胱氨酸为底物,利用转肽反应合成了S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸,考察了反应时间、初始酶浓度、供体/受体比以及投料方式等条件对反应过程的影响.结果表明,在L-谷氨酰胺浓度为20 mmol/L,S-苄基-L-半胱氨酸浓度为20 mmol/L,酶浓度为0.0208 U/mL以及pH9条件下,于40℃水浴中反应3 h,S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氦酸得率为5.14 mmol/L,对谷胺酰胺的转化率为25.7%.采用分批投料方式可有效提高谷氨酰供体转化率.S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸以三氟甲磺酸脱除苄基保护基,经RPC纯化后可得产物GGC,产物纯度为91.2%,收率为75.7%.     

固定化γ-谷氨酰转肽酶催化合成γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸

以环氧基树脂Eupergit C250L为载体对B.subtilis NX-2 GGT进行了共价固定化.固定化酶的最适作用pH为9.0,最适作用温度为60℃.固定化酶的热稳定性和贮存稳定性均较游离酶有显著的提高,经100 d 20个批次转化后,固定化残余酶活仍能保持初始值的80%左右.以固定化酶为催化剂,在反应条件为L-谷氨酰胺(Gln)20 mmol/L、S-苄基-半胱氨酸(S-Bzl-cys)20 mmol/L、酶浓度0.0375 U/mL和pH 9.0条件下,40℃水浴反应22 h,转肽产物S-苄基-y-L-谷氨酰-L-半胱氨酸(S-Bzl-GGC)得率为4.3 mmol/L,较游离酶提高了11.96%.S-Bzl-GGC经酸解脱除保护基后可得γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸,产物纯度可达94.1%.     

离子交换法分离S-苄基-g-L-谷氨酰-L-半胱氨酸

采用离子交换法对酶法合成的S-苄基-g-L-谷氨酰-L-半胱氨酸(S-Bzl-GGC)进行了分离纯化. 研究了Q Sephrose FF阴离子交换树脂对S-Bzl-GGC的吸附等温线,很好地符合Sips吸附等温线模型. 考察了pH值、洗脱梯度、流速和进样量等条件对纯化效果的影响,建立了一套基于Q Sephrose FF阴离子交换树脂的纯化方案. 结果表明,在pH 8.2、洗脱梯度0~30% B(Tris-HCl缓冲液+1 mol/L NaCl) 12 mL、流速2 mL/min、进样量500 mL的优化条件下,经一步分离,产物纯度可达98.5%,经1H-NMR鉴定产物结构正确.     

γ-谷氨酰转肽酶的酶学性质及其转肽反应机制

γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,GGT)能专一地催化γ-谷氨酰基的转移,在γ-谷氨酰基类衍生物的合成方面具有重要的应用价值.今利用Bacillus subtilis NX-2发酵生产GGT,上清液中的GGT经硫酸铵沉淀后,以DEAE Sepharose FF和 Source 15 Q 两步离子交换进行纯化.以γ-D-Gln-L-Trp(SCV-07)为目的产物,研究了GGT的基本酶学性质,确定了其最适反应温度为40 ℃,最适Ph值10.0, 供体/受体浓度为5:7,最适反应时间为4 h,产物转化率可高达42%.结合反应进程曲线,分析了GGT的作用机制,并通过实验证实了GGT不仅具有转肽活性,还可催化产物的不可逆水解,这是导致产物回收率下降的关键原因.经测定得到GGT的转肽反应米氏常数(Km)为5.08 mmol·L-1,最大反应速率(rmax)为0.034 mmol·(min·L)-1;对γ-D-Gln-L-Trp的水解反应米氏常数(Km')为2.267 mmol·L-1,最大反应速率(rmax')为0.012 mmol·(min·L)-1.     

有序介孔TiO_2固载γ-谷氨酰转肽酶催化合成S-bzl-γ-Glutamyl-L-Cysteine

以有序介孔TiO2(OM-TiO2)为载体对B.subtilis NX-2GGT进行吸附固载.圆二色光谱分析和活性位点滴定结果表明,固定化前后酶的二级结构和活性位点数变化很小,固定化后GGT对供体的亲和力及转肽反应催化常数均有不同程度下降,但固定化酶对产物的亲和力有明显提高.固定化后GGT的热稳定性和pH稳定性均较游离酶有显著提高,固定化酶稳定性良好,经10批次转化后,固定化催化活性仍保持74%.以固定化GGT为催化剂,在L-谷氨酰胺(L-Gln)5mmol/L、S-苄基-半胱氨酸(S-bzl-cys)15mmol/L、酶浓度0.062U/mL和pH9.0条件下,40℃水浴反应5h,产物浓度为1.2mmol/L.     

γ-谷氨酰转肽酶及其应用

γ-谷氨酰转肽酶(EC2 3 2 2,γ-GT)在生物体内分布相当广泛,从细菌到哺乳动物体内都有它的存在。该酶能催化3种类型的反应、转肽反应,自转肽反应和γ-谷氨酰基的水解反应。γ-GT在临床检测中可作为生物标志物,已经用作肝脏和其他疾病的常规检测指标。该酶在生物催化合成中也有相当重要的应用,利用此酶可以合成多种含γ-谷氨酰基的化合物。     

S-苄基-L-半胱氨酸的合成

由溴化苄和L-半胱氨酸直接合成S-苄基-L-半胱氨酸,通过正交试验及统计分析,检验了各影响因子的显著性,确定了最佳工艺条件为：反应时间2.5h,反应温度45℃,原料配比n（溴化苄）：n（L-半胱氨酸）=1：1.在此条件下反应,摩尔产率可达到95%.     

S-苯基-L-半胱氨酸合成的反应动力学及反应机理的研究

运用过量浓度法和微分法研究合成S-苯基-L-半胱氨酸的反应速率随反应物浓度变化的规律,确定了S-苯基-L-半胱氨酸合成反应的速率常数和反应级数,建立了反应速率方程,同时探讨了反应机理,为进一步优化反应条件提供了理论基础,并且通过实验找到了反应的最佳条件。     

有序介孔TiO2固载g-谷氨酰转肽酶催化合成S-bzl-g-glutamyl-L-cysteine

以有序介孔TiO2(OM-TiO2)为载体对B. subtilis NX-2 GGT进行吸附固载. 圆二色光谱分析和活性位点滴定结果表明,固定化前后酶的二级结构和活性位点数变化很小,固定化后GGT对供体的亲和力及转肽反应催化常数均有不同程度下降,但固定化酶对产物的亲和力有明显提高. 固定化后GGT的热稳定性和pH稳定性均较游离酶有显著提高,固定化酶稳定性良好,经10批次转化后,固定化催化活性仍保持74%. 以固定化GGT为催化剂,在L-谷氨酰胺(L-Gln) 5 mmol/L、S-苄基-半胱氨酸(S-bzl-cys) 15 mmol/L、酶浓度0.062 U/mL和pH 9.0条件下,40℃水浴反应5 h,产物浓度为1.2 mmol/L.     

酶法制备γ-D-glutamyl-L-tryptophan的动力学模型

以酶法合成γ-D-glutamyl-L-tryptophan (γ-D-Glu-L-Trp)为研究体系,采用D-谷氨酰胺为γ-谷氨酰基供体,L-色氨酸为受体,测定得到了转肽反应的米氏常数（K _m）为5.11 mmol·L^-1,催化常数（K_cat）为3.92 mmol·min^-1,γ-D-Glu-L-Trp的水解反应米氏常数（K′_m）为2.31 mmol·L^-1,催化常数（K′_cat）为1.46 mmol·min^-1。采用顺序反应机制建立了酶法制备γ-D-Glu-L-Trp的过程动力学模型,并进行了参数优化。经验证,所建模型可准确预测该体系中的反应进程,模型数值解与实验值的平均相对误差小于5%。     

酶法拆分氮-15标记S-苄基-半胱氨酸的研究

S-苄基-半胱氨酸是化学法制备氮-15（^15N）标记胱氨酸及其衍生物的重要前体,以S-苄基-D,L-半胱氨酸为拆分底物,对氨基酰化酶酶促拆分工艺如反应温度、初始pH值、酶和底物的用量、反应时间等工艺参数进行了考察。在较佳的工艺条件下,苄基-L-半胱氨酸拆分的单程收率达到45%,未出现同位素丰S-度稀释现象。     

色氨酸合成酶酶法合成S-苯基-L-半胱氨酸

利用重组色氨酸合成酶催化合成S-苯基-L-半胱氨酸,考察了反应温度、pH、底物摩尔比和底物浓度对色氨酸合成酶酶活的影响。最佳转化条件为:反应温度为37℃,pH=8,苯硫酚与L-丝氨酸的适宜底物摩尔比为1.2∶1,底物最适合浓度为400 mmol/L,反应达到平衡时间为16 h,底物L-丝氨酸摩尔转化率达到91%,苯硫酚与色氨酸合成酶活性位点Ser 235和Gly 233形成稳定的氢键。     

色氨酸合成酶酶法合成S-苯基-L-半胱氨酸的研究

利用重组色氨酸合成酶催化合成S-苯基-L-半胱氨酸,考察了反应温度、pH、底物摩尔比和底物浓度对色氨酸合成酶酶活影响。最佳转化条件为：反应温度为37 篊,pH为8,L-丝氨酸与苯硫酚的适宜底物摩尔比为1:1.2,底物最适合浓度为400 mmol/L,反应达到平衡时间为16 h,底物L-丝氨酸摩尔转化率达到91%,苯硫酚与色氨酸合成酶活性位点Ser 235和Gly 233形成稳定的氢键。     

S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶及其抑制剂的研究进展

S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶(SAHase)是目前唯一已知催化S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)可逆水解成高半胱氨酸和腺苷的酶,SAH是所有依赖S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的生物甲基转移反应的产物。SAHase抑制剂可以通过抑制SAH的催化水解,反馈性抑制SAM介导的甲基化过程从而抑制病毒m RNA的复制转录。近年来,SAHase已成为药物设计的热门靶标,SAHase抑制剂已表现出抗病毒、免疫抑制、抗肿瘤、抗菌等多种药理活性,SAHase抑制剂也取得了较大的进展,本文就近年来报道的SAHase及其抑制剂进行综述。     

O-苄基-L-酪氨酸合成工艺改进

D-苄基-L-酪氨酸是合成新型抗糖尿病药物PPARr／α激动剂手性中间体s(-)3-(4-羟基苯基)-2-乙氧基丙酸乙酯的重要原料。本文在氢氧化钠作用下,L-酪氨酸、硫酸铜、溴化苄反应得到D-苄基酪氨酸铜配合物,然后采用EDTA-2Na-锅法的后处理新工艺,得到D-苄基-L-酪氨酸。该后处理方法,省去了用稀盐酸-氨水或稀盐酸-乙醇钠反复处理的麻烦,且产物无需重结晶,收率提高了22．6％。     

侧链带有手性基团的聚半胱氨酸-b-聚环氧丙烷-b-聚半胱氨酸嵌段共聚物的合成

首次合成了侧链带有手性基团的聚半胱氨酸-b-聚环氧丙烷-b-聚半胱氨酸嵌段共聚物。首先炔丙基溴和L-半胱氨酸反应,合成了S-炔丙基-L-半胱氨酸,产物与三光气反应,合成S-炔丙基-N-羧基-L-半胱氨酸-环内酸酐(NCA);然后用大分子引发剂双端氨基聚环氧丙烷引发S-炔丙基-N-羧基-L-半胱氨酸-环内酸酐(NCA)开环聚合,制得了聚环氧丙烷-聚(S-炔丙基-L-半胱氨酸)嵌段共聚物;最后由N3-L-亮氨酸与共聚物侧链上的炔键发生Click反应,制得了侧链连有手性基团的嵌段共聚物。用1H NMR、IR、GPC和元素分析等方法对所得嵌段聚合物结构进行了表征。     

N-(4-羟基-L-脯氨酰基)-L-丝氨酸的合成

以N-叔丁氧羰基-O-苄基-L-丝氨酸和N-叔丁氧羰基-4-羟基-L-脯氨酸为原料,经由羟基保护,二环己基碳二亚胺(DCC)缩合,脱保护基等步骤合成了4-羟基-L-脯-L-丝二肽。     

Ca2+对枯草芽孢杆菌γ-谷氨酰转肽酶活性和热稳定性的影响

γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,GGT)可将γ-谷氨酰基从酰基供体催化转移至相应的受体上,形成新的γ-谷氨酰基化合物.今针对GGT稳定性差的缺陷,采用添加Ca2+的方法对其进行稳定化.研究了Ca2+对枯草芽孢杆菌GGT活性及热稳定性的影响.以4 mmol·L-1 CaCl2于37℃下...     

聚丙烯酸-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)接枝共聚物的合成与表征

采用溶液聚合法直接合成聚丙烯酸(PAA),通过接枝反应合成了新型两亲性PAA-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)(PBLG)接枝共聚物,分析了PAA与PBLG的相对分子质量及结构,并通过1H-核磁共振(1H-NMR)、红外光谱(IR)对共聚物进行了表征。结果表明,随着引发剂偶氮二异丁腈用量的增加或聚合温度的升高,PAA的数均相对分子质量减小;随着引发剂正丁胺用量的增加,PBLG的黏均相对分子质量减小。共聚物中含有接枝到PAA链上的疏水性PBLG,同时还含有未反应的亲水性羧基;共聚物在NaCl或NaOH水溶液中形成的球形胶束具有明显的核壳结构。     

两亲性聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)-b-聚丙烯酸的合成

以聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)为原料制备聚肽型溴代异丁酰化聚(γ-苄基-L-谷氨酸)大分子引发剂,通过引发丙烯酸叔丁酯的原子转移自由基聚合,然后水解制备了两亲性聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)-b-聚丙烯酸。用核磁共振和凝胶渗透色谱法对该嵌段共聚物的结构进行了表征,并用透射电子显微镜研究了嵌段共聚物在氯化钠水溶液中的聚集状态。结果表明,聚丙烯酸链段的引入,使聚合物在氯化钠水溶液中形成囊泡状胶束。