TTC在发酵木糖高产乙醇的休哈塔假丝酵母选育中的应用

TTC可以作为筛选发酵葡萄糖产酒精能力强的酵母茵的显色剂,但发酵木糖产乙醇的酵母茵的代谢和发酵途径与之相比都有所不同,本实验用TTC作为初筛显色剂筛选发酵木糖产酒精能力较强的休哈塔假丝酵母.紫外诱变后从TTC平板上挑取显红色菌株150株进行摇瓶发酵测定乙醇产量,得到的正突变率为29%,负突变率为10%;挑取显白色菌株100株,得到的正突变率为0,负突变率为56%.将紫外诱变后产量已经有所提高的突变株S28进行氮离子注入诱变,从TTC平板上挑取显红色菌株100株进行摇瓶发酵测定乙醇产量,得到的正突变率为20.05%,负突变率为10.14%,其中的部分突变株的产量相比S28又有所提高.可见TTC能将乙醇产量较低的菌株淘汰,筛选出乙醇产量高的休哈塔假丝酵母菌.     

不同物理诱变方式对休哈塔假丝酵母产乙醇的影响

采用不同物理方式（紫外线、He-Ne激光和微波）对休哈塔假丝酵母（Candida albicans）进行诱变,结合致死率、正突变率、乙醇产量等试验,分析不同诱变因子对该菌株发酵木糖的影响。结果表明,三种物理诱变对菌株诱变能力有差别,具有代表性的紫外线突变株（ZW-6）、He-Ne激光突变株（HN-3）及微波突变株（WB-3）的乙醇产量分别为17.44 g/L、18.49 g/L和18.11 g/L,较原始菌株分别提高13.91%、20.77%和18.29%;乙醇得率分别为0.35 g/g、0.38 g/g和0.37 g/g,较原始菌株分别提高13.80%、23.17%和19.50%。与紫外线及微波各诱变菌株相比,He-Ne激光诱变菌株的正突变率高,激光照射10 min时,正突变率高达48.62%;He-Ne激光诱变菌株的木糖利用率、乙醇产量、乙醇得率均提高最多,提高的范围最大,分别较原始菌株提高1.69%～44.77%、13.12%～40.59%、29.73%～47.75%。因此,确定He-Ne激光为最佳物理诱变因子。     

运动发酵单胞菌和休哈塔假丝酵母混合发酵秸秆产乙醇

首先考察了运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis,Z.mobilis)和休哈塔假丝酵母(Candida shehatae,C.shehatae)分别利用葡萄糖或木糖为唯一底物时的乙醇发酵特性;其次,研究了单菌及双菌发酵混合糖(葡萄糖和木糖比例为3∶1)的产乙醇性能;在此基础上,考察了单菌和双菌培养应用于玉米秸秆发酵产乙醇的可行性。结果表明,Z.mobilis和C.shehatae的接种方式显著影响混合糖发酵产乙醇的效率,当分步接种发酵48 h后,乙醇产量达到最高,为25.77 g/L。当以60 g/L Na OH预处理的玉米秸秆为底物时,分步接种可高效利用秸秆酶解产物(葡萄糖和木糖)实现乙醇产量的最大值(22.34 g/L),提示Z.mobilis和C.shehatae分步接种发酵可最大化地发酵秸秆中的葡萄糖和木糖生产乙醇,有利于乙醇的高产率生产,可为实现纤维原料生产燃料乙醇的工业化提供参考。     

休哈塔假丝酵母发酵木糖生产乙醇的研究

木糖发酵是木质纤维素发酵的关键,休哈塔假丝酵母是自然界木糖发酵性能较好的天然酵母之一.研究了装液量、转速、木糖浓度、有机氮源等条件对休哈塔假丝酵母CICC 1766发酵木糖生产乙醇的影响,探讨休哈塔假丝酵母的乙醇耐受能力.结果表明,休哈塔假丝酵母对酒精的耐受能力达3%vol.在28℃,初始pH值5.0,160 r/min,250 mL三角瓶装液量150 mL,木糖浓度60 g/L,玉米浆0.5%(v/v),含尿素0.024%的条件下,休哈塔假丝酵母发酵木糖能产乙醇20.52 g/L,得率达到理论值的74.5%.     

秸秆制乙醇的休哈塔假丝酵母与酿酒酵母共混SSCF工艺优化

提出一种3阶段同步糖化共发酵(SSCF)工艺。采用0.9 mol/L丁酮溶液爆破法处理稻米秸秆,对休哈塔假丝酵母与酿酒酵母共混制乙醇工艺进行了优化与放大探讨。结果表明,用30 L通风发酵罐采用摇瓶发酵优化后的工艺条件,当爆破秸秆浓度8%(w/w);用15 U/g(绝干秸秆)纤维素酶、3.5 U/g(绝干秸秆)β-葡萄糖苷酶与12 U/g(绝干秸秆)木聚糖酶为混合酶酶解体系,在50℃搅拌下酶解25.1 h;接入8%酿酒酵母在37℃发酵34.1 h;再接入7.8%休哈塔假丝酵母在35℃、通风量0.3 L/(min·L)下混合发酵6 d时,乙醇收得率可达26.9 g/100 g(绝干秸秆),秸秆原料中葡萄糖、木糖能被分别利用91.4%与84.7%。该研究结果为无添加营养物发酵方法的应用以及木质纤维原料高效发酵转化为乙醇提供了参考。     

耐酒精绿色木霉与休哈塔假丝酵母偶联固态发酵纤维素酒精的研究

研究耐酒精绿色木霉与休哈塔假丝酵母偶联固态发酵纤维素酒精的发酵条件,考察菌种混合比例、接种量、发酵温度与发酵时间对酒精得率的影响,结果表明,在固态酒精发酵过程中,菌种混合比例与发酵温度是影响酒精得率的关键性因素,最佳工艺条件是:绿色木霉与休哈塔假丝酵母菌种混合比例为1:1,接种量为15%,发酵温度为35℃,发酵时间132h。在此工艺条件下酒精得率为481ml/kg,酒精得率明显提高。     

酵母属间融合构建高温发酵木糖生产乙醇优良菌株

通过单倍体分离和诱变获得 8株休哈塔假丝酵母 1 766和高温酿酒酵母G47的营养缺陷型突变株。并通过聚乙二醇 (PEG)和电诱导融合等方法 ,实现了能发酵木糖产生酒精的休哈塔假丝酵母和高温酿酒酵母之间的融合。融合子经DNA含量、细胞体积测定和稳定性能试验证明为稳定的融合子。F 71融合子能在 45℃下发酵木糖生产酒精 ,其在 45℃发酵木糖所产酒精体积分数为 1 .675 % ,其转化率为 68.8%。且与亲株比较 ,F 71的酒精耐受能力提高了 1 %。     

高强度产甘油假丝酵母突变株的选育及其发酵性状

以一株产甘油假丝酵母为出发菌株 ,采用化学诱变 ,通过玉米浆和外加无机磷组成的磷质量浓度为 3 40mg/L的磷源选择培养基 ,得到了一株发酵时间较原菌株缩短了 8h左右 ,产甘油能力 (甘油产量约为 1 40 g/L ,甘油转化率为 5 6% )和原菌株相似的突变株 ,并研究了突变株的发酵性状 .     

利用木糖高产乙醇酵母菌发酵条件的研究

以蒙假丝酵母JS-73为出发菌株,逐渐增加底物中木糖浓度,对该菌株利用木糖产乙醇的能力进行了驯化,并优化该菌利用木糖生产乙醇的工艺和培养基成分.结果表明,驯化后,木糖利用率为67.21％,酒精产量达到7.41 g/L.确定了发酵培养基的最优组合为:木糖60 g/L,酵母粉0.6 g/L,K2HPO41.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.4 g/L,在该条件组合下,菌株JS-73的乙醇产量为10.27 g/L,是理论产量的37.21％.确定了发酵最优条件为:温度31℃,pH5,转速70 r/min,接种量11％,装液量120 mL/250 mL,在此条件下,乙醇产量达最高,为18.95 g/L.     

发酵木糖生产乙醇菌株的筛选与鉴定

从花圃土和腐朽树皮中各筛选得到一株可以发酵木糖产生乙醇的菌株。乙醇产量分别可达到6.98g/L和6.05g/L。经过18SrDNA同源性的分析,菌株3鉴定为间型假丝酵母（Candida intermedia）,而菌株621则为热带假丝酵母（Candida tropicalis）。对其发酵木糖、葡萄糖和混合糖的产物蒸馏后用气相色谱分析,主产物为乙醇,纯度高,副产物少。两菌株为下一步的菌种基因改造工作提供了研究基础。     

Candida shehatae 的纯化及其利用木糖和葡萄糖发酵的特性研究

通过对休哈塔假丝酵母TZ1 分离纯化以获取高产乙醇菌株,并对木糖、葡萄糖以及不同比例的混合糖发酵产乙醇进行实验研究。结果显示,筛选出的TZ8-13 对木糖和葡萄糖都有良好的发酵性能,糖浓度为60g/L 时的乙醇产量分别达到了21.6g/L 和24.2g/L,糖利用率分别为97.81%(72h)和99.13%(36h),较初始菌株TZ1 发酵木糖乙醇产量提高了55.38%、木糖利用率提高了19.54%;混合糖发酵存在糖的二次利用关系,TZ8-13 首先利用葡萄糖。木糖和葡萄糖比为1:1 时乙醇产量为22.8g/L。     

利用木糖高产谷胱甘肽酵母菌株的诱变选育及培养条件优化

以CT1463(热带假丝酵母)为出发菌株,经紫外诱变结合镉盐平板筛选,获得-株高产谷胱甘肽的突变株CV26,其谷胱甘肽产量和舍量分别为45.4mg/L和7.05mg/g,较出发菌株提高了41%和52%.对CV26发酵条件进行了优化,在优化发酵条件下谷胱甘肽产量和含量分别为128.70 mg/L和14.31 mg/g,分...     

利用木糖高产乙醇酵母菌的ARTP诱变选育

为了提高酵母菌利用木糖发酵产乙醇的能力,将分离得到的野生菌株异常威克汉姆酵母A42通过常温常压等离子体（ARTP）技术进行诱变处理,从中选育具有优良性能的高产乙醇突变菌株。结果表明：诱变处理时间120 s为最佳诱变条件,在该条件下对A42进行诱变,此时致死率达到97.53%。对该条件下ARTP诱变后的菌株进行两轮的筛选得到突变菌株A42-338,发酵60 h乙醇含量为20.78 g/L,其乙醇产量较出发菌株提高了42.59%,且传代8次各代乙醇产量变化率不超过2.50%。将异常威克汉姆酵母A42-338在油茶籽壳发酵培养基中发酵60 h乙醇含量为19.88 g/L,还原糖残糖含量为9.06 g/L,其中木糖残糖含量为1.79 g/L,葡萄糖残糖含量为7.27 g/L,木糖利用率为84.61%,葡萄糖利用率为81.05%,糖转化率为0.40 g乙醇/g糖。因此,ARTP诱变是一种高效可行的酵母菌育种方法。     

双真菌偶联固态发酵纤维素酒精的研究

研究了耐酒精绿色木霉与休哈塔假丝酵母偶联固态发酵纤维素酒精的发酵条件,考察菌种混合比例、总接种量、发酵温度与发酵时间对酒精得率的影响。结果表明,在固态酒精发酵过程中,菌种混合比例与发酵温度是影响酒精得率的关键性因素,最佳工艺条件是：绿色木霉与休哈塔假丝酵母菌种混合比例1：1、总接种量15%、发酵温度35℃、发酵时间132h。在此工艺条件下酒精得率为481ml/kg,酒精得率明显提高。     

新型产乙醇重组菌利用葡萄糖和木糖的乙醇发酵

对构建得到的新型产乙醇重组菌JM109(pEtac-PA)、947(pEtac-PA)利用不同浓度葡萄糖或木糖的乙醇发酵进行了初步研究。结果表明,重组菌的乙醇发酵受到发酵碳源的类型、发酵液中糖浓度、发酵培养基的装液量、发酵液的pH值、重组菌的宿主类型等多种因素的影响。以野生型菌株E.coli 947为宿主的重组菌947 (pEtac-PA)发酵产乙醇的能力和乙醇得率均高于JM109(pEtac-PA),尤其是在装液量加大、高浓度糖发酵以及利用木糖发酵时更加明显。     

不同条件对木糖酒精发酵菌种发酵性能的影响

对从自然界中筛选出一株能利用木糖产酒精的菌株1125-3进行发酵性能的研究,研究了不同条件下自筛菌生长和发酵的规律.自筛菌株定向驯化后对木糖的利用率可达92.92%,酒精得率达12.88%.菌株1125-3的最适生长温度为30℃、pH范围为4.6～5.0;最适发酵温度为37℃、pH为6.0左右,用尿素作为单一氮源,自筛菌1125-53的生长和发酵情况良好.自筛菌的混合糖发酵效果优于单纯木糖发酵,在2.5%葡萄糖与2.5%木糖做混合碳源发酵时,其酒精得率达到了纯葡萄糖发酵水平.     

热带假丝酵母木糖还原酶的酶学性质研究

研究了从热带假丝酵母(Candida tropicalis)菌体中获得的木糖还原酶(XR)的酶学性质。实验结果证实,C.tropicalis的细胞浆粗提液经盐析、透析及阴离子交换柱层析后得到的酶液中木糖还原酶比酶活为9·3U/mg、最适酶反应pH为6·0、最适反应温度为35℃;以木糖为底物时,Km·Xyl为64·8mmol/L、Km·N·X为0·0622mmol/L;以阿拉伯糖为底物时,Km·Ara为172mmol/L、Km·N·A为0·0375mmol/L。Zn2+是木糖还原酶的激活剂,Fe3+为抑制剂。固定木糖为反应底物,分别以NADPH及NADH为辅酶测定酶活,实验结果显示该菌体中木糖还原酶的活性主要依赖于辅酶NADPH。     

酿酒酵母代谢木糖工程菌的构建

通过PCR方法从休哈塔假丝酵母基因组DNA中克隆得到木糖还原酶(XR)基因XYL1和木糖醇脱氢酶(XDH)基因XYL2,将其分别连接到酵母表达载体pYES2上,得到重组表达载体pYES2-XYL1和pYES2-XYL2,从pYES2-XYL1上克隆得到含半乳糖启动子的XYL1,将其连接到pYES2-XYL2序列的下游,得到重组表达载体pYES2-XYL1-XYL2,通过电转化方法将pYES2-XYL1-XYL2转入酿酒酵母宿主菌INVSc1。在初始pH为5.5,温度为33℃,前5h转速为150r/min,后变为50r/min的条件下,乙醇产量为33.45g/L。