发酵优化制备L-赖氨酸盐酸盐-13C6、15N2

采用北京棒杆菌（Corynebacterium pekinense）ZLD118（HS^-、AEC^r）发酵制备稳定同位素双标记的L-赖氨酸盐酸盐-¹³C₆、¹⁵N₂。对菌种的发酵培养条件和发酵培养基配方进行优化,采用优化后的发酵工艺制备高丰度稳定同位素¹³C、¹⁵N双标记L-赖氨酸,经离子交换树脂提纯、活性炭脱色精制后,产品的¹³C丰度达98.61%,¹⁵N丰度为98.15%,纯度为98.47%,产率为88.8%。结果表明,该工艺可进一步用于放大制备。     

~(15)N标记L-亮氨酸

采用生物发酵法制备15N标记的L-亮氨酸。以实验室选育获得的突变株黄色短杆菌TLU53-8为出发菌株,研究适用于15N标记L-亮氨酸生产的实验配方、发酵工艺、提纯工艺。结果表明,菌株发酵产酸量18 g/L。产品中15N同位素丰度98%,15N纯度99%。此工艺适用于制备高品质15N标记L-亮氨酸,具有较高的经济价值。     

~(13)C_3-三聚氰酸、~(15)N_3-三聚氰胺的合成工艺研究

研究了以稳定性同位素标记物13C-尿素和15N-氯化铵为原料制备质谱检测用内标物13C3-三聚氰酸、15N3-三聚氰胺的合成工艺;考察了温度、压力、溶剂等对产品收率的影响,优化了合成工艺,以良好收率合成了同位素内标试剂13C3-三聚氰酸和15N3-三聚氰胺。产品经高效液相色谱(HPLC)、质谱(MS)检测,化学纯度99%,同位素丰度98%。以上结果提示,所合成的13C3-三聚氰酸和15N3-三聚氰胺可作为同位素内标使用。     

~(13)C,~(15)N_3-盐酸氨基脲合成方法的优化

采用13C,15N2双标记尿素和15N2标记水合肼为原料,经回流反应一步合成13C,15N3-盐酸氨基脲。通过单因素考察和正交实验对13C,15N3-盐酸氨基脲的合成工艺进行优化,得到最优反应条件为:15N2-水合肼与13C,15N2-尿素的进料摩尔比为1.4∶1,加热温度为135℃,反应时间为4.5 h。采用此优化合成条件单步合成反应收率90%,13C,15N3-盐酸氨基脲纯度≥98%,13C丰度≥97%,15N丰度≥99%。结果显示,该方法具有反应周期短,产物收率高,后处理简便易行等优点。     

稳定同位素~(13)C或D标记对甲氧基苯甲酸的合成

稳定同位素标记对甲氧基苯甲酸是防腐剂、香料及药物等稳定同位素标记内标试剂合成中的重要中间体。本文以尼泊金乙酯(对羟基苯甲酸乙酯)和碘甲烷-~(13)C或碘甲烷-D3为原料,碱性条件下经2步反应合成对甲氧基苯甲酸-甲氧基-~(13)C和对甲氧基苯甲酸-甲氧基-D3。通过单因素实验确定适合的反应温度、物料摩尔比、反应时间,优化工艺参数为:反应温度为80℃,物料摩尔比n(碘甲烷-~(13)C/D3)∶n(尼泊金乙酯)=1.15∶1,反应时间为6h。产品经液质联用仪(LC-MS)测试化学纯度和同位素丰度、经核磁共振(1 H NMR)进行结构确认,对甲氧基苯甲酸-甲氧基-~(13)C的收率为91.12%,碘甲烷-~(13)C利用率为79.32%,产品熔点为186.5~187.8℃,化学纯度为99.1%,~(13)C同位素丰度为99.0%;标记对甲氧基苯甲酸-甲氧基-D3的收率为90.49%,碘甲烷-D3利用率为78.70%,产品熔点为186.3~188.1℃,化学纯度为99.0%,D同位素丰度为98.1%。     

吉西他滨-~(13)C,~(15)N_2及其代谢产物的合成

以自制的尿素-~(13)C,~(15)N_2为前体,与3-乙氧基丙烯腈反应制备胞嘧啶-~(13)C,~(15)N_2,用BSA保护后,经与2-脱氧-2,2-二氟-D-赤式-五呋喃糖-3,5-二苯甲酯-1-甲磺酸酯反应生成2′,2′-二氟-2′-脱氧胞嘧啶核苷-3′,5′-二苯甲酸酯-~(13)C,~(15)N_2,分离纯化后经NaOH水解生成吉西他滨-~(13)C,~(15)N_2,再进一步降解脱氨得到吉西他滨-~(13)C,~(15)N_2代谢产物。产品经HPLC,LC-MS和~1H NMR表征确定,化学纯度高于98%,~(13)C同位素丰度为99%,~(15)N同位素丰度为98%。结果表明,合成的吉西他滨-~(13)C,~(15)N可用于药物代谢研究。     

~(15)N标记L-胱氨酸

以15NH4Cl为起始原料,通过改进的Gabriel方法得到S-苄基-D,L-半胱氨酸,再经酶法拆分和解保护后得到15N标记L-胱氨酸。对影响各步反应收率的主要因素进行了考察,在较优的工艺条件下,以15NH4Cl计,15N标记L-胱氨酸收率为13.5%,产物经HPLC、红外、质谱和元素分析等证实,质谱分析表明未出现同位素丰度稀释现象。     

同位素标记原儿茶酸-(~(13)COOH)的合成研究

设计了以3,4-二甲氧基溴苯为原料,经格利雅反应制备得到格式试剂,通入13 C标记的13 CO2气体,制备得中间体3,4-二甲氧基苯甲酸-(13 COOH)。将中间体用BBr3脱除甲基后得到粗产品,粗产品再经过活性炭脱色,冷却结晶得到原儿茶酸-(13 COOH)。设计的合成路线操作简单,工艺流程短,副产物少,收率可达45%,13 C同位素丰度稀释低。产物经HPLC、MS、1 H NMR和13 C NMR表征,结果表明:制备的原儿茶酸-(13 COOH)化学纯度99%,13 C同位素丰度98%,作为重要的示踪剂,可为医药和化工领域研究提供基础。     

微生物发酵法批量制备高丰度~(15)N同位素标记L-精氨酸

采用均匀设计实验方法建立5L罐发酵生产L-精氨酸-~(15)N_4的优化调控模型。在菌体生长24h进入产酸阶段,控制转速820r/min,pH7.8,温度30℃,通气2.5L/min,流加总量60%的葡萄糖,理论产酸最高可达到22.49g/L,验证实验产酸19.69g/L,达到理论高值的88%。利用~(15)N丰度99.68%的尿素和丰度99.43%的硫酸铵发酵生产得到L-精氨酸-~(15)N_4的产品丰度为98.7%,化学纯度为98.5%,丰度下降1%。可以满足批量生产的要求。     

~(13)C核磁共振法定量分析~(13)C标记正十六酸

~(13)C核磁共振定量技术既可应用于~(13)C标记化合物的结构定位,标记定量,又可间接应用于~(13)C标记化合物的制备过程中。 J.N.Shoolery曾用~(13)C核磁共振法测定植物油中脂肪酸组成,但误差较大;后来关剑秋等人从样品的自旋-晶格弛豫时间(T_1)的缩短、核的NOE效应的消除及核磁共振参数设定等方面进行了进一步探讨。我们采用微样品技术(φ1.7mm、C/H双探头、取样量为毫克     

L-亮氨酸-U-13C6的研制

本工作以黄色节杆菌ATCC39106为出发菌株,通过诱变选育,获得突变株TS151,并研究了适用于¹³C标记 L-亮氨酸生产的发酵工艺、提纯工艺。结果显示,最佳发酵条件为：发酵温度28 ℃、220 r/min摇床、培养时间92 h。在此条件下,发酵产酸稳定在15 g/L以上,提取收率稳定在70%。产品¹³C标记 L-亮氨酸丰度达到97.03%,纯度达98%以上。     

胸腺嘧啶-~(15)N_2的合成与表征

以甲酸乙酯和丙酸乙酯为原料,在金属钠存在下缩合得到中间体2-甲酰丙酸乙酯,中间体在酸催化下与同位素尿素-15 N2缩合,在甲醇钠作用下环化反应得到胸腺嘧啶-15 N2。合成方法操作简单,工艺流程短,副产物少,收率可达80%,15 N同位素丰度稳定。产物经HPLC、IR、MS、1 H NMR和13 C NMR表征,结果表明:产物化学纯度99%,15 N同位素丰度98atom%。     

稳定同位素~(13)C标记乙醇

以Ba13CO3为原料,采用碳化锂方法制备乙炔,再经催化水合法和NaBH4还原,制备了13C-乙醇。考察了反应温度、助催化剂等合成工艺对产物收率的影响。设计的合成路线反应条件温和,总收率高于50%。产品经红外、色谱和核磁检测,化学纯度99%,13C同位素丰度95%,产物的同位素丰度相对原料而言降低3%。     

~(15)N标记S-苄基-L-半胱氨酸含量及其同位素丰度检测

建立了一种测定发酵液中15N标记S-苄基-L-半胱氨酸(SBC)含量的高效液相色谱法(HPLC),该方法采用Cosmosil C18(5μm,150 mm×4.6 mm)色谱柱为分离柱,2,4-二硝基氟苯为衍生剂,0.05 mol/L乙酸钠缓冲溶液(pH=6.5,含10 mL/L N,N-二甲基甲酰胺)与V(乙腈)∶V(水)=3∶1为流动相,梯度洗脱,流速1.0 mL/min,检测波长为350 nm,柱温为30℃;并采用微量高温燃烧-质谱法对15N标记SBC样品的同位素丰度进行了检测。结果显示,SBC浓度为0.2~1.0 g/L时,与其峰面积呈良好的线性关系,y=3×106x-4.16×104,R2=0.998 6,平均加标回收率97.30%,检测限为3.95×10-4g/L,测定结果的相对标准偏差为0.55%;15N标记SBC丰度检测时,最小称样量为2 mg,最佳反应温度为530℃,反应时间为3 h;15N丰度测定值的相对标准偏差为0.17%。     

稳定同位素13C或D标记对甲氧基苯甲酸的合成

稳定同位素标记对甲氧基苯甲酸是防腐剂、香料及药物等稳定同位素标记内标试剂合成中的重要中间体。本文以尼泊金乙酯(对羟基苯甲酸乙酯)和碘甲烷-¹³C或碘甲烷-D₃为原料,碱性条件下经2步反应合成对甲氧基苯甲酸-甲氧基-¹³C和对甲氧基苯甲酸-甲氧基-D₃。通过单因素实验确定适合的反应温度、物料摩尔比、反应时间,优化工艺参数为：反应温度为80 ℃,物料摩尔比n(碘甲烷-¹³C/D₃)∶n(尼泊金乙酯)=1.15∶1,反应时间为6 h。产品经液质联用仪（LC-MS）测试化学纯度和同位素丰度、经核磁共振（¹H NMR）进行结构确认,对甲氧基苯甲酸-甲氧基-¹³C的收率为91.12%,碘甲烷¹³C利用率为79.32%,产品熔点为186.5~187.8 ℃,化学纯度为99.1%,¹³C同位素丰度为99.0%;标记对甲氧基苯甲酸-甲氧基-D₃的收率为90.49%,碘甲烷-D₃利用率为78.70%,产品熔点为186.3~188.1 ℃,化学纯度为99.0%,D同位素丰度为98.1%。     

离心法生产~(131)Xe同位素技术研究

为利用离心分离方法将~(131) Xe同位素丰度浓缩到90%以上,本研究采用多组分矩形级联算法进行级联计算,分析中间组分的分离特性,研究级联长度、供料位置、级联分流比等参数对分离效果的影响。对分离~(131) Xe同位素的矩形级联分离方案进行优化,制定生产丰度为90%以上的~(131) Xe运行方案,通过解决~(131) Xe同位素分离过程中的级联工况调整与稳定、中间组分浓缩等关键技术,最终经8遍分离获得丰度为93.786%的公斤级~(131) Xe产品,证明级联生产高丰度~(131) Xe产品的可行性。     

茶叶中多种氨基酸~(15)N同位素丰度的检测研究

建立了气相色谱-质谱联用(GC-MS)测定茶叶中丙氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、茶氨酸、谷氨酰胺氨基酸同位素丰度的检测方法。茶叶样品经浸泡提取后,经N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(MSTFA)进行衍生,在优化的色谱-质谱条件下,6种目标氨基酸衍生物均检出。验证了丙氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、茶氨酸、谷氨酰胺的15 N同位素丰度在10%~98%内均可以被准确测定。建立的方法精密度优于0.6%,绝对偏差小于0.6%。所建立的方法样品前处理简单,同位素丰度检测准确,可满足茶叶中标记氨基酸同位素丰度检测,该方法也可推广至不同农作物中氨基酸同位素丰度的检测,为植物中氨基酸相关转化路径及代谢循环研究提供技术支持。     

通过~(12)C(~(11)B,~7Li)~(16)O反应研究~(12)C(α,γ)~(16)O天体物理S_(E2)因子

正~(12)C(α,γ)~(16)O被认为是最重要的核天体物理反应之一。作为3α反应合成~(12)C后的后续反应,该反应强烈影响着宇宙中碳氧同位素(主要为~(12)C和~(16)O)的丰度比,而这两种同位素是可观测宇宙中丰度第4和第3高的同位素。本工作通过测量~(12)C(~(11)B,~7Li)~(16)O反应,导出6.917MeV 2~+阈下共振的约化α宽度,并根据约化α宽度,导出~(12)C(α,γ)~(16)O在伽莫夫窗口内的天体物理S_(E2)因子。本实验在中国原子能科学研究院的HI-13串列加速器上进行。采用束流能量为50 MeV的~(11)B束流,对~(12)C(~(11)B,~7Li)~(16)O反应~(16)O 6.917 MeV激     

~(13)C同位素的分离工艺设计与实验研究

本文综述了在~(13)C同位素的分离研究中建立"数值模拟+实验研究"的工程化研究方法,完成了一氧化碳低温精馏法分离稳定性同位素~(13)C的计算机辅助设计,以及低温精馏工程实验研究。通过CO低温精馏单塔实验测定了~(13)C同位素分离体系的基础参数;利用计算机辅助设计了~(13)C分离二塔级联工艺,并得到了级联装置的优化参数;通过低温精馏分离~(13)C二塔级联实验,对优化设计结果进行检验。研究结果表明,课题建立的"数值模拟+实验研究"相结合的工程研究方法可靠,在~(13)C同位素分离中得到了实际应用;课题建立的研究方法提高了~(13)C同位素分离的设计水平、降低了实验成本、提高了研发效率,为~(13)C同位素分离工业化生产装置的设计提供了可靠的技术方法。     

稳定同位素~(13)C分离级联装置的模拟优化研究

本工作设计了一套利用CO低温精馏分离稳定同位素13 C的三级联装置,其填料层高度为38m,塔径分别为0.15、0.08和0.05m,塔内装填自主研发的高比表面PACK-13 C专用填料。采用均匀设计方法进行级联装置的优化设计,综合分析了不同的回流比、原料量和级间进料量对同位素13 C产品丰度和生产能耗的影响。对实验数据进行二次多项式逐步回归分析,获得了产品丰度与塔顶回流比、原料量及级间流量和能耗费用与回流比、原料量及级间流量的模型方程,并利用遗传算法对模型方程进行优化。模拟研究结果显示,优化后的三塔级联生产装置的各级间流量依次为18.056、236.50和32.400 mol/h,塔顶回流比为74.824,在此条件下可获得13 C丰度≥93%。与初始设计值相比较,优化后降低了能耗费用成本。本工作提出的模拟优化研究方法可应用到同位素13 C的产业化生产,以至推广到传统精馏过程的优化设计中。