牛栏山二锅头酿造过程中的真菌多样性分析

[目的]分析牛栏山二锅头大茬酒醅发酵过程中真菌群落结构及多样性,确定发酵过程中优势真菌,为解析牛栏山二锅头的形成过程提供理论支撑。[方法]将传统可培养分离方法和高通量测序技术相结合,对牛栏山二锅头大茬酒醅发酵过程真菌进行多样性分析。[结果]采用传统分离方法从大茬酒醅中分离获得559株真菌,共分为13个不同的类群,主要为扣囊覆膜酵母、酿酒酵母、伞枝横梗霉。根据微生物数量变化确定大茬酒醅真菌演替规律,即扣囊覆膜酵母和伞枝横梗霉是发酵初期的主要真菌,以毕赤酵母为主的生香酵母和酿酒酵母在发酵前期快速增长;在顶火期,除酿酒酵母以外的真菌已无法分离到,酿酒酵母成为顶火期和发酵后期的主体真菌。高通量测序中共获得143种真菌OTU,主要包括酵母目、毛霉目、散囊菌目和丝孢酵母目,其中扣囊覆膜酵母是发酵前期的主要真菌,酿酒酵母是中期和后期的主要真菌。[结论]大茬发酵过程中真菌多样性丰富,两种分析手段结果较为一致,确定了大茬酿造过程中主要真菌为扣囊覆膜酵母、伞枝横梗霉和酿酒酵母。     

不同形态外源硒元素对白酒酒醅菌群的影响

探究不同形态硒元素的添加对白酒酒醅微生物菌群的影响。在白酒酿造酒醅中添加外源硒进行发酵,采用高通量测序对发酵完成的酒醅样品解析其真菌和细菌微生物群落特征。结果表明,未添加外源硒、添加有机硒和添加无机硒的三组白酒酒醅样品之间的细菌菌群的α-多样性指数存在显著性差异（P＜0.05）,添加外源硒样品的操作分类单元（OTUs）数目和Shannon指数数值较高,Chao1指数较低,在细菌的β-多样性中,硒的添加增加了变形菌门（Proteobacteria）在群落中的占比,添加无机硒后放线菌门（Actinobacteria）成为酒醅中优势菌门,外源硒的添加提高了白酒酒醅细菌菌群的多样性;真菌菌群的α、β多样性不具有显著性差异（P＞0.05）。研究结果表明,外源硒的添加（5 mg/kg）对白酒酒醅细菌菌群的群落结构有一定影响。     

泸型酒发酵酒醅中乳酸菌群落的来源、演替规律及功能预测

为明确泸型酒发酵酒醅中乳酸菌的来源、群落演替规律以及潜在功能,作者利用16S rRNA基因高通量测序技术比较了大曲、酒醅和窖泥中的乳酸菌群落结构,并解析了酒醅乳酸菌在发酵过程中的动态变化,最后采用PICRUSt分析对酒醅微生物群落中乳酸菌的功能进行了预测。高通量测序结果显示,发酵过程酒醅中存在49种乳酸菌,其中16种来源于大曲,3种来源于窖泥。酒醅乳酸菌群落结构在发酵的第一周出现剧烈变动,发酵2 d后Lactobacillus acetotolerans取代Weissella confusa成为优势微生物并保持至发酵结束。PICRUSt分析表明,乳酸菌在酿酒过程中可能主要参与糖酵解途径,也具有参与丁酸、丙酸等重要香气前体物质代谢的潜力。     

酱香型白酒第四轮次堆积发酵醅堆腰线微生物菌群多样性解析

采用纯培养和Illumina MiSeq高通量测序技术对第四轮次堆积发酵正常和腰线酒醅中的微生物菌群多样性进行解析。通过纯培养计数发现,酒醅腰线处乳酸菌、细菌以及酵母和霉菌的数量均显著高于正常酒醅（P<0.05）。经α多样性分析发现,正常和腰线部位酒醅细菌及真菌菌群的丰度和多样性差异均不显著（P>0.05）。经β多样性分析发现,两处酒醅中细菌类群差异不显著（P>0.05）,而真菌类群差异显著（P<0.05）。经Wilcoxon test检验发现,酒醅腰线处芽孢杆菌（Bacillus）和丝衣霉属（Byssochlamys）的相对含量显著偏高（P<0.05）,而毕赤酵母属（Pichia）、酵母属（Saccharomyces）、有孢圆酵母属（Torulaspora）和接合酵母属（Zygosaccharomyces）显著偏低（P<0.05）。相关性分析发现,腰线部位酒醅微生物菌群间相较于正常部位存在更加密切的联系。由此可见,腰线与正常部位酒醅的微生物类群差异主要体现在真菌类群上。     

酱香型白酒第四轮次酒酿造过程中细菌多样性分析

该研究应用Illumina MiSeq高通量测序技术解析酱香型白酒第四轮次酒酿造过程中细菌多样性,并阐明其优势真菌微生物群落结构及其随酿造工艺动态变化。结果表明,在酒曲中主要优势菌有芽孢杆菌科（Bacillaceae）、海洋芽胞杆菌属（Oceanobacillus）;堆积发酵中主要优势菌有芽孢杆菌科（Bacillaceae）、变形菌纲（Proteobacteria）;在窖内发酵中乳杆菌属（Lactobacillus）占绝对优势;窖泥中主要优势菌有放线菌（Actinomyces）和乳杆菌属（Lactobacillus）和醋杆菌属（Acetobacter）。同一酒厂和不同酒厂新老车间酒曲、堆积、窖内发酵、窖泥之间细菌组成相似度较高,但其优势菌群丰度差异显著。发酵车间使用年限及窖龄影响着酿酒微生物多样性;使用时间长的车间和窖池其环境微生物种群结构更稳定,优势菌群更突出。     

地衣芽孢杆菌在牛栏山二锅头基酒生产中的应用

牛栏山酒厂从生产用大曲中分离、纯化得到地衣芽孢杆菌,用液体菌种做种子制成麸曲添加到酒醅中发酵生产二锅头基酒.与普通基酒相比,地衣芽孢杆菌基酒乙酸乙酯含量提高,乳酸乙酯含量降低.酒体协调、自然.地表芽孢杆菌的应用为提高牛栏山二锅头基酒质量提供了良好的途径.     

酱香型白酒第二轮次酒发酵过程微生物多样性研究

为探究酱香型白酒二轮次发酵过程中微生物群落结构的变化、微生物多样性以及物种与样品之间的关系,应用高通量测序技术对酱香型白酒第二轮次酒生产堆积及窖池发酵过程酒醅中微生物的多样性及其主要功能菌群进行研究。结果表明,在堆积过程中共检测到细菌138个属,真菌54个属;窖池发酵过程中共检测到细菌262个属,真菌267个属。酒醅中主要细菌类群为Firmicutes和Proteobacteria,主要真菌类群为Ascomycota和Basidiomycota。堆积过程中绝对优势细菌属有Bacillus、Enterococcus、Lactococcus、Lactobacillus;绝对优势真菌属有Thermoascus、Thermomyces、Candida、Aspergillus。在窖池发酵酒醅中其绝对优势细菌属为Lactobacillus;绝对优势真菌属为Saccharomyces、Candida、Penicillium、Fusarium。由于堆积、窖池发酵酒醅所处发酵环境、发酵物料物态及其工艺参数差异较大原因,使得两者之间生物物种存在较大差异。     

汾酒发酵过程中的微生物菌群变化

研究采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR）,对发酵过程中的大茬、二茬发酵0、7、15、28 d酒醅样品进行总细菌、总真菌、耐酸乳杆菌、芽孢杆菌和酵母菌的定量分析。分析结果表明汾酒发酵过程中耐酸乳杆菌和酵母为酒醅中的主体微生物,占总细菌和总真菌总和的80%以上。大茬、二茬发酵中,功能微生物在发酵前期（0～7 d）演替规律相似,二茬发酵中后期菌群呈现显著衰亡趋势,且大茬发酵期间各菌群生物量均高于二茬发酵。大茬发酵期间总细菌、耐酸乳杆菌和芽孢杆菌的生物量整体呈上升趋势,分别于28、15、7 d 达到最大值（5.53×1016、1.40×1013、1.21×106copies/g 酒醅 DNA）。在大茬和二茬发酵中总真菌和酵母的生物量在发酵0～7 d差异不大,呈快速增长趋势,大茬发酵在15 d后至发酵结束逐渐上升至最高值（1.07×1015、1.56×1014copies/g酒醅DNA）。二茬发酵中总真菌和酵母生物量在第7天达到最大值（3.03×1014、1.43×1014copies/g酒醅DNA）。     

太白酒发酵过程中酒醅微生物区系分析

以太白酒厂秋季正常生产窖池为试验窖。对窖池酒醅的微生物区系进行分析。研究凤香型白酒发酵过程中酒醅微生物区系的多样性、构成及演替呈动态消长的变化趋势。结果表明。发酵4d时上中层酒醅中的酵母菌、霉菌、放线菌增殖迅速;发酵7d后,好氧细菌和芽孢菌急剧增殖,酵母菌、霉菌、放线菌急剧减少;发酵18d以后,酵母菌、好氧细菌和霉菌均急剧减少,芽孢菌的数量相对增加。     

清香型白酒酒醅发酵菌株分离鉴定及细菌群落结构分析

采用纯培养技术对清香型白酒酒醅中的乳酸菌和芽孢杆菌进行分离鉴定,同时通过Illumina MiSeq高通量测序技术解析清香型白酒酒醅细菌群落结构。结果表明,所有酒醅样品共分离得到13株乳酸菌,分别鉴定为乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）4株、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）3株、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）3株、粪肠球菌（Enterococcus faecium）2株以及希尔氏乳杆菌（Lactobacillus hilgardii）1株。从酒醅中分离得到的17株芽孢杆菌菌株分别鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）9株、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）2株、短小芽胞杆菌（Bacillus pumilus）2株、澳洲芽孢杆菌（Bacillus australimaris）2株、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）1株以及蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）1株。Illumina MiSeq高通量测序技术结果显示,酒醅中优势菌门分别为厚壁菌门（Firmicutes）（97.96%）、放线菌门（Actinobacteria）（1.24%）和变形菌门（Proteobacteria）（0.76%）;优势细菌属为乳酸杆菌属（Lactobacillus）（97.42%）、栖热嗜油菌属（Thermoleophilum）（1.22%）和假单胞菌属（Pseudomonas）（0.72%）。     

酱香型郎酒高温大曲、酒醅和窖泥中细菌群落结构分析

该研究利用高通量测序技术对酱香型郎酒大曲、酒醅和窖泥的细菌菌群进行多样性解析和比较分析。结果表明,郎酒窖泥中细菌菌群的丰富度和多样性最高,大曲中细菌菌群的多样性远高于酒醅。窖泥中主要优势细菌属为乳杆菌属（Lactobacillus）（26.1%）、埃希氏菌-志贺氏菌属（Escherichia-Shigella）（12%）、梭菌属（Clostridium）（7.9%）等,嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acetotolerans）作为主体菌,同时存在多种未培养菌种;大曲中的主要优势菌群包括泛菌属（Pantoea）（21.9%）、高温放线菌属（Thermoactinomyces）（21.4%）、克罗彭施泰特氏菌属（Kroppenstedtia）（19.4%）和乳球菌属（Lactococcus）（9.4%）等;酒醅中主要优势细菌属为片球菌属（Pediococcus）（42.7%）、魏斯氏菌属（Weissella）（32.1%）、芽孢杆菌属（Bacillus）（14.2%）和乳杆菌属（Lactobacillus）（8.3%）,乳酸菌占据优势地位。     

宜宾产区浓香型白酒酿造生境中细菌的群落结构

该文利用高通量测序技术全面解析宜宾产区浓香型白酒酿造生境中的微生物菌群结构,并对窖泥、大曲、酒醅和黄水中的细菌种类和丰度进行对比分析。结果表明,从宜宾产区白酒酿造生境的26个样品中共注释到来自于201个属的1 493个OTUs,主要分布于拟杆菌门(Bacteroidete)、变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes),其中5个属来自于古菌域的广古菌门(Euryarchaeota)。窖泥样品中微生物菌种的多样性最高,主要以古菌、瘤胃球菌和乳酸菌为主;大曲的多样性次之,主要包括未鉴定到属水平的细菌,芽胞杆菌、乳酸菌和高温放线菌等;酒醅和黄水中的微生物多样性最低,其主要微生物类群以乳酸菌和瘤胃球菌为主。宜宾产区浓香型白酒酿造过程微生物群落结构呈现出从多种微生物共同作用到功能微生物主要发挥作用的趋势。该研究为探究浓香型白酒酿造过程中功能微生物,解析白酒酿造机理,提升白酒品质奠定了基础。     

乳酸利用菌的筛选、应用及鉴定

以大曲和酒醅为筛选源,采用Lu-Ye选择性培养基进行筛选。通过平板初筛、静置发酵、模拟白酒工艺发酵,筛选出2株降乳酸能力较强的菌株,其在液体静置发酵和模拟发酵情况下,降乳率分别为87.58%,25.97%和98.51%,38.54%。同时采用16S rRNA序列测定和生理生化测定,初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。     

宜宾产区浓香型白酒窖房空气、窖泥和糟醅可培养细菌的相关性

采用经典微生物学方法及16S rRNA序列分析,对宜宾多粮浓香型白酒酿造车间空气、窖泥及发酵糟醅中细菌群落及部分酿造性能进行比较分析。结果表明：Bacillus cereus、B. methylotrophicus及B. tequilensis细菌在酿造车间内分布最广;3个取样点中,糟醅和窖泥中细菌群落的相似性指数最高,达85%;耐乙醇或分解淀粉的细菌主要分布于糟醅;耐乙酸细菌主要分布于窖泥;空气中分离到的细菌既不耐乙醇,也不耐乙酸。表明长期开展多粮浓香型白酒生产的酿造车间内已形成具备一定多样性、与酿造环境相适应、相对稳定的细菌群落;窖房空气、糟醅、窖泥中细菌群落相互间均存在相关性,且糟醅与窖泥细菌群落密切相关。     

宏基因组学分析酱香型白酒窖内发酵优势菌与代谢功能的相关性

本文采用宏基因组学技术对酱香型白酒第四轮次窖内酒醅的优势菌区系变化、代谢功能差异及其相关性进行分析研究。结果表明,窖内酒醅处于酸性环境,发酵30 d风味与发酵0 d相比醇、酸类含量增加,酯类种类丰富;菌群多样性呈降低趋势,共发现细菌属409个,真菌属40个;发酵30 d时优势细菌为乳球菌属(33.83%)、肠球菌属(32.4%)、芽孢杆菌属(14.07%)和分枝杆菌属(8.62%)等,优势真菌为裂殖酵母属(22.26%)、曲霉属(19.58%)、丝衣霉属(14.64%)和毕赤酵母属(13.78%)等。KEGG分析表明碳水化合物代谢和氨基酸代谢为窖内发酵的主要代谢功能,其中曲霉属、莫氏黑粉菌属和毕赤酵母属与两种主要代谢功能具有强的正相关性,而乳球菌属、芽孢杆菌属和分枝杆菌属与其呈现较强负相关。研究结果为解析优势发酵菌及其代谢功能对酱香风味形成提供重要参考。     

酱香型白酒第四轮次酒酿造过程中真菌多样性分析

该研究应用Illumina MiSeq高通量测序技术解析酱香型白酒第四轮次酒酿造过程中真菌多样性,并阐明其优势真菌群落结构及其随酿造工艺动态变化。结果表明,在酒曲中主要优势菌有曲霉属（Aspergillus）、嗜热子囊菌属（Thermoascus）;堆积发酵酒醅中主要优势菌有拟青霉属（Paecilomyces）、念珠菌属（Candida）;窖内发酵酒醅中主要优势菌有嗜热子囊菌属（Thermoascus）、嗜热真菌属（Thermomyces）;窖泥中主要优势菌有假霉样真菌属（Pseudallescheria）、镰刀菌属（Fusarium）。同一酒厂和不同酒厂新老车间酒曲、堆积发酵、窖内发酵、窖泥之间真菌组成相似度较高,但其优势菌群丰度差异显著。发酵车间使用年限及窖龄影响着酿酒微生物多样性;使用时间长的车间和窖池其环境微生物种群结构更稳定,优势菌群更突出。     

清酱香型白酒冬季发酵细菌群落演替及堆积过程细菌来源解析

利用高通量测序对清酱香型白酒窖池发酵过程中细菌群落结构进行分析,从清酱香型白酒发酵酒醅中共检出14 个菌门,113 个菌属,发酵开始（0 d）时,Firmicutes、Proteobacteria及Cyanobacteria在酒醅占主导地位,平均相对丰度均大于10%。随着发酵的进行,逐渐演替为单一的Firmicutes为主导。发酵过程相对丰度前10的细菌属为Lactobacillus、Bacillus、Weissella、Acetobacter、Gluconobacter、Pediococcus、Kroppenstedtia、Staphylococcus、Enterobacter、Scopulibacillus,随着发酵的进行,逐渐演替为单一的Lactobacillus为主导。为了说明薄层堆积发酵过程酒醅中细菌来源,对发酵用曲中细菌群落结构进行解析,并设置不添加酒曲的堆积样品为空白,通过分析酒醅样品（发酵0 d）、酒曲、环境样品（不添加大曲堆积酒醅）的细菌群落结构,结果表明酒醅中的细菌属31.67%来自于环境,50%来自于酒曲,23.33%由酒曲及环境共同提供,5%的细菌属只由环境提供。此外,优势细菌属中Gluconobacter仅来自于环境。本研究系统解析了清酱香型白酒窖池发酵过程细菌群落结构,初步分析了堆积发酵过程酒醅中细菌来源,有助于完善白酒发酵微生态的研究,并对提升白酒产品质量、安全及生产可控性具有重要的意义。