谷氨酸棒杆菌苏氨酸脱氨酶基因敲除及对L-亮氨酸发酵的影响

L-异亮氨酸是L-亮氨酸发酵的主要副产物,L-异亮氨酸的积累对L-亮氨酸的发酵及提取均产生不利影响。采用基因重组技术敲除L-亮氨酸产生菌-谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)TGL8207的苏氨酸脱氨酶基因ilvA,构建了ilvA缺失株谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)TGL8207 ilvA。发酵结果显示:ilvA基因缺失对TGL8207 ilvA的生长影响很小。与供试菌比较,TGL8207 ilvA的L-亮氨酸产量和糖酸转化率分别提高了8.4%和1.9%。     

敲除pknG提高谷氨酸棒杆菌L-谷氨酸和GABA产量

γ-氨基丁酸(GABA)具有多种生理功能,被广泛应用于食品、医药等行业。在谷氨酸棒杆菌ATCC13032中表达来自短乳杆菌的两个谷氨酸脱羧酶(GAD)编码基因gadB1、gadB2,可将其自身积累的L-谷氨酸有效转变成GABA。为了进一步提高GABA产量,首先在ATCC13032中敲除了丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PknG的编码基因pknG,以提高GABA的前体物质L-谷氨酸的供应,然后将GAD表达质粒pJYW-4-gad B1-gad B2转入pknG敲除菌株和ATCC13032中,构建出重组菌SNW203和SNW200,最后对两个重组菌进行上罐发酵。结果表明:相对于SNW200,菌株SNW203的L-谷氨酸和GABA产量都有所提高。发酵72 h后,GABA产量为(30.2±0.3)g/L,相对于SNW200提高了55.4%,L-谷氨酸和GABA的总摩尔浓度为0.3 mol/L,提高了36.4%。这说明敲除pknG能够促进重组谷氨酸棒杆菌的L-谷氨酸和GABA生物合成。     

琥珀酸对谷氨酸棒杆菌谷氨酸合成的影响

研究了在发酵培养基中添加琥珀酸对谷氨酸棒杆菌谷氨酸合成的影响。琥珀酸的添加使菌体生长受到一定程度的抑制，残糖有所升高，但是增加了谷氨酸的合成量。当琥珀酸添加量分别为3g／L、5g／L、7g／L、lOg／L、和20g／L时，谷氨酸合成量分别增加了3．57％，20．53％，46．43％，64．29％和81．25％。未见有类似的研究报道。     

谷氨酸棒杆菌产L-色氨酸重组菌株的构建

在芳香族氨基酸合成途径中,由分支酸产生两个分支:一方面,在邻氨基苯甲酸异构酶(ANS)、邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶(PRT)和色氨酸合成酶(TS)的催化下合成色氨酸;另一方面,分支酸在分支酸变位酶(CM)的催化下生成预苯酸(PPA),由预苯酸又产生两个分支,最后生成酪氨酸或苯丙氨酸。在该途径中,3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7磷酸合成酶(DS)是关键酶。以谷氨酸棒杆菌SPT9(Phe-、Tyr-、4-FPr、6-FTr)为出发菌株,通过同源重组敲除分支酸变位酶基因csm获得菌株SPT9?csm。将编码DS、ANS和PRT、TS的基因aroⅡ、trpEGD及ts在SPT9?csm中分别过量表达和串联过量表达,获得一系列重组菌:SPT9?csm-XK99E-aroⅡ-trpEGD、SPT9?csm-XK99E-ts、SPT9?csm-XK99E-cspB-ts、SPT9?csm-mob2-ts和SPT9?csm-mob2-ts-aroⅡ-trpEGD。这五株菌摇瓶发酵72 h后,色氨酸产量相对于出发菌株SPT9分别提高了21.4%、57.1%、100%、121.4%和178.6%。通过实时荧光定量PCR检测表明,ts、aroⅡ和trpEGD基因在重组菌SPT9?csm-mob2-ts-aroⅡ-trpEGD中的表达量是它们在菌株SPT9中的9.2倍、13.0倍以及10.6倍。     

谷氨酸棒杆菌argB基因的克隆及其在大肠杆菌中表达的初步研究

根据GenBank报道的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032序列，设计并合成一对引物，利用温度梯度PCR仪，获得了argB基因全长。将其克隆到pGEM-T-Easy载体中，经测序鉴定后定向克隆至表达载体pGEX-4T-1中，构建了pGEX-argB表达质粒。     

谷氨酸棒状杆菌葡萄糖代谢阻断工程菌的构建

采用反向代谢工程的策略,以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032野生型为出发菌株,利用无抗性标记的同源重组方法,敲除了编码葡萄糖pts系统关键转运蛋白基因ptsG、ptsH-ptsI和葡萄糖转运系统关键转运蛋白基因abc、abc2和iolt1,得到了5株逐次敲除了相应基因的突变株。结果表明:当以葡萄糖为唯一碳源培养时,CGΔptsG菌株的葡萄糖的消耗是野生型的50%,菌体OD值为1.473;CGΔptsH-ptsI菌株的葡萄糖的消耗是野生型的39.5%,菌体OD值为1.226;CGΔabc菌株的葡萄糖的消耗是野生型的36%,菌体OD值为1.092;CGΔabc2菌株的葡萄糖的消耗是野生型的26.2%,菌体OD值为0.486;CGΔiolt1葡萄糖的消耗和菌体生长OD值为0,实现了谷氨酸棒状杆菌葡萄糖代谢的阻断,说明ptsG、ptsH-ptsI、abc、abc2和iolt1所编码的转运蛋白具有葡萄糖转运功能。     

谷氨酸棒杆菌合成脂肪酸的研究进展

脂肪酸对于工业以及生物体都具有极其重要的作用。谷氨酸棒杆菌被广泛用于氨基酸、核苷酸以及脂肪酸等高附加值化学品的工业生产。文章结合近年来谷氨酸棒杆菌生产脂肪酸取得的最新成果,综述了脂肪酸微生物合成的代谢途径以及代谢工程进展,并展望了将来的研究方向。     

利用代谢工程改造谷氨酸棒杆菌产丙酮酸研究

丙酮酸是一种重要的有机酸,可以作为前体物质,参与合成多种有机化合物,在生物体的能量代谢中发挥着重要作用。为提高丙酮酸产量,选择利用代谢工程改造谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)生产丙酮酸。利用同源重组的方法,依次敲除谷氨酸棒杆菌中与丙酮酸代谢支流相关的5个关键基因(丙酮酸醌氧化还原酶基因pqo、丙酮酸羧化酶基因pyc、转氨酶基因alaT、缬氨酸-丙酮酸氨基转移酶基因avtA、丙酮酸脱氢酶基因aceE),摇瓶发酵72h后丙酮酸的产量达到14.64g/L。通过过表达编码转酮醇酶基因tkt、转醛酶基因tal、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因pck,增加合成丙酮酸前体物质的供应。最终,复合培养基摇瓶发酵72h后,发酵液中丙酮酸的产量达到15.39g/L,与野生型菌株相比提高了28倍。研究旨在为利用微生物发酵生产丙酮酸提供一定的理论参考。     

植物乳杆菌降胆固醇Lp10菌株的rhaD基因敲除株的构建

以转录组数据为依据推测植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中rhaD基因参与胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)合成代谢中的鼠李糖代谢过程,从而通过调节胞外多糖合成并利用其吸附作用达到降胆固醇效果。为了进一步验证rhaD基因的功能,本论文研究利用同源重组技术,构建rhaD基因敲除载体,采用电击转化方法将构建的敲除载体导入植物乳杆菌Lp10菌株感受态细胞,并在抗性平板上筛选转化子,以转化子的基因组DNA为模板进行PCR及测序鉴定,再利用邻苯二甲醛法测定突变株与初始菌株的降胆固醇能力。结果表明,敲除载体pNZ5319-rhaD被成功构建,测序结果显示rhaD基因被成功敲除;敲除菌株的降胆固醇能力略有上升。本论文研究结果不仅为植物乳杆菌基因敲除载体的构建提供了实验技术支持,同时为植物乳杆菌降胆固醇相关功能基因的验证分析奠定了理论依据。     

浅谈棒杆菌的谷氨酸分泌机理

在近半个世纪前的1957年，日本的Dr．S．Udeka和Dr．S．Kinoshita发现谷氨酸棒杆菌及其泄漏谷氨酸的独到特性以来，基于这个原始发现选育出的许多该细菌的突变株已经应用到发酵法生产L-谷氨酸，并达到了500m^3的工业发酵生产规模。尽管谷氨酸发酵生产已有40多年的历史以及多年对谷氨酸菌的详细研究，但是对于棒杆菌的谷氨酸分泌机理仍然未能完全阐明清楚。     

高产L-精氨酸谷氨酸棒状杆菌的构建

以产L-精氨酸诱变菌株谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）AJC为出发菌株,采用基因组编辑技术对其进行改造。 首先,敲除阻遏蛋白ArgR和FarR,解除反馈阻遏作用;然后,敲除乳酸脱氢酶编码基因ldh和整合鸟氨酸乙酰转移酶编码基因argJ,阻 断乳酸合成途径和增加前体物;最后,敲除谷氨酸分泌蛋白编码基因NCgl1221和整合乙酰谷氨酸激酶基因argB,减弱L-谷氨酸的胞 外分泌,筛选一株L-精氨酸高产菌株。 结果表明,获得一株高产L-精氨酸菌株AJC-4（C. glutamicum AJCΔargRΔfarRΔldh::PtufargJ ΔNCgl1221::PsodargB）,该菌株在5 L发酵罐中发酵64 h后,L-精氨酸产量和糖酸转化率分别为78.0 g/L和0.38 g/g,较出发菌株AJC分 别提高21.9%、18.8%;副产物乳酸和L-谷氨酸积累量分别为0.11g/L、0.16 g/L,较出发菌株AJC分别降低96.8%、96.1%。     

L-色氨酸产生菌TQ2223的途径分析

应用途径分析方法分析了在稳态时谷氨酸棒杆菌TQ2223菌株由葡萄糖发酵生产L 色氨酸的途径,确定了L 色氨酸合成的最佳途径及其代谢流分布和最大理论产率.通过刺激所选途径的酶活来提高L 色氨酸产率,结果表明,经NH4+调节后,代谢途径流量发生显著变化,可以使色氨酸的代谢流从6提高到8.8.     

谷氨酸棒杆菌生产L赖氨酸的培养优化和产酸特性研究

在5L发酵罐中利用优化培养基进行了谷氨酸棒杆菌连续培养生产L-赖氨酸的研究。相同发酵条件下,优化培养基和原始培养基中的菌种生物量分别达到8.0g/L和9.3g/L,最快生长速率分别为0.53g/L/h和0.72g/L/h。发酵48h后,优化培养基中的L-赖氨酸浓度、产酸总量和糖酸转化率分别为20.8g/100mL、588.2g和0.713g酸/g糖,和原始培养基相比分别提高了6.1%、2.3%和12.2%。优化培养基显著降低了L-赖氨酸生产的原料消耗,提高了生产效率。      

搅拌对谷氨酸棒杆菌絮凝的影响

谷氨酸棒杆菌等电点为4.2,当等电母液pH在3.2左右时,菌体zeta电势为正值,添加絮凝剂聚丙烯酸钠能有效使分散的细胞聚集成絮凝体。以菌体、COD及蛋白质去除率为指标,借助Mastersize 2000测定絮凝体粒度分布,考察了搅拌速率和搅拌时间对絮凝的影响。结果表明,在搅拌转速为400 r/min,搅拌时间为50 s时,絮凝效果最好,菌体、蛋白质、COD去除率分别达到99%、75%、55%以上,絮凝体粒径达到491μm,C.V.值为53.52%。搅拌速率和搅拌时间在很大程度上影响絮凝效果和絮凝体大小,控制搅拌速率和搅拌时间可以优化絮凝效果和优选絮凝体大小,增强絮凝后的沉降过滤。     

谷氨酸棒状杆菌果糖代谢阻断工程菌的构建

谷氨酸棒状杆菌不仅可以利用葡萄糖和果糖作为碳源进行糖类代谢,也可以利用这些碳源作为底物生产葡萄糖酸、甘露醇及山梨醇等产品。为了提高底物利用率和目的产物的积累量,利用代谢工程阻断糖类代谢的磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统（phosphoenolpyruvate carbohydrate phosphotransferase system,PTS）和失活相应磷酸激酶。是实现此目标的有效手段。本实验利用同源重组和反向筛选等技术手段,分别获得ptsF单基因缺失工程菌CGΔptsF和ptsF、ptsH、ptsI三基因缺失工程菌CGΔptsFΔptsHΔptsI。工程菌的生长情况研究表明：在以葡萄糖为唯一碳源的培养基上,工程菌CGΔptsF和工程菌CGΔptsFΔptsHΔptsI与野生型生长情况基本一致,说明葡萄糖代谢不受3 个基因影响;在以蔗糖为唯一碳源的培养基上,工程菌CGΔptsF和工程菌CGΔptsFΔptsHΔptsI的生长速率分别是野生型的48.4%和29.7%,菌体浓度分别是野生型的61.6%和34.1%;在以果糖为唯一碳源的培养基上,工程菌CGΔptsF菌体浓度是野生型43.2%,工程菌CGΔptsFΔptsHΔptsI生长为0,证明其完全阻断了果糖代谢,同时说明果糖的PTS系统受ptsF、ptsH和ptsI基因编码的PTS相关蛋白的联合控制。果糖代谢阻断工程菌的获得,为进一步构建以果糖原型为底物的甘露醇或山梨醇生产工程菌株提供了遗传资源,也为谷氨酸棒状杆菌的糖类代谢研究提供了理论依据。     

基因组改组快速提高谷氨酸棒杆菌L-鸟氨酸产量

以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌,应用基因组改组技术快速提高L-鸟氨酸产量。经过紫外线、亚硝基胍和甲基磺酸乙酯分别诱变处理,获得6株产量有所提高的突变株,以此构建用于基因组改组的候选菌库。考察培养基成分对原生质体再生率的影响。经过两轮的灭活原生质体递推式融合,以磺胺胍和氟化钠为双抗性筛选标记,共筛选出2株遗传性能稳定的改组菌株。其中改组菌株F2-6摇瓶发酵72h,积累L-鸟氨酸产量为2.99g/L,是出发菌株的13.6倍。结果表明基因组改组技术能够在短期内使谷氨酸棒杆菌的L-鸟氨酸产量得以提高。     

基于低拷贝质粒的高产紫色杆菌素谷氨酸棒杆菌的构建和发酵

该研究以公认安全(Generally Recognized as Safe,GRAS)的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)为宿主,构建高产紫色杆菌素的重组菌株。利用谷氨酸棒杆菌天然大质粒pTET3的复制与分配元件,构建了低拷贝质粒pOK12CG1,该质粒在谷氨酸棒杆菌中的拷贝数约为6拷贝/基因组,且与谷氨酸棒杆菌常用质粒pEC-XK99E和pXMJ19兼容。以低拷贝质粒pOK12CG1为骨架构建了携带紫色杆菌素合成操纵子(vioABCDE)的质粒pCGvio,并分别以谷氨酸棒杆菌标准株ATCC 13032和插入序列(Insertion Sequence,IS)元件删除株为宿主,构建了7株合成紫色杆菌素的重组菌株。通过初步筛选,发现基于低拷贝质粒的重组菌株ATCC13032/p CGvio,其紫色杆菌素产量(508.24 mg/L)高于基于中高拷贝质粒的重组菌株ATCC 13032/pECvio(376.16 mg/L),而基于低拷贝质粒的IS元件删除重组菌株ISDM023/pCGvio紫色杆菌素产量达到了610.13mg/L。进一步采用正交实验设计对重...