二重PCR法快速检测3种食源性致病菌

目的建立快速检测食品中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌属(Salmonella spp.)及志贺氏菌属(Shigella spp.)的二重PCR方法。方法分别针对金黄色葡萄球菌.femA和nuc、沙门氏菌属invA和hilA及志贺氏菌属ipaB和ipaH设计6对特异性引物,检测每对引物的特异性及灵敏度,组合优化各自二重PCR反应体系。结果初步建立了针对这3类致病菌的二重PCR检测方法,整个检测过程不超过18 h,检测灵敏度均可达10 pg DNA/reaction。结论所建立的针对3类致病菌的二重PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强和方便高效等优点,具有良好的市场应用前景。     

多重PCR法对乳制品中3种致病菌的同时快速检测

通过调整混合培养基的配比摸索乳制品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的快速共增菌条件,并选择稳定高效的细菌基因组DNA提取方法,然后根据三种目标致病菌的保守基因分别设计多重PCR引物,对致病菌进行多重PCR检测.结果表明,方法具有良好的针对目标致病菌的特异性,检测限可达102mL1.且反应体系各组分间未见交叉干扰.对人工污染的乳品盲样检测验证了方法的实用性.     

4种食源性致病菌的多重PCR快速检测方法研究

为快速检测蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和沙门氏菌4种食源性致病菌,建立4重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的检测方法。针对菌株的特异性基因设计引物,选择退火温度相近,扩增条带区间不同的引物为多重聚合酶链式反应引物组,并对多重PCR的引物浓度、退火温度进行优化,确定扩增条件。结果表明,在54℃的退火温度下,4种菌可扩增长度为246、166、65、107 bp的清晰片段,其检测灵敏度为蜡样芽孢杆菌2×101CFU/mL,金黄色葡萄球菌可达1.3×102 CFU/mL,志贺氏菌可达1.3×102 CFU/mL,沙门氏菌可达1.4×102 CFU/mL。     

3 种食源性致病菌Tem-PCR检测方法的建立

应用靶序列富集多重聚合酶链式反应（target-enriched multiplex-polymerase chain reaction,Tem-PCR）技术建立金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌3 种食源性致病菌的快速检测方法。分别以金黄色葡萄球菌femA基因、沙门氏菌invA基因和志贺氏菌ipaH基因为靶基因,设计3 对特异性引物,并与通用引物连接组成Tem-PCR引物,通过反应条件优化,建立了Tem-PCR检测方法。结果显示,建立的Tem-PCR方法特异性强,对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌的检测灵敏度分别为1.1×103、2×103 CFU/mL和1.2×103 CFU/mL。Tem-PCR检测方法有效地解决了传统多重PCR引物扩增效率不均衡的问题。     

PCR法快速检测三种食源性致病菌的研究

目的 探讨用PCR方法快速检测食品中沙门氏菌(Salmonella spp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和志贺氏菌(Shigella spp.)的实用性。方法 采用能力验证实验和超市样品检测实验对PCR方法与传统检测方法进行比较。结果 与传统检测方法相比, PCR方法检测以上三种食源性致病菌的结果准确率达到99%以上, 假阳性率低于1%, 假阴性率为0。结论 PCR检测方法具有检测周期短等优点, 可以在当前的食品安全检测工作中应用推广。     

食品中3种致病菌的Taqman多重荧光定量PCR检测

利用实时荧光定量PCR(RTi-PCR)技术探索病原微生物的快速高通量检测方法已是食品微生物学的研究热点之一。首先,通过调整混合培养基的配比摸索食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的快速共增菌条件,并选择稳定高效的细菌基因组DNA提取方法,然后根据3种目标致病菌的保守基因分别设计RTi-PCR引物和双标记Taqman探针,分别使用FAM、TAMRA及CY5作为报告基团,对致病菌进行多重RTi-PCR检测,并设计、构建了阳性内参用于检测反应体系。结果表明,方法针对42种已知目标菌株和21种已知菌株组合特异性良好,检测限可达101 cfu/PCR反应,且反应体系各组分间未见交叉干扰。阳性内参Ct值保持稳定,有效地保证了检测的可靠性。对人工污染的食品盲样检测验证了方法的实用性。总之,建立了一种食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌同时快速检测的多重RTi-PCR方法,为食源性致病菌的检测提供了新的方法学依据。     

三种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立

目的:建立同时快速检测沙门氏菌、志贺氏菌和肠出血性大肠杆菌O157∶H7的多重PCR方法。方法:根据沙门氏菌的invA基因、志贺氏菌的ipaH基因及肠出血性大肠杆菌O157∶H7的uidA基因设计3对引物,通过单因素实验、L9(34)正交实验优化反应体系,并对多重PCR扩增的敏感性进行分析。结果:3对引物能特异性扩增出495、620、252bp的目的片段;在最优多重PCR反应体系下,多重PCR检测3种致病菌的灵敏度达104CFU/mL;将该法应用于人工污染实验,可在5h内得到准确、稳定的检测结果。结论:该方法操作简单、检测特异性和灵敏度较高,能够实现对沙门氏菌、志贺氏菌和肠出血性大肠杆菌O157∶H7 3种食源性致病菌的快速监控和诊断。      

多重PCR检测婴幼儿配方奶粉中3种食源性致病菌

为建立一种能够同时检测婴幼儿配方奶粉(Powdered Infant Formula,PIF)中克罗诺杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌3种食源性致病菌的多重PCR检测方法。通过单重PCR验证了9对引物的特异性,筛选出其中3对特异性好的引物建立了多重PCR体系,对其特异性和灵敏度进行评价,并将其应用于人工污染PIF中3种食源性致病菌的检测。结果表明,针对克罗诺杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等3种食源性致病菌所筛选的3对引物分别能扩增出469、638和796 bp的目的条带,具有高度特异性。多重PCR检测体系的最佳退火温度为55℃,最佳Mg²⁺浓度为2.00 mmol/L,最佳引物浓度为400 nmol/L。在此条件下3种目的菌在10² CFU/mL均可同时扩增出较清晰条带。将建立的多重PCR检测体系应用于人工污染PIF中3种食源性致病菌的检测,其检出限达到10³ CFU/g。本研究初步建立了一种能准确、快速、特异性的检测PIF中克罗诺杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR方法,适用于PIF中3种常见的食源性致病菌的快速检测。     

靶序列富集多重PCR结合DHPLC同时检测5种食源性致病菌

目的建立同时检测沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌5种食源性致病菌的简便、灵敏的高通量方法。方法根据GenBank公布的5种致病菌的特异性靶基因序列,设计5对特异性引物,与通用引物连接构成复合引物。经过反应条件的优化,建立了5种致病菌的靶序列富集多重PCR(target enriched multiplex PCR,Tem-PCR)扩增方法,扩增产物采用变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术进行检测。结果采用Tem-PCR-DHPLC方法,检测48株试验菌株,未发现非特异性结果。对5种致病菌检测灵敏度,除金黄色葡萄球菌为620 cfu/mL外,其余都小于100 cfu/mL。对4种样品的检测结果与国家标准方法相符合。结论 Tem-PCR-DHPLC检测方法,相比传统多重PCR方法,能有效地解决引物扩增效率不均衡的问题,不需优化引物浓度,方法特异性强,灵敏度高,具有较好的实用性。     

食品中3种致病菌多重PCR检测体系的建立及初步应用

目的:建立同步速测食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法。方法:利用基因组比对法寻找3种致病菌的特异性序列——沙门氏菌的invA基因、金黄色葡萄球菌的nuc基因和单增李斯特菌的prs基因,运用Primer Premier 5.0分别设计3对片段大小不同的特异性引物;通过优化反应体系,建立3种致病菌的多重PCR检测体系。结果:建立的多重PCR方法灵敏度测试结果分别为7.6、3.8、5.1pg/μL,在此灵敏度下可以扩增出全部特异性引物条带,验证性实验结果出现相应的目的条带且未发生交叉影响。结论:初步建立能同步、简便、快速、灵敏地检测食品中沙门菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌的三重PCR方法。     

多重PCR快速检测三种食品病原菌

建立一种快速、经济、实用的可以同步检测食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的方法。根据金黄色葡萄球菌的nuc基因,沙门氏菌的invA基因,小肠结肠炎耶尔森氏菌的ail基因,分别设计了三对引物,对单个基因PCR和单管多重PCR扩增进行特异性、灵敏性实验以及优化反应体系。三对引物能特异性扩增出236、475、127bp的目的条带。建立的多重PCR同时对3种食源性致病菌进行检测具有较高的灵敏度,灵敏度金黄色葡萄球菌为102CFU/mL、沙门氏菌为102CFU/mL、小肠结肠炎耶尔森氏菌为102CFU/mL。初步建立能同步、简便、快速、灵敏地检测食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌的三重PCR方法。     

散装即食食品中3种食源性致病菌多重荧光定量PCR检测方法的建立

该研究旨在建立散装即食食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌3种食源性致病菌的多重荧光定量PCR检测方法,根据沙门氏菌侵染上皮细胞表面蛋白的invA基因、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶(nuc)基因、蜡样芽孢杆菌的cer A基因分别设计3对特异性引物与探针,并对体系中引物探针的浓度以及退火温度等反应条件进行优化筛选,建立多重荧光定量PCR检测方法,同时评估其特异性、灵敏性及重复性,并应用该方法检测散装即食食品样本中致病菌,同时与国标法比对。结果表明,建立的多重荧光定量PCR检测方法能特异性地扩增沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌3种目标菌,其他菌株均不扩增,灵敏度分别为4×10²、3×10²、2×10² cfu/mL,且批内和批间变异系数均小于2%,重复性和稳定性良好。同时用国标法和多重荧光定量PCR法对100份散装即食食品样本进行检测比对,多重荧光定量PCR法的阳性检出率略高于传统国标法,且检测时间大幅缩短。综上所述,建立的多重荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、快速准确,在食源性致病菌快速筛查方面具有良好...     

水产品三种致病菌多重PCR检测方法的建立

根据副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的耐热直接溶血素基因(tdh)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的耐热核酸酶基因(nuc)和单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)的侵入关联蛋白基因(iap)分别设计引物,进行PCR扩增及反应条件的优化,建立了对3种菌的多重PCR检测方法.结果表明:3对引物能特异性地扩增出202 bp、484 bp和714 bp的目的片段.优化后的多重PCR反应体系为:10×PCR buffer(Mg2+)2.5 μL、200 μmol/L dNTP、2 mmol/L Mg2+、模板2 μL、2.5 U Taq酶,引物浓度分别为:副溶血弧菌200 nmol/L、金黄色葡萄球菌40 nmol/L、单增李斯特菌320 nmol/L,总反应液25 μL.对贝类模拟样品的检测结果显示,应用多重PCR技术对3种菌的检测限分别为副溶血弧菌2.3×102 CFU/mL、金黄色葡萄球菌2.5×101 CFU/mL、单增李斯特菌1.5×103 CFU/mL.作者通过多重PCR技术实现了对副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的同时检测,具有快速、灵敏度高、特异性强等优点.     

食源性致病菌多重PCR快速检测研究进展

食品安全问题现在备受关注,食品中致病菌的污染造成的食物中毒事件时常发生,传统的食源性致病菌检测方法操作繁琐,耗时长,未能及时检验出食品中的致病菌,这些缺点限制了此方法的广泛应用。聚合酶链式反应(PCR)满足了快速检测致病菌的要求。主要介绍多重PCR快速检测食源性致病菌的原理、特点、检测体系的组成及其应用。多重PCR具有特异性强、灵敏度高、操作简便、可同时检测多种致病菌的优点,同时多重PCR技术可结合荧光定量PCR、基因芯片技术等建立一个更加完善的体系。     

乳品中3种常见细菌多重PCR检测方法的建立

分别以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌标准株为样本,提取其DNA,以大肠杆菌的pho A基因、金黄色葡萄球菌的nuc A基因和沙门氏菌的inv A基因作为靶基因,建立可以同时检测这3种菌株的多重PCR方法。与国标法对照,探讨多重PCR技术检测乳品样品中3种细菌的灵敏性和特异性。结果表明,建立的多重PCR检测方法与国标法检测的结果一致,人工模拟试验结果稳定,多重PCR具有快速、敏感和特异性强的特点。     

食源性致病菌多重PCR快速检测研究进展

食品安全问题现在备受关注,食品中致病菌的污染造成的食物中毒事件时常发生,传统的食源性致病菌检测方法操作繁琐,耗时长,未能及时检验出食品中的致病菌,这些缺点限制了此方法的广泛应用。聚合酶链式反应（PCR）满足了快速检测致病菌的要求。本文主要介绍了多重PCR快速检测食源性致病菌的原理、特点、检测体系的组成及其应用。多重PCR具有特异性强、灵敏度高、操作简便、可同时检测多种致病菌的优点,同时多重PCR技术可结合荧光定量PCR、基因芯片技术等建立一个更加完善的体系。     

5种食源性致病菌PCR检测方法的建立

目的建立食品中的沙门氏菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特氏菌的PCR快速检测方法。方法以缓冲蛋白胨水为增菌培养基,采用直接提取法提取DNA并测定其核酸浓度。对PCR的退火温度、模板浓度进行优化,把5种目标菌分为两组进行检测分析,并进行特异性和灵敏度实验。结果 5种目标菌培养后均表现出良好的生长趋势。PCR扩增最佳退火温度为59℃, 5种目标菌的引物特异性好,方法的检测灵敏度高。沙门氏菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特氏菌最低检出核酸浓度分别为0.0202、0.158、0.187、2.30和1.05μg/mL。结论该方法简便、快速、灵敏度高,能满足食品安全检测要求。     

多重PCR检测4种常见食源性致病菌

目的 建立一种多重聚合酶链式反应法(multiplex polymerase chain reaction, MPCR)快速检测肉制品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌和单增李斯特氏菌的分析方法。方法 选取金黄色葡萄球菌nuc基因、沙门氏菌SipB基因、志贺氏菌ipaH基因、单增李斯特菌inlA基因作为目标基因, 设计4对PCR引物, 建立并优化多重PCR反应体系, 评价该体系的特异性和灵敏度, 并对人工污染的熟肉样品进行检测。结果 构建的多重PCR方法特异性强、灵敏度高, 人工污染熟肉匀浆中4种致病菌的检出限为103 CFU/mL。结论 构建的多重PCR检测方法能够快速、准确、高效地检测肉制品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌和单增李斯特氏菌, 为食源性疾病菌的快速检测提供参考依据。     

双正交优化多重PCR检测食源性致病菌的研究

为了建立快速检测食源性致病菌的多重PCR检测方法,根据沙门氏菌fimY基因、单增李斯特氏菌hlyA基因和小肠结肠炎耶尔森氏菌ail基因设计3对特异性引物,利用双正交法分别对多重PCR反应体系中的3对引物比进行L9(33)正交优化和Taq酶、dNTPs、镁离子、混合引物的添加量进行L16(44)正交优化,并对Buffer的反应浓度进行优化。结果扩增出了3条特异性目的条带,建立的多重PCR方法具有很好的特异性。人工污染食品,9h富集培养增菌后的检出限可达100cfu/g。因此,该检测方法具有较强的实际应用价值,为检测多种食源性致病菌提供了有效的方法参考。     

多重PCR检测食源性致病菌的研究

建立多重PCR方法来同时检测和鉴定食品中单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌和肠出血性大肠杆菌三种致病菌。试验以单增李斯特菌蛋白转录调控基因(hlyA)、金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因(nuc)和肠出血性大肠杆菌O157︰H7的O157抗原特异基因(rfbE)为靶基因设计引物,并对其反应体系进行优化,确定其灵敏度及检出限。多重PCR反应的灵敏度为102cfu/mL,检出限为103cfu/mL。该研究建立的多重PCR检测方法简单、快速、灵敏度高具有很好的应用前景。