阿霉素耐药的乳腺癌MCF-7／Adm细胞系的建立及其耐药特性

建立肿瘤耐药细胞系是研究肿瘤细胞的重要手段之一,也是探讨肿瘤多药耐药机制及其逆转的基础。采用大剂量间歇诱导法诱导 MCF-7细胞,建立 MCF-7/Adm耐药模型;MTT 法检测耐药倍数;流式细胞术检测MCF-7细胞和MCF-7/Adm细胞中阿霉素的积累量;real-time PCR检测MCF-7/Adm细胞中 A BCG2、A BCC1、A B-CB1基因的表达。结果显示,阿霉素抑制 MCF-7和 MCF-7/Adm 细胞存活的 IC50值分别为0．535μg/mL 和173.275μg/mL ,耐药倍数为324;MCF-7细胞中的阿霉素积累量较MCF-7/Adm明显高;MCF-7/Adm细胞中mR-NA水平 A BCB1基因表达明显上调,A BCG2和 A BCC1基因表达下调。成功获得对阿霉素耐药的人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/Adm ,为进一步研究乳腺癌多药耐药机制及其逆转提供有利工具,并且对乳腺癌化疗药物的筛选具有一定的意义。     

刺囊酸及其衍生物的体外化疗增敏作用及机制研究

目的探讨刺囊酸及其衍生物的体外化疗增敏作用及其机制。方法体外培养人乳腺癌细胞MCF-7和人肝癌细胞HepG-2的敏感株和阿霉素耐药株,依次在阿霉素和受试化合物的作用下,以MTT法测定其IC₅₀,计算耐药倍数; 随后,对耐药株加入不同浓度组合的阿霉素和受试化合物进行共培养,以MTT法测定各组细胞活力,计算刺囊酸及其衍生物的MDR逆转倍数。结果刺囊酸及其衍生物在低浓度下无明显细胞毒活性,但却能增强耐药细胞对化疗药阿霉素的敏感性,逆转倍数最高可达15倍以上,并且几种刺囊酸衍生物的作用具有剂量依赖性; ELISA试验结果显示,刺囊酸及其衍生物抑制耐药株的P-gp表达,减少化疗药物从细胞中泵出,起到增敏作用。结论刺囊酸及其衍生物具有化疗增敏作用,其机制来源于对P-gp的抑制。     

ER阳性乳腺癌中西达本胺逆转内分泌耐药

内分泌治疗是雌激素受体阳性乳腺癌的主要治疗手段,但耐药的发生限制了其应用,本研究目的为验证组蛋白去乙酰化酶抑制剂西达本胺是否可用于逆转雌激素受体阳性乳腺癌内分泌耐药,通过MTS细胞增殖检测实验发现,4-羟他莫西芬与西达本胺单药均对雌激素受体阳性乳腺癌细胞MCF-7的增殖具有一定抑制作用,且在两药联合时表现为药效叠加.表皮生长因子可诱导MCF-7对4-羟他莫西芬的耐药,而西达本胺可逆转这种耐药.通过Western blot实验发现,西达本胺可抑制表皮生长因子引起的MEK、ERK和AKT等激酶的磷酸化,并抑制雌激素受体的磷酸化.原位移植瘤动物模型的体内药效实验也显示,药物联用组比单药组有更强的抑瘤作用.研究表明,西达本胺在雌激素受体阳性乳腺癌细胞中具有逆转内分泌耐药的作用,作用机制可能与其对表皮生长因子下游通路及雌激素受体活化通路的抑制有关.     

普朗尼克F127/P123-雷公藤甲素载药胶束的逆转肿瘤耐药作用

为了考察雷公藤甲素靶向制剂的逆转肿瘤耐药性,薄膜水化法制备了装载雷公藤甲素的双普郎尼克载药胶束(F127/P123-TPL),选择内在性和获得性耐药的A-549和MCF-7/ADR细胞作为耐药细胞模型,MTT试验检测制备的载药胶束,空胶束以及裸药TPL对两种耐药细胞的细胞毒作用,多功能酶标仪以及微弱发光测量仪测定不同浓度的空胶束对荧光探针R-123在A-549耐药细胞内的蓄积量,线粒体膜电势,以及ATP含量的影响。结果表明:TPL和F127/P123-TPL对两种耐药肿瘤细胞都有抑制和杀灭作用,且F127/P123-TPL载药胶束增强了TPL的作用。而作为TPL载体的F127/P123,在使用剂量范围内对耐药肿瘤细胞的存活率无影响,但能够使R-123在A-549耐药细胞内的蓄积量增加,并且使细胞的线粒体膜电势和ATP的含量降低。TPL具有逆转肿瘤耐药作用,而F127/P123-TPL能增强其作用。实验结果将为TPL的新制剂研究打下基础。     

人肺癌细胞5-氟脲嘧啶耐药株的建立及其生物学特性分析

建立人肺癌5-氟脲嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)的耐药细胞株H460/5-FU,并对其生物学特性进行分析。实验采用浓度梯度递增法诱导肺癌细胞耐药,建立肺癌细胞耐药模型。采用四甲基偶氮唑蓝法(MTT),计算H460和H460/5-FU的半数抑制浓度(IC50)及耐药系数(RI);通过流式细胞仪分析H460和H460/5-FU的细胞周期分布;光镜观察细胞形态变化;通过流式细胞仪进行SP(side population)细胞检测,比较SP细胞所占比例;做细胞生长曲线和集落形成实验观察细胞生长及倍增情况。结果表明5-FU对H460和H460/5-FU的IC50分别为28.7μg/mL和90.44μg/mL,RI为3.15;H460/5-FU细胞倍增时间缓慢,DNA复制时间延长,且含有更多的SP细胞。     

p38MAPK抑制剂增强阿霉素抑制乳腺癌细胞增殖的体外研究

以乳腺癌细胞株MCF-7为研究对象,经阿霉素及阿霉素联合p38MAPK抑制剂(SB20580)作用细胞,通过MTT法测定细胞存活率、光学显微镜观察细胞形态变化。实验数据显示相同药物浓度下,SB20580可以明显降低MCF-7细胞存活率。结果表明p38MAPK抑制剂可以促进阿霉素抑制细胞增殖的效果。     

功能化表阿霉素脂质体的主药含量测定及体外释放考察

建立了功能化表阿霉素脂质体的主药含量及体外释放率的测定方法.采用薄膜分散法和硫酸铵梯度法制备各种类型的表阿霉素脂质体,建立了一种梯度洗脱方法,利用高效液相色谱仪测定脂质体中表阿霉素与塞来昔布的质量浓度及其体外释放度.结果显示脂质体中表阿霉素质量浓度在0.5~50.0 μg/mL,塞来昔布质量浓度在0.3~30.0μg/mL范围内线性关系良好.各种脂质体中表阿霉素的质量浓度分别为(101.2±2.0)、(103.1±1.8)、(98.7±1.3)g/mL,塞来昔布的质量浓度分别为(65.5±0.5)、(63.5±1.1)μg/mL.72h内表阿霉素的释放度均低于5%,36h塞来昔布的累积释放度均低于20%.所建立的HPLC方法准确可靠,简单快速,重复性好,各脂质体中表阿霉素与塞来昔布的体外释放缓慢,稳定性良好.     

6种化合物对肝癌细胞活性影响的比较

肝癌在全球,特别是在中国,有着很高的发病率。在中国,每10万人中约有将近40人罹患肝癌。在临床治疗肝癌等癌症的方法上,最常用最普遍的手段是手术治疗和化学治疗等方法。不同的化合物对不同的癌症细胞的细胞活力影响有很大的不同。为了比较不同的化合物对体外培养的肝癌细胞的细胞活力的影响,做了如下实验。利用MTT检测细胞活力的方法,分别检测了不同浓度的阿霉素,顺铂,依托泊苷,5-FU,甲硫哒嗪和白藜芦醇等6种常用化合物对肝癌细胞的细胞活力影响。实验结果表明,阿霉素,依托泊苷,甲硫哒嗪和白藜芦醇的IC50值分别为0.25μg/mL,20μg/mL,500μM,20μM。在一定的浓度范围内,随着阿霉素浓度的升高,肝癌细胞的细胞活力显著下降,正常肝细胞的活力也有一定的下降;随着依托泊苷的浓度的增加,肝癌细胞和正常肝细胞的细胞活力都显著下降;随着甲硫哒嗪的浓度的增加,肝癌细胞活力显著下降,正常肝细胞的活力几乎没有影响。     

阿科特素体外处理乳腺癌细胞的基因表达通路分析

近年来有研究表明黑升麻提取物阿科特素具有抗肿瘤活性。但其分子机制仍然不够清楚。研究用基因集富集分析的方法分析了20μg,／mL和40μg／mL两种不同质量浓度的阿科特素处理乳腺癌细胞MDA—MB--4536h或24h后的基因表达谱,获取处理后的乳腺癌细胞中的基因集富集情况．结果表明：处理6h的乳腺癌细胞中没有获得有统计学意义的基因集,而在处理24h的乳腺癌细胞中与细胞分裂、细胞周期等相关的生物学通路则表达下调,40Ixg／mL阿科特素处理还可以使得乳腺癌细胞中大分子降解相关通路表达上调．由于阿科特素可以促进细胞凋亡并抑制细胞周期,为其今后用于乳腺癌的预防和治疗的可能性提供了良好的理论依据．     

水飞蓟宾对MCF-7和SK-OV-3诱导凋亡作用的不同敏感性

由于肿瘤的异质性,抗肿瘤药物作用不同的肿瘤模型时表现出不同的敏感性和不同的作用机制.将水飞蓟宾分别作用乳腺癌细胞MCF-7和卵巢癌细胞SK-OV-3,研究其对细胞增殖、细胞凋亡的影响及可能的作用机制.与卵巢癌细胞SK-OV-3相比,水飞蓟宾对乳腺癌细胞MCF-7具有明显的细胞增殖抑制及诱导凋亡能力,并都通过激活caspase 3的方式启动凋亡程序.此研究结果将为肿瘤的个体化治疗和临床实验提供可靠的保证.     

维生素C对内皮细胞和平滑肌细胞增殖的影响

药物洗脱支架(Drug-eluting stent,DES)释放抗增殖的药物来抑制平滑肌细胞(Smooth muscle cells,SMCs)增殖,阻止内膜增生。但这些药物不可避免地会延迟内皮化,因此有必要寻找合适的药物选择性的抑制SMC增殖,同时促进内皮细胞(Endothelial cells,ECs)增殖。维生素C(L-ascorbic acid,L-AA)是一种用于口服或是直接加入细胞培养的药物,因此实验中在培养过夜的EC和SMC细胞中加入浓度为300μg/mL的L-AA、浓度为100μg/mL的雷帕霉素(Sirolimus,SIR)、高糖培养基(Dulbeccos modified eagle medium,DMEM)、杜氏磷酸缓冲液(Dulbeccos phosphate buffered saline,DPBS)和乙醇各100μL,培养7d观察,结果表明:SIR能够抑制EC增殖,而L-AA能够显著促进EC的增殖,同时也能够抑制SMC的生长;在培养过夜的EC和SMC细胞中加入100μL不同浓度的L-AA(1、100、300、500μg/mL和1000μg/mL),培养7d后,1、100μg/mL和300μg/mL的L-AA有利于EC增殖,而500μg/mL和1000μg/mL的L-AA会抑制EC增殖,并且300μg/mL和500μg/mL的L-AA可以显著抑制SMC增殖。由此表明维生素C可以成为潜在的用于药物洗脱支架的药物。     

石墨炉原子吸收法测定液态铬元素的不同消解方法探讨

采用石墨炉原子吸收分光光度法测定液态乳中铬元素含量,探讨了干法灰化和微波消解这2种前处理方法对实验结果的影响。结果表明,干法灰化较微波消解处理样品的检测精密度更高,试验稳定性和重现性更好。在最优测定条件下,样品质量浓度在0.002⁰.320μg/mL范围内呈良好的线性关系(拟合度r=0.999 6),检测样品相对标准偏差(RSD)为2.05%,仪器检出限为0.003 1μg/mL,方法检出限为0.002 7μg/mL,加标回收率为96.35%0.320μg/mL范围内呈良好的线性关系(拟合度r=0.999 6),检测样品相对标准偏差(RSD)为2.05%,仪器检出限为0.003 1μg/mL,方法检出限为0.002 7μg/mL,加标回收率为96.35%⁹7.21%。     

溶瘤腺病毒联合不同浓度阿霉素对肝癌细胞增殖的抑制

研究肿瘤特异性增殖腺病毒联合不同浓度化疗药物阿霉素(ADM)对肝癌细胞增殖的抑制作用.肿瘤特异性增殖腺病AdCN103分别联合不同浓度的阿霉素处理肝癌细胞和正常肝细胞,用实时定量PCR分析腺病毒增殖能力,MTT法检测细胞存活率.结果表明,对于试验细胞株,不同浓度阿霉素存在时AdCN103的复制能力与AdCN103单独感染均没有显著差异.0.64～16 ng/mL ADM对肿瘤杀伤力弱;80～400 ng/mL ADM杀伤肿瘤细胞作用随浓度升高增强,并显著高于AdCN103或ADM单独施药组(p<0.05);但是过高浓度的ADM对正常细胞毒性大,并且与溶瘤病毒联用时失去协同作用.所以,溶瘤腺病毒与适当浓度阿霉素联合用药能显著提高对肝癌细胞的杀伤作用.     

液体发酵桦褐孔菌三萜类成分抑制肿瘤细胞活性研究

探究桦褐孔菌液体深层发酵所得菌丝体中三萜类成分的抗肿瘤活性。采用高效液相色谱法鉴定桦褐孔菌液体深层发酵产物中含有5种已知具有肿瘤细胞生长抑制活性的三萜类成分,采用MTT比色法分析三萜类成分对卵巢癌细胞ES2、SKOV3和肺癌细胞A549和PC9的生长活性的影响,通过细胞周期和细胞凋亡实验研究三萜类成分对卵巢癌细胞和肺癌细胞增殖的影响。结果表明:经过三萜类成分处理3d和6d的肿瘤细胞生长活性均被明显抑制,对卵巢癌细胞ES2抑制的IC50分别为21.1μg/mL和17.6μg/mL,对SKOV3抑制的IC50值分别为33.8μg/mL和10.9μg/mL;对肺癌细胞PC9抑制的IC50分别为21.4μg/mL和19.7μg/mL、对A549抑制的IC50值分别为28.5μg/mL和23.5μg/mL。细胞周期实验结果表明三萜类成分对ES2、A549、PC9、SKOV3的阻滞可能发生在G0/G1期,在16.0μg/mL的三萜类成分处理下,PC9、A549、ES2、SKOV3处在G1期的细胞比例与对照组中各细胞G1期的占比分别提高32.3%、45.7%、10.9%、6.2%,S期的细胞数降低19.1%、57.3%、23.1%、17.5%。细胞凋亡结果表明,经过药物处理2d后,三萜类成分能够有效的诱导卵巢癌细胞ES2、SKOV3和肺癌细胞A549和PC9的细胞凋亡,进一步验证桦褐孔菌三萜类成分具有肿瘤抑制活性。     

气相色谱法测定唑来膦酸原药中乙醇、丙酮、四氢呋喃、氯苯残留量

建立气相色谱法测定唑来膦酸中乙醇、丙酮、四氢呋喃和氯苯的残留量.采用5％苯基-95％二甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管柱,以氮气为载气,采取顶空进样,用FID检测测定残留溶剂的含量.结果表明:乙醇质量浓度在0.91～91.32μg/mL范围内线性关系良好,相关系数r=0.9998,回收率为95.89％,最低检测限为0.22μg/mL;丙酮质量浓度在0.38～113.04μg/mL范围内线性关系良好,相关系数r=0.9999,回收率为95.22％,最低检测限为0.06μg/mL;四氢呋喃质量浓度在0.33～11.04μg/mL范围内线性关系良好,相关系数r=0.9999,回收率为95.33％,最低检测限为0.17μg/mL;氯苯质量浓度在0.20～8.16μg/mL范围内线性关系良好,相关系数r=0.9996,回收率为96.67％,最低检测限为0.06μg/mL.     

在乳腺癌细胞MCF-7中紫杉醇诱导硫氧还蛋白结合蛋白-2的表达

探讨紫杉醇在人乳腺癌细胞株MCF-7中诱导硫氧还蛋白结合蛋白-2表达及与其诱导的相关途径．用不同浓度的紫杉醇刺激MCF-7细胞,MCF-7细胞生长受抑制．通过荧光实时定量PCR检测,发现紫杉醇刺激MCF-7细胞后硫氧还蛋白结合蛋白-2mRNA的表达升高．经荧光素酶活性检测,得出紫杉醇诱导硫氧还蛋白结合蛋白-2基因启动子活性的增高．p38丝裂原激活蛋白激酶（p38MAPK）抑制剂,SB203580抑制了紫杉醇诱导的硫氧还蛋白结合蛋白-2mRNA的表达．因此,紫杉醇抑制MCF-7细胞生长,并通过p38丝裂原激活蛋白激酶途径诱导硫氧还蛋白结合蛋白-2表达．     

E-花环法测定三种中药水提物的免疫活性

采用T淋巴细胞的E 花环实验,检测了地龙水提物、蒲公英水提物、黄芩水提物的免疫活性。结果表明地龙水提物免疫活性最高,在浓度为200μg/mL时,E 花环平均增长达到19%;而蒲公英水提物在浓度为20μg/mL时,E 花环平均增长达到13%;黄芩水提物在浓度为40μg/mL时,E 花环平均增长达到7%。     

气相法测定氢化蓖麻油的溶媒残留

建立氢化蓖麻油（HS40）中有机溶剂残留量的检测方法,采用气相色谱法,色谱柱为INNOWAX毛细管柱,载气为氮气,采用氢火焰离子化检测器（FID）,外标法计算残留溶剂的含量。在实验的浓度范围内所测结果呈现良好的线性关系,1,4-二氧六环相关系数为0.999 3,回收率为95.4%,RSD值为2.1%,检测限为1.95μg/mL;乙酸相关系数为0.999 3,回收率为87.2%,RSD值为2.5%,检测限为50.0μg/mL;乙二醇相关系数为0.999 6,回收率为96.3%,RSD值为2.2%,检测限为6.1μg/mL;二甘醇相关系数为0.996 1,回收率为97.0%,RSD值为1.8%,检测限为6.1μg/mL。本法专属性强、重现性好、灵敏度高,可用于氢化蓖麻油中残留溶剂的测定。     

纳米羟基磷灰石诱导的体外特异性抗肿瘤免疫反应研究

探讨了纳米羟基磷灰石(hydroxyapatite,HAp)作为肿瘤免疫治疗佐剂或抗原载体的可行性。利用水热法合成棒状、长径200~300nm、短径30~50nm的纳米HAp,体外降解实验表明HAp 90d的降解率可达30%。以人乳腺癌细胞裂解蛋白为肿瘤抗原,利用HAp负载该肿瘤抗原并刺激人外周血单个核细胞来源的树突细胞,将刺激后的树突细胞与同源淋巴细胞共培养,分离共培养后的同源淋巴细胞,并检测其对人非小细胞肺癌细胞A549、人肝癌细胞Huh-7、人乳腺癌细胞MCF-7、人乳腺正常细胞(Hs578Bst)的生长抑制效果。结果表明:所制备的纳米HAp无纳米毒性且生物相容性良好;HAp可显著增强人树突细胞对肿瘤抗原的吞噬作用,同时诱导同源淋巴细胞产生显著的抗原特异性免疫反应,杀伤率可达40%以上。     

PD-1抗体表达载体的构建以及其功能的探究

通过构建含PD-1抗体基因的重组腺病毒表达载体Ad35-anti-PD-1,表达的PD-1抗体以探究其对细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）抗肿瘤功能的影响。用ELISA实验检测Ad35-anti-PD-1在293细胞中PD-1抗体的表达量;利用Protein G亲和层析法纯化PD-1抗体;通过体外杀伤实验研究PD-1抗体阻断PD-1信号通路的CTL杀伤肝癌细胞能力的变化。显示成功构建重组腺病毒载体Ad35-anti-PD-1,滴度为1×1010 pfu/mL;ELISA实验检测在72h时293细胞上清中PD-1抗体的表达量约在600ng/mL;Westernblotting实验证明PD-1抗体包含正确的重链（50kD）和轻链（25kD）;ELISA实验检测从100mL细胞上清中得到1mL浓度在40μg/mL的PD-1抗体;体外杀伤实验证明CTL在添加PD-1抗体的环境中杀伤肝癌细胞的能力显著增强。