透明颤菌血红蛋白基因（vgb）与monellin基因在毕赤酵母中的联合表达

根据酵母偏爱密码子合成了monellin甜蛋白基因和vgb基因,然后构建了2种不同方式表达的载体,胞内表达的pPIC3.5KV和分泌表达的pPIC9KM.电击转化得到重组子GS115/pPIC9KM和GS115/pPIC9KM/pPIC3.5KV,通过PCR、SDS.PAGE及Western blotting检测发现monellin甜蛋白基因和vgb因成功整合进毕赤酵母基因组并成功表达,通过品尝和CO-差示光谱法证实其表达产物具有活性,用southern blotting对6株高产菌株进行拷贝数分析并未发现拷贝数与分泌蛋白产量之间存在明显的正相关.对比发现,含vgb基因菌株比未含菌株高甜度monellin的产量最高提高了20%,菌体密度平均提高了9%.     

Monellin-EGFP 融合蛋白在毕赤酵母中的表达

根据已报道的Monellin甜蛋白氨基酸序列,结合毕赤酵母与桑树密码子的偏好性,人工设计合成单链monellin基因,并与增强型绿色荧光蛋白EGFP基因连接,构建融合表达载体。采用电击转化法成功将表达载体导入毕赤酵母GS115中,并获得高效表达的重组子pPIC9K-M-E。经PCR检测,SDS-PAGE和Western Blot杂交证实已表达出融合蛋白,该蛋白经纯化与盲测实验,结果显示其甜度约为标准蔗糖的500倍。     

菊糖果糖转移酶基因在毕赤酵母中的分泌表达

将PCR获得的不包含信号肽序列的菊糖果糖转移酶基因(ift)与毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K进行连接,构建重组载体pPIC9 K-IFTase.重组载体经线性化后电转入毕赤酵母GS115感受态细胞,利用G418抗性梯度筛选及PCR鉴定,获得一株高拷贝菊糖果糖转移酶重组毕赤酵母菌株.该重组菌株经甲醇诱导,能够分泌具有活性的菊糖果糖转移酶,且60h时酶活为10.3U/mL.结果表明,菊糖果糖转移酶可以实现在毕赤酵母的分泌表达.     

人α-防御素5前体蛋白在毕赤酵母中分泌表达的研究

为了探索人α-防御素5(HD5)前体蛋白基因在酵母中高效分泌表达的可行性,将其对应基因克隆到载体pPIC9K,得到重组载体pPIC9K-preproHD5,经SacI线性化后,转入Pichiapastoris GS115,得到重组毕赤酵母菌GS115/pPIC9K-preproHD5。应用PCR技术筛选高拷贝转化株,用BMGY培养GS115/pPIC9K-HD5至OD600为2～6时,用BMMY诱导培养120h,离心取上清液,用Tricien-SDS-PAGE和蛋白定量试剂盒分析人α-防御素5前体蛋白的表达量。琼脂扩散法检测人α-防御素5前体蛋白的抑菌活性,发现其对金黄色葡萄球菌(ATCC6538)和大肠杆菌(ATCC10231)2种标准菌株具明显的抑菌活性。人α-防御素5前体基因可在毕赤酵母实现分泌型表达,该策略可能成为防御素工业化开发的有效途径。     

解淀粉芽杆菌中性植酸酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

采用PCR法从解淀粉芽孢杆菌BA11中克隆到一个中性植酸酶phyc基因,将该基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上并电转化至宿主细胞GS115后进行诱导表达.SDS-PAGE试验表明,该重组中性植酸酶在毕赤酵母宿主细胞中实现了高效分泌性表达.植酸酶活性测定结果显示阳性克隆子在诱导72h酶活性达到最高值,活性为2330U/L.     

甜味蛋白Brazzein在毕赤氏酵母中表达的初步研究

目的:采用pGAP ZαA为表达载体,SMD1168毕赤酵母为受体系统,构建分泌型的甜味蛋白Brazzein毕赤酵母重组菌.方法:按照毕赤酵母偏爱密码子设计Brazzein基因,共设计4对引物.在上、下游引物分别引入Xba Ⅰ与Xho Ⅰ酶切识别位点,采用SOE-PCR法合成Brazzein基因,构建克隆载体pUC57-Bra与酵母表达载体pGAPZαA-Bra.将重组质粒线性化,电转导入毕赤酵母(Pichia. pastoris SMD1168)中,用高浓度的抗生素Zeocin筛选高拷贝转化子.将重组菌株接种于YPD培养基诱导表达,进行SDS-PAGE分析.结果:成功构建了分泌型的Brazzein毕赤酵母重组菌.SDS-PAGE表明,目标蛋白的相对分子质量与理论值一致,在诱导72h后目的蛋白表达量达0.12g/L.对纯化后的蛋白进行生物活性测定,经鉴定具有一定的甜味,表达的Brazzein蛋白生物学活性良好.     

人源Ⅲ型胶原蛋白在毕赤酵母中的多拷贝重组表达、鉴定及抗氧化活性分析

胶原蛋白在人体内有重要作用,并且在食品、保健品、医疗等方面有广泛应用。该研究针对毕赤酵母的密码子偏好性对人源Ⅲ型胶原蛋白基因进行了密码子优化,在此基础上构建了人源Ⅲ型胶原蛋白单串联、二串联和二串联四拷贝表达载体pPIC9K-COL3-S、pPIC9K-COL3-2和pPIC9K-COL3-4,转化毕赤酵母GS115实现了人源Ⅲ型胶原蛋白的整合表达,获得了胶原蛋白单串联、胶原蛋白二串联和胶原蛋白二串联四拷贝的毕赤酵母工程菌株。对pPIC9K-COL3-S、pPIC9K-COL3-2重组菌株进行了摇瓶模拟高密度发酵,甲醇诱导浓度为0.5%,经SDS-PAGE和Western Blot检测,重组菌株成功表达了重组胶原蛋白,其中单串联蛋白表观分子量约为26.7 ku,双串联蛋白表观分子量约为52.3 ku。四拷贝重组菌株在0.5%甲醇诱导下的高密度摇瓶发酵产量最高,在最佳诱导时间为72 h时,蛋白产量达到约0.45 g/L。通过镍柱纯化后获得高纯度重组蛋白,抗氧化活性实验表明,重组胶原蛋白DPPH自由基清除率达到51.49%、ABTS自由基清除率达到41.24%,证明具有抗氧化活性,为其在食品,保健品和医疗领域的应用提供理论依据。     

对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒衣壳蛋白基因在毕赤酵母中的表达

对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒是"须向OIE申报的甲壳动物重要疾病"之一。将该病毒主要结构蛋白基因克隆至毕赤酵母穿梭表达质粒pPIC9K,构建重组表达载体(命名为pPIC9K-IV),限制性内切酶BglⅡ对其进行酶切线性化,采用电穿孔法转化到毕赤酵母GS115宿主菌。采用PCR方法分析和G418筛选来鉴定重组的毕赤酵母,诱导表达的产物分别进行ELISA分析或Western blot免疫印迹鉴定,分泌表达产物分子量大小为40ku左右,原核表达时制备的兔抗对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒衣壳蛋白的血清可与真核表达的目的蛋白发生特异性反应。     

蛹虫草中谷氨酰胺转氨酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

谷氨酰胺转氨酶(TGase或TG)是一种可催化蛋白质间形成异肽键,使蛋白质改性的天然酶制剂。本文以蛹虫草基因组为模板,通过PCR扩增得到TGase相似蛋白的基因片段tgM,将其与大肠杆菌-毕赤酵母穿梭表达载体pPIC9K连接,构建重组表达载体pPIC9K-TG,在毕赤酵母中进行表达,实现目的蛋白的胞外分泌表达,结果发酵液中重组TGase的酶活力为100 U/L。本研究为TGase的异源表达及潜在的工业应用提供参考。     

黑曲霉ZM-8葡萄糖氧化酶基因的克隆及其酵母表达载体的构建

以黑曲霉ZM-8基因组为模板,设计了含有6×His标签和胶原蛋白酶识别位点序列的上游引物及下游引物,通过聚合酶链式反应扩增获得葡萄糖氧化酶（GOD）基因,并与Smal酶切平末端pUC19载体连接,对蓝白斑筛选获得的重组子进行酶切鉴定及测序分析,表明该基因（HQ269422．1）大小为1749bp,编码583个氨基酸。用限制性内切酶Notl切下目的基因,插入到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成表达载体pPIC9K-HisGOD。该重组毕赤酵母表达载体的构建,有望获得高分泌表达、便于纯化的高活性葡萄糖氧化酶,为研制高品质的酶制剂奠定基础。     

甜蛋白Monellin在毕赤酵母中的表达及响应面法优化发酵培养基

根据毕赤酵母密码子偏好,人工合成了单链甜蛋白Monellin基因,构建了胞内表达载体pPICZA-Mon,重组载体经SacI线性化后,电击转入毕赤酵母GS115,转化子经PCR分析鉴定后通过甲醇诱导实现了甜蛋白Monellin在毕赤酵母中的胞内表达.采用Design Expert 7.0软件,利用响应面法对毕赤酵母盐培养基进行优化.首先用Plaekett-Burman方法研究发酵培养基各成分对响应值的影响,结果表明酵母提取物、硫酸钙和磷酸缓冲液为3个主要因素;利用最陡爬坡法逼近最大响应区域;最后通过中心组合设计和响应面分析得到最优培养基组成为0.6%酵母提取物,0.03%硫酸钙,0.45%硫酸镁,4%甘油,1.25%硫酸铵,7.7%100mmol/L磷酸缓冲液(pH值为6.0).在优化培养基条件下,工程菌生物量增加0.5倍,蛋白表达量提高近60%.     

构建人Cu,Zn-SOD毕赤酵母转化子及其高表达研究

设计人Cu,Zn-SOD酵母偏爱密码子并化学合成,与pPIC9K连接,构建酵母偏爱密码子的人Cu,Zn-SOD基因真核表达载体,通过电转化和持续加压筛选毕赤酵母GS115高拷贝转化子,获得的重组高表达酵母菌株建立主种子批。经Southern blot鉴定,基因拷贝数提高2～8倍,活性检测显示提高2～4倍。重组菌的目的基因拷贝数与表达产物呈正相关;表达产物为二聚体,其分子质量为40kD左右,低糖基化,均为分泌表达。Western blot法分析,对Cu,Zn-SOD抗体具有特异性反应。转化子在培养16h后进入对数生长期,24h后进入生长稳定期;转化子培养20h左右进行诱导表达最为合适。高拷贝的3株重组菌经50次传代后插入的目的基因保持稳定;Cu,Zn-SOD转化子用正交试验筛选摇瓶的诱导表达条件,经诱导表达,Cu,Zn-SOD表达上清最高活性大于600U/mL。确立最适摇瓶培养条件为pH6.0、30℃、体积分数1.5%甲醇诱导72h测得上清的目的蛋白表达最好,表明构建了高表达菌株。     

Biocontrol of fungal decay of citrus fruit by Pichia pastoris recombinant strains expressing cecropin A

Cecropin A gene was cloned into the expression vector pPIC9k and was successfully expressed in methylotrophic yeast, Pichia pastoris GS115. The yeast had effective antimicrobial activity on Geotrichum citri-aurantii spores by the thiazolyl blue (MTT) assay. There was no large growth difference between nontransformed strain GS115 and recombinant strain GS115/CEC in citrus fruits wounds. Yeast transformants could significantly inhibit growth of germinated G. citri-aurantii spores and inhibited decay development caused by G. citri-aurantii in citrus fruits compared to the yeast strain GS115/pPIC. This study demonstrates the potential of expression of an antifungal peptide in yeast for enhancing suppression of postharvest diseases and represents a new approach for the biological control of postharvest diseases.     

枯草芽孢杆菌B2(Bacillus subtilis B2)木聚糖酶在毕赤酵母中的表达

木聚糖酶是主要工业用酶制剂之一,在食品行业应用广泛.将编码枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis B2)木聚糖酶XYN的基因克隆到pPIC9K载体中,构建了分泌型表达载体pPIC9K-XYN,载体经线性化后转化Pichia pastoris GS115,G筛选获得了分泌表达XYN的重组毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-XYN.初步研究表明:以山毛榉木聚糖为底物时,重组毕赤酵母工程菌摇瓶水平发酵上清液中木聚糖酶酶活可迭1542.6 U/mL,重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH值为6.0,并显示出较好的热稳定性和宽pH适应性.     

牛乳铁蛋白肽衍生物的设计及其在毕赤酵母中表达与活性分析

本文利用抗菌肽数据库以及蛋白质分析软件等工具,根据抗菌肽结构与功能的关系,对牛乳铁蛋白肽衍生肽(LfcinBD)的结构进行优化设计。将设计得到的LfcinBD基因片段与pPIC9K质粒构建重组表达载体,线性化后电转化毕赤酵母细胞GS115,利用甲醇诱导表达。实验对发酵上清液进行了分离纯化和活性测试,SDS-PAGE电泳检测到了目标蛋白的有效表达。实验还对优化设计得到的牛乳铁蛋白肽衍生肽与同等发酵条件下产生的天然牛乳铁蛋白肽的抑菌活性进行了对比分析,结果证明该衍生肽对金黄色葡萄球菌有更强的抑菌活性。研究表明经色氨酸Trp替换的牛乳铁蛋白肽中第10,14位氨基酸获得的牛乳铁蛋白肽衍生肽具有很好的抑菌活性,实验为进一步探究牛乳铁蛋白肽衍生肽生物活性的改进奠定了基础。     

有机磷农药降解酶基因Oph2的克隆及甲基对硫磷降解效果研究

摘要：目的 挖掘可高效表达农残降解酶的基因,并构建含有该表达基因的工程菌,以此提供一种高效去除有机磷农残的新方法。方法 利用基因克隆获得高效表达农残降解酶基因Oph2,采用基因工程手段将其转化至毕赤酵母表达系统,对毕赤酵母的发酵产物进行SDS-PAGE定性研究和酶活定量研究,最后通过与目标底物甲基对硫磷反应,分析工程菌表达降解酶对有机磷农残的去除效果。结果 本研究成功克隆得到了高效表达有机磷降解酶基因Oph2,基因全长1000bp,编码256个氨基酸,酶蛋白分子量为37KD,并利用表达载体pPIC9K成功将其转化至毕赤酵母GS115。构建的工程菌GS115-pPIC9K-Oph2表达有机磷降解酶活性为11.57 U/mL,对6.8 mg/L的甲基对硫磷降解效率为90%以上。结论 本研究得到的工程菌GS115-pPIC9K-Oph2可高效表达有机磷降解酶,该酶活性高,对有机磷农残降解能力强,可有效应用于有机磷农残的降解。     

黑曲霉酸性α-淀粉酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

以黑曲霉Aspergillus niger基因组DNA为模板,PCR扩增出酸性α-淀粉酶的结构基因,将此基因插入载体pPIC9K,重组质粒pPIC9K-asAA转化毕赤酵母SMD1168,并通过G418平板培养基筛选高拷贝转化子。在酵母α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,酸性α-淀粉酶大量表达并分泌到胞外,该酶的表达受甲醇的严格调控和诱导,摇瓶培养中,2%甲醇诱导培养168h后酶活力达到最大值2838U/mL。SDS-PAGE结果显示该重组酶的分子质量为58kD。该酶的最适反应pH值为4.0,在pH3.0～6.0之间酶活力基本保持稳定,最适反应温度为70℃,在工业生产常用温度50℃条件下,该酶能够长时间保持稳定,并具有较高的酶活力。重组毕赤酵母遗传稳定性良好。     

麦芽糖转糖基酶在毕赤酵母中的表达及活性分析

用PCR 方法从E.coli BL21(DE3)中获得麦芽糖转糖基酶基因,将该基因插入到酵母表达载体pPIC9K 的α分泌信号开放阅读框的下游,对重组质粒pPIC9K-MalQ 所含的外源片段进行双向测序。将测序正确的重组质粒用内切酶Sal Ⅰ线性化,电穿孔转化到GS115 感受态细胞中,G418 梯度筛选高拷贝转化菌及PCR 鉴定目的基因的整合,1% 甲醇诱导表达。经薄层色谱分析粗酶液处理的麦芽二糖溶液,证实粗酶液具有麦芽糖转糖基酶活性。