蟹类水产品过敏原及其致敏性消减技术研究进展

蟹类是我国重要的经济水产品,也是诱发过敏反应的主要食物之一。因此,了解蟹类水产品过敏原种类及抗原表位,探究有效的蟹类致敏性消减技术等极为迫切。阐明蟹类水产品过敏原及其抗原表位是消减其致敏性的重要前提,概述了国内外分离鉴定的蟹类水产品过敏原,包括原肌球蛋白、精氨酸激酶、肌质钙结合蛋白、磷酸丙糖异构酶、细丝蛋白c等;总结了利用生物信息学技术、噬菌体展示技术、一珠一化合物技术等定位分析蟹类水产品过敏原的线性表位和构象表位概况。比较了辐照技术、超声技术、美拉德反应技术、酶法交联技术、微生物发酵技术等现代加工处理方法,或修饰过敏原抗原表位或破坏过敏原蛋白质结构,从而消减蟹类水产品过敏原致敏性。着重分析了蟹类水产品过敏原的未来研究趋势,提出蟹类水产品过敏原结构与致敏性的构效关系解析是该领域的研究难点;对比了物理法、化学法、生物法在蟹类水产品致敏性消减方面的优缺点,提出未来重点发展复合加工处理方式,以便更大程度地降低过敏原致敏性,从而为低致敏性的蟹类食品或生物制品的开发提供技术依据。     

凡纳滨对虾过敏原精氨酸激酶的质谱鉴定及其免疫交叉反应研究

目的：鉴定凡纳滨对虾分子质量40 kD过敏原,并分析其在有壳水产食物中的免疫交叉反应。方法：运用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪（matrix assisted laser desorption ionization/time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF/TOF-MS）鉴定凡纳滨对虾40 kD过敏原组分;使用软件BLAST、Clustal X2、MEGA 5.0分析该蛋白氨基酸序列的种间同源性;制备抗凡纳滨对虾过敏原精氨酸激酶的多克隆抗体,并与17 种常见有壳水生动物粗提液进行Western blotting,以分析该过敏原的免疫交叉反应。结果：凡纳滨对虾40 kD过敏原为精氨酸激酶（arginine kinase,AK）;其氨基酸序列同源性分析显示AK在虾类（96%～100%）、蟹类（91%～93%）、贝类（49%～52%）、蟑螂（83%）中具有很高的同源性;Western blotting结果显示抗AK多抗与17 种不同虾类、蟹类、贝类的AK均能发生反应。结论：精氨酸激酶在甲壳类动物、软体动物、甚至昆虫中具有高度保守性,且能引起强免疫交叉反应,是有壳水生动物中的一种泛过敏原。     

虾过敏原Troponin C (Pen m6)的克隆表达、免疫学鉴定及生物信息学分析

目的对斑节对虾(Penaeus monodon)第6组过敏原(Pen m6),肌钙蛋白C(Troponin C)进行克隆表达、免疫学鉴定并研究其生物学意义。方法提取斑节对虾总RNA;根据Gen Bank:HM034316.1设计引物及构建表达载体PET-24a-Pen m6;转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行表达;纯化后的重组Pen m6用Western bolt来鉴定免疫学特性;用生物信息学相关工具对Pen m6进行同源性分析,并预测其蛋白质的结构和功能。结果克隆出斑节对虾Pen m6基因开放阅读框453 bp,编码150个氨基酸。重组Pen m6蛋白呈可溶性,分子量约35kDa,能够与斑节对虾过敏患者血清IgE结合。斑节对虾与凡纳滨对虾亲缘关系比较近,其中斑节对虾Pen m6蛋白与凡纳滨对虾Troponin C1(gb|AET36896.1|)同源性为98%。理化性质预测Pen m6蛋白质不稳定。蛋白质结构预测结果显示Pen m6的结构主要以α螺旋组成。T细胞抗原表位预测得到4个肽序列(15~23、35~43、91~99、112~120)。B细胞抗原表位预测得到4个肽序列(7~16、21~30、28~37、58~67)。结论克隆的重组斑节对虾Pen m6蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究斑节对虾过敏原的结构成分及其理化性质奠定理论基础。     

甘蓝型油菜BnADC基因的克隆及原核表达

利用同源克隆和RACE（Rapid amplification of cDNA ends）技术从甘蓝型油菜中克隆到精氨酸脱羧酶（Arginine decarboxylase,ADC）基因cDNA全长序列,命名为BnADC。BnADC全长为2 649bp,包含344bp的5＇非翻译区（5＇Untranslated region,5＇-UTR）、226bp的3＇非翻译区（3＇Untranslated region,3＇-UTR）和2 079bp的完整开放阅读框（open reading frame,ORF）,编码75.1kD的蛋白质。5＇-UTR中含有12bp的uORF（Upstream open readingframe）,编码MIRE 4个氨基酸。氨基酸同源性比对表明,BnADC蛋白与其他植物ADC蛋白具有很高的相似性,与芥菜的同源性高达93%;系统进化树分析表明,BnADC与芥菜、拟南芥的ADC亲缘关系较近。在获得全长cDNA的基础上,构建融合表达载体pET30a（＋）-BnADC,转化大肠杆菌（Escherichia coli）表达菌株BL21（DE3）,SDS-PAGE检测到一个约81.1kD的融合蛋白被E.coil表达,且融合蛋白主要存在于菌体沉淀中。     

TBa过敏原表位区段的融合表达及免疫活性分析

为了确定苦荞过敏原TBa(tartarybuckwheatallergen)的抗原表位及进一步了解荞麦过敏反应机制,本实验以苦荞过敏原TBacDNA序列为模板,设计引物,克隆苦荞过敏原TBa表位区段基因,分别构建TBa及两个表位区段原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达并纯化,采用竞争ELISA对其免疫活性进行分析与比较。SDS-PAGE及WesternBlot鉴定和检测结果表明,目的蛋白在E.coliBL21(DE3)中可高效表达,其N端带有6个组氨酸标签。Ni2+-NTA琼脂糖柱亲和纯化得到了纯度较高的目的片段。ELISA实验结果显示,表达产物与荞麦食品过敏病人血清中的IgE具有特异的结合活性。本研究为揭示苦荞过敏蛋白结构与功能的关系奠定了基础。     

花生过敏原蛋白Ara h 6基因克隆和原核表达

本实验首先从花生中提取总RNA,利用反转录聚合酶链式反应技术克隆了花生过敏原蛋白Ara h 6全cDNA,并以此为模板扩增出Ara h 6目的基因。将目的基因与pMD19-T Simple质粒进行重组后转入BL21（DE3）宿主表达菌中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导产物表达,并利用镍离子亲和层析纯化表达产物。DNA测序结果显示Ara h 6基因片段全长为438 bp,编码145 个氨基酸,与已知该蛋白DNA序列97%相同;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示表达产物分子质量为24 kD,与融合组氨酸标签的重组Ara h 6蛋白理论分子质量相符;质谱鉴定结果表明重组蛋白的一级结构与天然Ara h 6匹配度为100%;Western blotting结果显示融合蛋白能够为抗Ara h 6多克隆抗体所识别,具有免疫原性。     

加工处理方式对蟹类原肌球蛋白的消化稳定性和过敏原性的影响

在超声波处理对拟穴青蟹(Scylla paramamosain)过敏原(原肌球蛋白,Tropomyosin,TM)影响的研究基础上,本文采用超声波、微波、超声波结合蒸煮处理拟穴青蟹蟹肉,提取其蛋白粗提液,通过模拟胃肠液消化及SDS-PAGE电泳、Western-blotting、抑制性ELISA等方法分析TM的消化稳定性及过敏原性.结果显示,与未经处理的样品及非过敏蛋白相比,TM在超声波(200W,30℃)处理后降解较快;微波处理后TM的消化稳定性及过敏原性没有明显变化,超声波处理、超声波结合蒸煮处理后TM的消化稳定性及过敏原性明显降低.该结果提示,超声波、超声波结合蒸煮等加工处理方式可降低蟹肉的致敏性.     

芝麻主要过敏原油质蛋白的基因克隆和原核表达

为克隆黑、白芝麻主要过敏原油质蛋白Oleosins的基因并在原核细胞中对其进行表达,本研究分别提取黑、白芝麻的总RNA,逆转录合成cDNA,根据序列设计简并引物,扩增芝麻主要过敏原油质蛋白Oleosins基因的完整开放阅读框,并与pET-28a载体连接,测序鉴定后转化大肠杆菌E.coliBL21（DE3）及用IPTG诱导表达。结果表明克隆获得黑、白芝麻主要过敏原油质蛋白Oleosins的全长基因约为438bp的开放阅读框（包括终止密码子）,编码145个氨基酸。所编码的蛋白相对分子质量约为15.5kDa,为小分子量蛋白,等电点为5.18,与理论值相符。序列同源性分析发现其与数据库中已知的黑、白芝麻油质蛋白Oleosins基因同源性很高（GenBank黑、白芝麻油质蛋白基因登录号分别为EU999158和EU999159）,并在DE3中高效表达。     

微紫青霉酸性木聚糖酶xynA基因的克隆与序列分析

基于酸性木聚糖酶在饲料及酿酒行业良好的应用前景,通过基因组步移的方法克隆得到微紫青霉酸性木聚糖酶的全长基因xynA,然后采取重叠延伸PCR技术进行内含子的切除获得xynA的cDNA序列,并对其进行了生物信息学分析。序列分析结果显示xynA基因全长720 bp,内含子63 bp,cDNA全长657 bp。推测该木聚糖酶编码信号肽28个氨基酸,成熟肽190个氨基酸;预测该蛋白为分子质量20.61 kD、等电点7.0的亲水性蛋白,且分子内不含二硫键。与其他真菌来源的GH11族耐酸性木聚糖酶进行序列比对,结果显示该酶的相应位置具有特征天冬氨酸残基Asp,且具有糖苷水解酶11族的保守区域特征以及典型的"右手半握"状结构,重组木聚糖酶基因xynA能够在大肠杆菌中成功表达,比酶活力达220.5 U/mg。     

南方红豆杉GGPP合酶基因的克隆与生物信息学分析

根据GeneBank中公布的GGPPS基因保守区设计特异引物,克隆南方红豆杉GGPPS基因的DNA和cDNA序列,并通过生物信息学方法对其核苷酸序列和蛋白质结构进行分析预测。结果表明,GGPPS基因DNA和cDNA序列都为1 182 bp,DNA序列中无内含子,cDNA序列为一个编码393个氨基酸残基的开放式阅读框;GGPPS的理论相对分子质量为42 590,等电点为5.68。核苷酸同源性分析显示,它与Taxus canadensis(AF081514)同源性为98.8%;推导出的氨基酸序列与Taxus canadensis(AAD16018)同源性达99.0%。利用Protparam、SignalP、ProtScale、SOPMA、Swiss-Modeling、Scan Prosite和MEGA4.0等生物信息学工具分别对其理化性质、信号肽、疏水性、亲水性、二级结构、三级结构和进化树进行分析,为其功能研究和生物合成紫杉醇研究提供分子基础。     

苦荞10 kD过敏原的重组表达及部分性质分析

以苦荞种子灌浆期cDNA文库中获得的苦荞10 kD过敏原基因序列TBAP10（tartary buckwheat 10 kD allergenprotein,TBAP10;GenBank登录号JK729379.1）为基础,构建重组表达载体pET47b-TBAP10,重组蛋白在大肠杆菌BL21 Star（DE3）中以包涵体形式表达。经包涵体复性和钴离子螯合层析纯化目的蛋白,并对其过敏活性、热稳定性及在模拟胃肠环境中的稳定性进行了分析。Western blotting显示该蛋白与苦荞16 kD过敏蛋白Fag t2存在免疫交叉反应。竞争性ELISA证明重组蛋白TBAP10具有与荞麦过敏患者血清IgE特异的结合活性;TBAP10具有强的热稳定性,能耐受15 min的沸水浴;模拟胃肠环境的消化结果显示TBAP10对胃蛋白酶具有强的耐受性,但对胰蛋白酶无耐受性。     

黑豆脂氧合酶的制备及其酶学活性的鉴定

从黑豆种子中分离纯化1 种黑豆脂氧合酶--bsLOX,对其酶学活性及降解花色苷等性质进行初步研究。采用缓冲液抽提、硫酸铵沉淀、透析、阳离子交换层析及凝胶层析等方法纯化出具有β-葡萄糖苷酶活性的bsLOX;分别以亚油酸钠和对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl β-D-glucopyranoside,pNPG）为反应底物鉴定bsLOX的脂氧合酶活性和β-葡萄糖苷酶活性。从黑豆种子中纯化获得的bsLOX在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE）图谱显示单一条带,分子质量约为95 kD。酶活性分析表明,纯化的bsLOX以亚油酸钠为底物时,酶活力为13 U/mL;当以pNPG为底物在405 nm波长处检测到了对硝基苯酚的生成,从而推测bsLOX具有β-葡萄糖苷酶活性。高效液相色谱实验结果表明bsLOX可以降解花色苷（矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷）为花色素（矢车菊素、矮牵牛素）。由于降解作用不完全,继而发现花色素能抑制bsLOX的酶活性。bsLOX是黑豆中的一种兼具β-葡萄糖苷酶功能的蛋白质,而花色素可能是天然的bsLOX抑制剂。     

韭菜β-木糖苷酶的分离纯化与部分性质研究

新鲜韭菜经匀浆、缓冲液提取、硫酸铵分级沉淀、羧甲基离子交换层析(carboxymethyl-sephar ose,CMSepharose)再通过Su perdex-200凝胶过滤层析,从而获得电泳纯的β-木糖苷酶。该酶的比活力达到18.25 U/mg,纯化倍数为12.59,回收率为1.83%,分子质量为123.02 k D,亚基分子质量为61.51 k D。通过对β-木糖苷酶的酶学性质研究得到最适温度为65℃,最适p H值为4。该酶在25~55℃及p H 3.0~5.0的范围内有较好的稳定性;在最适条件下测得其米氏常数(K_m)值为0.28 mmol/L;甲醇、乙醇、异丙醇及十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)和Ag+对该酶具有抑制作用,Mn~(2+)和Co~(2+)对该酶具有一定的激活作用。     

莲子磨皮粉中蛋白质的提取、组成及性质

采用碱溶酸沉法提取莲子磨皮粉中的蛋白质,并以莲子中提取的蛋白质作对照,采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、体积排阻色谱法测定了两种蛋白质的组成差异,采用差示扫描量热仪及傅里叶红外光谱对两种蛋白质的部分性质和结构进行了表征。结果显示：碱溶酸沉法提取莲子磨皮粉和莲子蛋白质的提取率分别为72.24%和78.93%;凝胶电泳图谱显示,莲子磨皮粉蛋白质亚基分子质量分布在15～70 kD,而莲子蛋白质亚基分子质量分布在10～45 kD;体积排阻色谱图谱也显示莲子磨皮粉蛋白质中包含有更多的不同分子质量的蛋白质组分;差示扫描量热仪分析显示,莲子磨皮粉蛋白质的变性峰值温度为118.28 ℃,莲子蛋白质为108.05 ℃,且莲子磨皮粉蛋白质变性焓值更高,因而蛋白质空间结构有序性较高;傅里叶红外光谱分析也揭示莲子磨皮粉蛋白质相比于莲子蛋白质构象更为有序。     

红佳酿酵母β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

以红佳酿酿酒酵母为出发菌株,通过离子交换法分离纯化β-葡萄糖苷酶,测定酶活力和蛋白质含量,并研究温度、pH值稳定性和金属离子、葡萄糖、酒精度对酶活力的影响。结果表明:粗酶液经过离子交换层析后,纯化倍数为19.41,得率为38.67%;经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)电泳检测为1条谱带,达到电泳纯,分子质量约为45 kD;β-葡萄糖苷酶热稳定性较差,在20~40℃较稳定,在pH 5.0~10.0较稳定;Al3+、Cu2+对酶活力有抑制作用,K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Na+对酶活力的影响不明显;葡萄糖和酒精对酶活力无明显抑制作用。     

单环刺螠体壁多糖的分离纯化、理化性质及抗脂质过氧化活性

为研究和开发单环刺螠中活性多糖成分,采用酶法提取和色谱分离技术,从单环刺螠的体壁中提取分离多糖组分,采用化学和仪器分析方法对其单糖组成、分子质量等理化性质进行研究,并通过体外清除脂质过氧化物实验对其进行初步的活性评价。结果表明：采用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶两步酶解后,单环刺螠多糖（unicinctus polysaccharide,UP）得率为5.3%。通过离子交换柱层析分离纯化后主要得到两个组分UP-1和UP-2。UP-1是主要由葡萄糖（Glc）组成的高聚葡聚糖,分子质量340 kD,而UP-2为组成复杂的类糖胺聚糖,分子质量约为7.9 kD,主要含有葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、氨基葡萄糖（GlcN）和岩藻糖（Fuc）,还含有少量的甘露糖（Man）和氨基半乳糖（GalN）。其单糖组成Man、GlcN、GalN、Glc、Gal、Fuc物质的量比例为1.0∶1.47∶0.64∶6.49∶2.5∶3.0。和其他海洋动物来源类糖胺聚糖类似,UP-2还含有少量的硫酸基,含量为7.4%。对UP-1和UP-2进行初步体外抗氧化活性研究表明,类糖胺聚糖UP-2具有显著的脂质过氧化物清除活性,半数清除质量浓度为5.0 mg/mL。     

鸭肝乳酸脱氢酶的分离纯化及部分性质研究

新鲜鸭肝经匀浆、磷酸盐缓冲液抽提,乙醇和硫酸铵分级沉淀,DEAE-Sepharose离子交换层析及Superdex-200凝胶过滤层析,获得电泳纯的乳酸脱氢酶。该酶经纯化后酶比活力达到668.82 U/mg,酶活回收率为25.79%,纯化倍数为185.78。该酶的全分子质量约为170.93 kD,亚基分子质量为44.72 kD;最适反应温度为45 ℃,最适pH值为7.4,在25～45 ℃及pH 5～10的范围内稳定性较好;在45 ℃、pH 7.4条件下,测得该酶对底物还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid,NADH）的Km值为3.407 μmol/L,对丙酮酸钠的Km值为8.431 μmol/L;草酸、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS）、Cu2＋、Ag＋对该酶的抑制作用最强,Co2＋、K＋对该酶有双重作用,低浓度时有激活作用,而高浓度时具有抑制酶活性的作用。