枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的克隆及高效表达

扩增了枯草芽孢杆菌中的葡萄糖脱氢酶基因（gdh）,构建了诱导型表达载体pET-gdh,导入E.coliBL21（DE3）后获得了高效表达葡萄糖脱氢酶基因的重组菌BL21/pET-gdh。经过诱导时间、诱导温度参数的优化,IPTG诱导后重组菌BL21/pET-gdh的葡萄糖脱氢酶比酶活高达9.65 U/mg蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明,重组蛋白质表达量占全菌胞内可溶性蛋白的53%,实现了葡萄糖脱氢酶基因的高效表达,为氧化还原酶催化系统提供高效率的NADP＋与NADPH循环奠定了基础。     

基于Gluconobacter oxydans膜结合脱氢酶的静息细胞催化合成2-酮基-D-葡萄糖酸

基于G.oxydans DSM2003膜结合葡萄糖酸-2-脱氢酶（GA-2-DH）的催化特性,利用静息细胞催化技术合成D-异抗坏血酸（EA）的主要前体2-酮基-D-葡萄糖酸（2-KGA）。利用高浓度底物自适应筛选技术,筛选到高产2-KGA菌株并对其摇瓶催化进行优化,优化后最适条件为:温度30℃,pH6.0,细胞浓度20g/L,底物浓度1100mmol/L,摇床转速250rmin,此时时空产率为24.68mmol/L/h;摇瓶优化工艺基础上在7L发酵罐中对重点影响参数（转速与底物浓度）进行了进一步优化,优化后2-KGA的时空产率提高到74mmol/L/h,并且催化细胞可有效重复利用3次。      

植物乳杆菌LY-78乳酸脱氢酶基因的生物信息学分析

目的:探究植物乳杆菌LY-78菌株全部5个乳酸脱氢酶基因及其编码蛋白质的结构和功能。方法:应用多种生物信息学软件对植物乳杆菌LY-78菌株的5个乳酸脱氢酶基因及氨基酸序列进行结构分析和功能预测。结果:植物乳杆菌LY-78中5个乳酸脱氢酶的核苷酸及氨基酸序列均具有较高的保守性,均为位于细胞质的热稳定性、非分泌、非跨膜蛋白,除了ldh L3基因,其余4个基因均具有各自高度保守的功能位点和结构域,均存在典型的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD~+)结合位点序列GXGXXG。结论:乳酸脱氢酶D1(D1-lactate dehydrogenase,D1-LDH)、D2-LDH、L1-LDH及L2-LDH均具有完整的功能位点和结构域,很可能具有真正的乳酸脱氢酶活性,L3-LDH由于缺失NAD~+结合结构域和功能位点,因而可能不具有乳酸脱氢酶活性,这些分析结果为今后植物乳杆菌乳酸脱氢酶基因改造和苯乳酸合成代谢机制研究提供了必要的理论基础。     

副干酪乳杆菌乳酸脱氢酶的生物信息学分析

目的：分析和预测副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)基因及其编码蛋白的结构和特性,以指导其生物学功能的实验研究。方法：利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(ExPASY)中有关基因和蛋白的序列和结构信息分析的各种工具,结合其他生物信息学分析软件,如ClustalX、VMD,从数据库中得到乳酸脱氢酶基因,分析、预测该基因编码的蛋白理化性质、翻译后的修饰位点、拓扑结构、二级结构、三级结构和功能域。并与其他微生物的乳酸脱氢酶蛋白序列进行比对,得出它们的保守序列。结果：该基因编码335个氨基酸,其蛋白理论分子质量为36608.8u,预测该蛋白有3个跨膜区。与干酪乳杆菌的乳酸脱氢酶进化关系最近。结论：应用生物信息方法可预测得到副干酪乳杆菌的乳酸脱氢酶的结构与功能方面的信息。     

氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003膜结合乙醇脱氢酶的纯化鉴定和性质研究

通过超速离心收集膜组分、表面活性剂溶解膜蛋白、CM- 纤维素柱层析纯化等步骤,从氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003 中获得电泳纯的具有1,2- 丙二醇脱氢酶活性的脱氢酶,此酶由两个亚基组成,其表观相对分子质量分别为80000 和50000。经MALDI-TOF MS-MS 质谱分析与肽质量指纹图谱检索鉴定,证明纯化得到的酶是乙醇脱氢酶。酶学性质分析表明,该酶的最适反应温度为30℃,最适pH 值为5.5～6.0;该酶能催化多种一元醇、二元醇,但对包含3 个以上羟基的多元醇基本无氧化活性;其催化活性随着底物碳链长度的增加而减小;大多数金属离子及抑制剂(Cu2+、Fe3+、Ca2+、EDTA 等)对此酶活性均有抑制作用。     

烤烟ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆与生物信息学分析

利用同源克隆和电子克隆方法,从烤烟栽培品种韭菜坪2号(Nicotiana tobacum cul.Jiucaiping2)中克隆获得烤烟ζ-胡萝卜素脱氢酶(zeta-carotene desaturase,ZDS)基因的全长cDNA序列(命名为T-zds1),并对其编码蛋白的一级、二级进行了预测。该基因在GenBank中的登录号为JF975566,全长为2312 bp,编码的蛋白含588个氨基酸,蛋白登录号AEG73891。BLASTp搜索结果及进化分析结果表明,烤烟T-zds1基因编码氨基酸序列与番茄、向日葵、胡萝卜ZDS基因编码氨基酸序列的相似性分别为97%,92%,90%。     

变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸激酶基因的克隆、表达及生物信息学分析

采用聚合酶链式反应技术,从2-酮基葡萄糖酸工业生产菌株变形假单胞菌JUIM01中克隆2-酮基葡萄糖酸激酶的全长基因kguK,并在此基础上构建了重组菌株大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28a(+)-kguK。在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的诱导下,该重组菌株表达了一个特异的分子质量约为36.0 ku融合蛋白,且该蛋白的Western-Blot鉴定结果显示为阳性。生物信息学分析结果表明,该蛋白是一种由305个氨基酸残基组成的亲水性蛋白,定位于细胞质中,存在着与pfkB家族蛋白类似的保守结构域,其二级结构中α-螺旋、延伸链和无规则卷曲所占的比例分别为35.73%、12.79%和51.48%。     

鼠李糖乳杆菌L-乳酸脱氢酶的生物信息学分析和基因克隆

本研究以鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）L-乳酸脱氢酶（Lr-L-LDH）为研究对象,以研究较多的Lr-L-LDH1为对照,对基因组注释的两个Lr-L-LDH1和Lr-L-LDH2基因,进行异同分析。采用在线网站和专业软件对Lr-L-LDH1和Lr-L-LDH2的一级结构、基本特性、亲疏水性、二级结构进行分析和预测,对三级结构进行同源建模以及酶和底物的分子对接分析,并对酶的编码基因进行系统发育分析,克隆表达及酶活性检测。结果显示：相较于Lr-L-LDH1,Lr-L-LDH2有着相似的分子特性,二级和三级结构,但Lr-L-LDH2编码序列短,氨基酸序列同源性低（48.08%）,有不同的进化地位;Lr-L-LDH2也含有乳酸脱氢酶催化活性位点序列和保守的NAD+结合位点序列（GXGXXG）,能够形成典型的活性三维口袋域,是NAD+依赖型四聚体结构L-乳酸脱氢酶,在细胞中需要果糖1,6-二磷酸（FBP）来激活,催化丙酮酸还原为L-乳酸;体外克隆表达和酶学分析表明,Lr-L-LDH2酶活力极显著低于Lr-L-LDH1(P<0.01)。Lr-L-LDH1和Lr...     

巴氏杜氏藻ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆与分析

ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)基因是胡萝卜素生物合成途径中的一个关键酶之一。根据实验室已获得的巴氏杜氏藻ZDS基因的cDNA序列,设计引物,通过分段PCR的方法,获得ZDS基因的编码区序列。然后根据获得编码区序列,利用染色体步移的方法获得其两端侧翼序列:启动子和终止子,并利用生物信息学工具对获得序列进行分析。实验获得的完整ZDS基因全长11896 bp,其中编码区序列(从"ATG"到"TAA")长度为6435,编码区上游序列4091 bp(包括33 bp的5’UTR序列),编码区下游序列1370 bp(包括411 bp的3’UTR序列)。将编码序列与cDNA(开放阅读框)进行比对,发现整个编码区序列含有12个外显子和11个内含子,其中内含子长度达4686 bp,约为外显子长度的2.68倍,内含子均以GT开始,AG收尾,属于最常见的内含子类型。通过生物信息学分,发现ZDS启动子中具有多种转录因子结合位点,包括与光调控有关的GAGAbox,ASF1;与植物黄化反应有光的ACGTbox等。     

粘质沙雷氏菌膜结合葡萄糖酸脱氢酶的分离纯化及其酶学特性

经超声破碎细胞、TritonX-114相分离、盐析、DEAE-sepharose离子交换层析和Hydroxyapatite吸附层析等步骤,从2-酮基葡萄糖酸（2-keogluconic acid,2KGA）生产菌株粘质沙雷氏菌JUIM03中获得比活力91.43 U/mg、纯化倍数160.4 倍的膜结合葡萄糖酸脱氢酶（gluconate dehydrogenase,GADH）。研究结果表明,粘质沙雷氏菌膜结合GADH由3 个亚基组成,其分子质量分别为65.0、45.0 kDa和23.0 kDa左右,是一种含有细胞色素C的黄素蛋白,能够催化氧化葡萄糖酸为2KGA。粘质沙雷氏菌膜结合GADH的最适反应温度为40 ℃,最适反应pH 5.0,在30 ℃以下、pH 5.0～6.0的条件下较为稳定;该酶具有严格的底物特异性,只有在D-葡萄糖酸作为底物时才具有催化活性,其Km值为1.33 mmol/L;一些金属离子（如Fe3＋、Cu2＋和Zn2＋）、有机溶剂（乙醇、异丙醇、甲醇和丙酮）、变性剂（十二烷基硫酸钠和巯基乙醇）以及有机酸（草氨酸和草酸）对膜结合GADH的催化活性具有明显的抑制作用。研究为粘质沙雷氏菌2KGA生物合成的过程优化与控制提供了一定的理论依据。     

树莓RiPAL1基因克隆及生物信息学分析

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine Ammonia Lyase,PAL）是苯丙烷类代谢的关键酶,能调节树莓中黄酮类的生物合成。为了深入研究树莓中RiPAL1基因的功能与调控机制,以树莓果实为材料提取总RNA,合成cDNA第一链,然后成功克隆出树莓果实RiPAL1基因,并对其进行了相关的生物信息学分析。结果表明,RiPAL1基因的编码序列（Coding Sequence,CDS）全长为2 133 bp,编码710个氨基酸,分子量为77.50 ku,等电点为6.21。RiPAL1蛋白疏水性最大值为4.50,最小值为-4.50,平均疏水指数为-0.49,为亲水性蛋白,无跨膜结构,无信号肽。含有4个N糖基化位点和67个特异性激酶位点,二级结构以α螺旋为主,三级结构为同型四聚体。多序列比对显示RiPAL1蛋白具有典型的苯丙氨酸解氨酶保守结构域,系统进化分析表明RiPAL1蛋白与同科植物草莓亲缘关系最近。该研究可为深入研究RiPAL1基因参与树莓果实黄酮类物质生物合成的分子机制提供参考。     

链霉菌DDE转座酶基因的克隆及生物信息学分析

从实验室保藏的菌株中筛选出一株产DDE转座酶的菌,经形态及生理生化、16S rDNA及建树分析比对,该菌株属链霉菌属灰褐类群,暂将其命名为Streptomyces labedae sp. X1。从Streptomyces labedae sp. X1基因组DNA扩增一401 bp的DDE转座酶基因,通过Blast和ISfinder数据库进行序列比对,结果显示其与ISAzo13家族转座酶的基因有88%的相似度。通过对其进行生物信息学分析,发现该基因可编码133个氨基酸,且该DDE转座酶的保守的氨基酸三联体分别位于Asp43、Asp49、Glu91上,理化性质结果显示编码产物为稳定的亲水蛋白;二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,不存在信号肽和跨膜结构域,为非分泌蛋白;有14个磷酸化位点且仅有一个糖基化位点;高级结构以α-螺旋为主;通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果显示在27 ku处出现条带。该研究结果为研究链霉菌DDE转座酶基因的表达机制提供了重要信息,对以后鉴定DDE转座酶活性以及它的结构和功能奠定基础。     

微紫青霉酸性木聚糖酶xynA基因的克隆与序列分析

基于酸性木聚糖酶在饲料及酿酒行业良好的应用前景,通过基因组步移的方法克隆得到微紫青霉酸性木聚糖酶的全长基因xynA,然后采取重叠延伸PCR技术进行内含子的切除获得xynA的cDNA序列,并对其进行了生物信息学分析。序列分析结果显示xynA基因全长720 bp,内含子63 bp,cDNA全长657 bp。推测该木聚糖酶编码信号肽28个氨基酸,成熟肽190个氨基酸;预测该蛋白为分子质量20.61 kD、等电点7.0的亲水性蛋白,且分子内不含二硫键。与其他真菌来源的GH11族耐酸性木聚糖酶进行序列比对,结果显示该酶的相应位置具有特征天冬氨酸残基Asp,且具有糖苷水解酶11族的保守区域特征以及典型的"右手半握"状结构,重组木聚糖酶基因xynA能够在大肠杆菌中成功表达,比酶活力达220.5 U/mg。     

大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因mdh的克隆、高效表达及酶学性质

以大肠杆菌基因组DNA为模板,扩增得到苹果酸脱氢酶(mdh)编码基因mdh,构建了重组菌pET-28a-mdh/BL21并成功表达了mdh,大小约36 000。选用Ni柱亲和层析法纯化具有活性的苹果酸脱氢酶(mdh),纯化后比酶活达到112.5 U/mg,纯化倍数达2.62倍,回收率为59%。并对该酶的酶学性质进行了初步研究,其中反应最适pH值为6.0,在pH值2.0~6.0范围内稳定;反应最适温度为37℃,在42℃以下酶的稳定性较好。K+对酶有明显的激活作用,Cu2+对酶有抑制作用,Hg2+和Zn2+对酶有很强的抑制作用。醇类对酶的活力影响不大,丙三醇可显著提高酶的热稳定性。酶动力学参数以草酰乙酸为底物的Km为0.235 mmol/L,Vmax为0.47μmol/(L.min)。     

酸土脂环酸芽孢杆菌Fe-SOD基因克隆及生物信息学分析

酸土脂环酸芽孢杆菌具有嗜酸耐热的独特生理特性,从该属细菌中分离到的多种酶类都具有耐酸热稳定性,是筛选耐酸耐热酶的重要菌种资源。超氧化物歧化酶(SOD)由于具有重要的生理功能而广泛用于食品、药品及化妆品等行业。为了深入探讨酸土脂环酸芽孢杆菌SOD的分子生物学特性,本研究利用同源克隆、交错式热不对称PCR技术和生物信息学方法进行Fe-SOD基因克隆、测序及序列分析。结果表明,Fe-SOD基因(GenBank序列号:JN614998)ORF全长为606bp,编码202个氨基酸,其推测氨基酸序列与来源于酸热脂环酸芽孢杆菌DSM446的Fe-SOD(ACV58017.1)序列相似性最高,为78%。整个蛋白序列含有Fe/MnSODs家族的5个模体,SOD活性中心含有金属离子结合配基His27、His82、Asp164和His168,具有Fe/MnSODs家族典型的蛋白结构特征。酸土脂环酸芽孢杆菌Fe-SOD基因的克隆和生物信息学分析为进一步构建原核表达载体、获得生产耐酸热Fe-SOD的基因工程菌株奠定基础。     

假肠膜明串珠菌甘露醇脱氢酶基因的克隆及表达

利用聚合酶链式反应从假肠膜明串珠菌中扩增出甘露醇脱氢酶（mannitol dehydrogenase,MDA）基因的结构基因,克隆入表达载体pETDuet-1,构建了甘露醇脱氢酶表达质粒pETDuet-1-mdh,将其转化进入大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达。假肠膜明串珠菌甘露醇脱氢酶结构基因长度为1 017 bp,重组甘露醇脱氢酶基因在大肠杆菌内成功表达,其蛋白质分子质量为36.0 kD;重组甘露醇脱氢酶活力为0.15 U/mg pro,高于假肠膜明串珠菌中甘露醇脱氢酶活力0.03 U/mg pro。