白粿干模拟转基因样品前处理与荧光PCR检测体系的优化

为提高米制品中转基因成分实时荧光聚合酶链式反应检测的灵敏度与检出率,应用模拟转基因白粿干样 品,对影响检测结果的主要因素,包括样品颗粒细度、DNA提取过程中样品在十六烷基三甲基溴化铵裂解缓冲液中 温育时间等因素进行优化。结果表明：提取的DNA量在样品颗粒细度与十六烷基三甲基溴化铵缓冲液温育时间的9 种 处理组合间都有极显著差异,其中最优条件为样品颗粒细度＞100 目、十六烷基三甲基溴化铵缓冲液温育时间＞8 h （过夜）。采用最优前处理组合,样品的主要转基因成分检出限从公认的转基因含量0.01%（m/m）降到0.001%（m/m）, 检测灵敏度提高10 倍,有效提高了米制品转基因成分检测结果的准确性。     

影响米粉干转基因成分荧光PCR检测的若干因素分析

为提高米制品中转基因成分实时荧光PCR检测的灵敏度与检出率,以及优化样品中转基因成分的检出效果,以添加不同转基因含量的米制品(米粉干)为模拟转基因样品,对影响检测效果的因素包括样品颗粒细度、DNA提取过程中样品在CTAB裂解缓冲液中温育时间等因素进行分析。结果显示,当样品颗粒细度>100目、CTAB温育时间达到8h条件下,样品DNA提取及荧光PCR检测结果最好;在最优化的条件组合下,样品转基因成分的检出限可达到0.001%转基因含量,是通常认为的荧光PCR检出限0.01%的10倍。      

改良十六烷基三甲基溴化铵-磁珠核酸提取方法及在植物转基因检测中的应用

目的 建立一种快速、高效、便捷的植物基因组DNA提取方法并运用于植物转基因检测。方法 改良传统的十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium ammonium bromide, CTAB)方法, 并结合磁珠吸附基因组DNA, 配合核酸自动提取系统提取水稻和加工米粉中的核酸, 荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)检测Bt63大米转基因成分, 并与另外4种提取方法的结果进行对比, 评价提取效果。结果 5种不同方法中CTAB-磁珠法提取的样品基因组DNA浓度和质量最佳, 荧光PCR检测低浓度Bt63转基因成分(0.01%)的Ct值最小, 检测结果最好。结论 该方法可高效快速地提取植物核酸, 在低含量的转基因成分检测中相比其他几种方法具有绝对优势。     

进口玉米酒糟粕中转基因品系检测方法的比较研究

以美国进口玉米酒糟粕(DDGS)中转基因玉米品系MIR162的实时荧光PCR检测方法为研究内容,分别采用3种常见商业化试剂盒提取基因组DNA,采用3个检测标准中规定的实时荧光PCR方法进行MIR162定性检测,比较了9种方法组合在检测玉米酒糟粕中转基因成分的检测技术性能。结果表明,使用TIANGEN?植物基因组DNA提取试剂盒和《SN/T 1196—2012转基因成分检测玉米检测方法》规定的荧光PCR方法,检测灵敏度最高,符合现行检验监管法规要求。考虑到大宗农产品及其加工产品的国际贸易普遍存在转基因成分低水平混杂的情况,进一步探讨了进口农产品转基因成分检验监管分类管理的必要性,提出针对不同风险级别的进口农产品采用灵敏度相适宜的检测方法。     

鱼翅制品中鲨鱼源性成分的实时荧光PCR检测方法

本研究通过鲨鱼线粒体基因组的部分序列,设计了鲨鱼的特异性引物和探针,建立了鱼翅制品中鲨鱼源性成分检测的一种新方法,据此可鉴别鱼翅制品的品质。通过物种特异性实验和灵敏度测试,表明所设计的引物和探针具有较好的物种特异性,所建立的方法具有较高的灵敏度:DNA浓度的检测灵敏度可达0.01 ng/μL,重量检测灵敏度可达0.1%(m/m)。采用该方法并结合植物源性基因检测方法对市场上随机抽取的25份鱼翅制品进行检测,其中18份样品检出鲨鱼源性成分而未检出植物源性成分,7份样品未检出鲨鱼源性成分而检出植物源性成分,表明这7份样品不是真鱼翅制品,而是采用了植物成分仿制而成。本研究所建立的方法快速、灵敏、简单,适用于市场上鱼翅制品中鲨鱼源性成分的快速检测。     

转基因蛋白质GB检测方法在玉米酒糟粕转基因成分检测中的应用性研究

根据GB/T 19495.8-2004《转基因产品检测蛋白质检测方法》对免疫层析试纸条检测玉米酒糟粕中转基因蛋白质进行了应用性研究,评价了Romer(R)试纸条对玉米酒糟粕中CP4-EPSPS抗除草剂转基因蛋白的检测低限,比较分析了不同称样量下使用超纯水和样品提取缓冲液进行样品中转基因蛋白质提取对检测结果的影响,优化了试纸条检测方法.研究表明,超纯水和试剂盒中配套的样品提取缓冲液均可用作玉米酒糟粕中转基因蛋白质检测的提取试剂;超纯水处理样品的最佳称样量为2.0g;样品提取缓冲液处理样品的最佳称样量为5.0g.从实验操作便捷上考虑,推荐采用35 ml超纯水提取2.0g玉米酒糟粕的方案.     

DNA提取方法优化及Taqman探针法检测牛肉及其制品中的猪源性成分

以牛肉及其制品为样品,采用SDS法、CTAB法、试剂盒法提取及纯化样品中的DNA,对比分析DNA模板的浓度和纯度。结果表明:试剂盒法提取的DNA在浓度和纯度方面均优于SDS法和CTAB法。采用Taqman探针法对牛肉及其制品中的猪源性成分进行检测,引物探针特异性强,灵敏度达到8.165×10~(-5)ng/μL。     

潮州市市售豆制品的转基因成分检测

为了解潮州市区市售豆制品的转基因成分状况,随机购买潮州市区主要市场市售豆制品进行检测与分析。用CTAB法即改良十六烷基三甲基溴化铵,对豆制品的DNA成分进行提取并对提取到的豆制品DNA用核酸蛋白分析仪测量OD值,利用核酸定性聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)、实时定量PCR等技术对外源基因CP4-EPSPS、NOS和Ca MV35S进行检测。对潮州市区主要市场市售豆制品29份样品进行检测,研究结果表明,提取到的豆制品DNA溶液浓度和纯度都较高,OD260 nm/OD280 nm介于1.9～2.1之间,抽取到的DNA质量浓度达到200 ng/μL以上,能够满足检测要求。在检测的豆制品中,有超过一半含有转基因成分。除了大润发超市外,豆制品没有任何食品标签,所有豆制品也没有是否含有转基因成分的标签。转基因食品标识制度的实施仍处于一个初始阶段,国家应该建立起强有力的市场监管机制。因此,我们必须高度重视转基因食品标签制度落实及其相应的市场监管工作。     

豆腐中转基因大豆成分的检测

目的探索适合豆腐样品的DNA抽提方法并采用实时荧光聚合酶链反应(PCR)技术对豆腐试样中的转基因大豆成分进行检测。方法分别采用CTAB和SDS配制抽提缓冲液提取18个豆腐样品中的DNA,针对转基因大豆都含有大豆内源基因lectin及共同元件CaMV35S启动子、nos终止子及epsps基因进行实时荧光PCR扩增。结果 SDS法比CTAB法提取的豆腐DNA质量更好;18个豆腐样品均检测到了lectin,其中有2个样品检测到了CaMV35S启动子的荧光信号,4个样品检测到了nos终止子的荧光信号,所有样品均未扩增出epsps基因。结论 SDS法比CTAB法更适合于抽提豆腐样品的DNA,提取到的DNA可用于实时荧光PCR法检测豆腐内源基因和外源基因。     

鱼翅制品中鲨鱼源性成分的实时荧光PCR检测方法 Key words:

本研究通过鲨鱼线粒体基因组的部分序列,设计了鲨鱼的特异性引物和探针,建立了鱼翅制品中鲨鱼源性成分检测的一种新方法,据此可鉴别鱼翅制品的品质。通过物种特异性实验和灵敏度测试,表明所设计的引物和探针具有较好的物种特异性,所建立的方法具有较高的灵敏度：DNA浓度的检测灵敏度可达0.01 ng/?L,重量检测灵敏度可达0.1%（m/m）。采用该方法并结合植物源性基因检测方法对市场上随机抽取的25份鱼翅制品进行检测,其中18份样品检出鲨鱼源性成分而未检出植物源性成分,7份样品未检出鲨鱼源性成分而检出植物源性成分,表明这7份样品不是真鱼翅制品,而是采用了植物成分仿制而成。本研究所建立的方法快速、灵敏、简单,适用于市场上鱼翅制品中鲨鱼源性成分的快速检测。     

市售豆瓣酱的转基因检测分析

转基因食品的安全是消费者关心的热点问题,尤其是转基因大豆深加工制品。以3种市售大豆豆瓣酱为材料,采用的CTAB改进方法对其进行了DNA提取,并鉴定了提取的DNA质量,凝胶电泳和PCR结果显示所提取的DNA能对内参基因进行有效扩增,表明了豆瓣酱的DNA提取的有效性,可以满足后续PCR的要求;在此基础上采用PCR方法检测了35S和NOS基因,结果显示待检测样品中不含转基因成分。豆瓣酱转基因检测方法的建立为今后同类产品的转基因评价提供了有效参考。     

鱼翅类食品中鲨鱼成分PCR鉴定方法研究

本文针对鱼翅中的鲨鱼成分进行检测鉴定开发了一种快速灵敏的PCR检测方法,可检测鱼翅类食品中是否存在鲨鱼成分。根据鲨鱼线粒体的细胞色素亚基I基因序列设计了鲨鱼特异性引物,扩增长度为228 bp;为了评价方法的特异性,将设计的引物分别针对22份鱼翅样品DNA和37种其它种类DNA进行PCR检测,结果显示,只在鲨鱼鱼翅中能检测出特异的228 bp条带,其它37种物种中均无条带检出。为了评价方法的灵敏度,将鱼翅DNA中掺入了不同比例土豆DNA的样品采用本方法进行了PCR分析,显示方法可检测灵敏度为0.1%(m/m)。随机抽取45份不同类型的鱼翅样品,检测出22份鲨鱼翅均含鲨鱼成分,而21份仿鱼翅均不含鲨鱼成分而含有植物成分。该样品前处理方法、DNA提取方法以及PCR检测方法可广泛应用于食品中鲨鱼成分检测鉴定。     

蛋白粉中转基因成分实时荧光定量PCR检测方法的建立

建立了应用实时荧光定量PCR技术检测蛋白粉中转基因成分的方法。通过提取DNA,优化时荧光定量PCR反应体系条件,建立了一种简便快速的检测蛋白粉中转基因成分的方法,具有良好特异性和灵敏度,检出限为0.05%。该方法检测条件稳定,样品前处理简单,是一种快速简便、可靠的方法,适合于推广使用。     

梯型熔解温度等温扩增检测食品中植物源成分的内标方法构建

目的 为梯型熔解温度核酸等温扩增(ladder-type melting temperature isothermal amplification, LMTIA)检测食品中植物源特异性基因建立内标方法, 同时可作为检测肉制品中植物成分的LMTIA方法。方法 针对植物ITS的共有序列, 设计LMTIA引物, 优化反应温度, 测定灵敏度, 并评估淀粉制品、蜂蜜、食用油DNA提取方法与LMTIA检测方法的适应性, 以H2O、鸭肉、鸡肉、羊肉、猪肉和牛肉基因组为阴性对照测试LMTIA方法的假阳性。结果 所建LMTIA方法在最优温度57 ℃时, 灵敏度为10 pg/μuL 玉米基因组与10 pg/μL玉米基因组, 可检出肉制品掺入0.1%的玉米淀粉, 并且所选淀粉制品、蜂蜜、食用油DNA提取方法均适用于LMTIA检测, 并且所有阴性对照样品在测试中均未出现假阳性。结论 本研究建立了LMTIA检测食品中植物源特异性基因的内标方法, 排除了DNA提取引起的LMTIA检测的假阴性, 同时为肉制品中植物成分定性检测建立了LMTIA方法。     

大豆转基因成分测定能力验证结果与分析

目的进一步提高实验室对转基因成分的检测水平,提升检验人员的专业素养。方法根据能力验证计划作业指导书中推荐使用的GB/T 19495.5-2004《转基因产品检测核酸定量PCR检测方法》中提供的3种方法分别对样品进行检测。结果样品013和083为GTS-40-3-2品系转基因大豆,142为非转基因大豆。能力验证获得满意结果。结论转基因成分检测应重点关注DNA提取效率和实验过程质控等因素。     

大豆粉转基因成分能力验证样品的检测分析

目的 提高实验室对转基因大豆定性检测的准确性和检测人员专业技术水平, 增强实验室竞争力。方法 通过核酸蛋白仪器分析法和单重实时荧光PCR (simplex real-time fluorescence PCR)法对样品内源基因扩增的循环阈值的影响来比较2种方法, 分析2种DNA提取试剂盒的提取质量。对标准SN/T 1204-2016《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》扩增反应体系中DNA模板量进行优化后, 对样品进行检测。再依据标准SN/T 1202-2010《食品中转基因植物成分定性PCR检测方法》的要求, 对样品进行检测。最后对2个标准的检测结果进行比对。结果 通过内源基因扩增循环阈值的数据确认, 更能准确反映试剂盒提取的DNA是否满足后续外源基因的分析检测要求。2种标准方法对19-N578和19-M913 2个待测样品的检测显示3种外源基因CaMV35S、NOS、CP4-EPSPS均为阴性, 19-N578和19-M913待测样品均为非转基因大豆。结论 本次能力验证获得满意评价。DNA提取质量的评估, 体系中DNA模板量的优化, 检测方法的选择和实验的质量控制都是影响能力验证结果的重要因素。     

实时浊度LAMP法检测豆制品中转基因成分

通过设计转基因大豆内源基因(Lectin)、外源基因NOS和2个转基因大豆品系(GTS 40-3-2,MON89788)特异性LAMP引物,建立快速检测转基因大豆以及鉴定转基因大豆品系的LAMP体系,并选取国内豆制品利用CTAB法进行DNA提取,并针对上述基因进行PCR和LAMP扩增的对比,建立起了检测大豆制品中转基因成分的定性的LAMP方法。结果表明:4个LAMP方法均有较好的特异性,除了NOS、GTS 40-3-2的检测限为0.1%外,其他LAMP方法的灵敏度为0.01%,均能满足实际检测要求;在实时浊度LAMP法检测大豆制品转基因成分的鉴定中,传统的CTAB法能成功提取大豆粗加工制品的DNA,且DNA纯度能够进行核酸扩增反应。利用转基因外引物进行的普通PCR结果与实时浊度LAMP结果是一致的,说明建立的转基因实时浊度LAMP检测方法有很好的准确性。     

实时荧光PCR法在鱼翅鉴别中的应用

为有效鉴别市售鱼翅的真伪,针对鱼翅中鲨鱼源性成分的线粒体基因组的部分序列,利用实时荧光聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术,通过特异性引物和探针的设计建立起一种有效的真伪鉴别方法。该方法中对样品脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,DNA)的提取方法、DNA检测的浓度灵敏度、质量灵敏度以及方法的特异性进行研究。结果表明鱼翅样品用试剂盒进行提取效果良好,其检测的DNA浓度灵敏度可达1×10~(-5) ng/μL,质量灵敏度可达0.01%。利用该方法对市场上的购买的47份鱼翅类样品和18份非鱼翅样品进行了检测,43样品检测出鲨鱼成分,包括4份仿鱼翅在内的22份未检出鲨鱼成分。     

Real-time PCR和双向电泳联合鉴别婴幼儿配方羊乳粉的乳源成分

为实现对婴幼儿配方羊乳粉中乳源成分的准确判别,将基因检测作为初筛方法,以蛋白质双向电泳作为确证方法,研究该技术路线下对乳源成分检测的灵敏度、准确性等指标。优化建立的基于嗜热蛋白酶的一步式DNA提取法,仅需通过温控反应在17 min内完成DNA步骤,极大缩短了样品前处理时间;建立的快速实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction,real-time PCR）程序仅需28 min 26 s即可完成检测。通过牛（家牛、水牛、牦牛）、羊（山羊和绵羊）、山羊、绵羊单一乳源成分,以及哺乳动物内参照检测体系,可以实现对低至10～100 pg/μL DNA的检测,对混合样品中牛源性成分检测的灵敏度可达1%（m/m）。然后结合双向电泳技术进一步确证产品的蛋白成分来源,可以判定牛基因检测阳性的样品是否含有来源于牛乳酪蛋白或乳清蛋白,进而对样品的真实性进行判定。real-time PCR法和双向电泳技术联合检测解决了以往婴幼儿配方乳粉检测中因配料复杂乳源判别困难的瓶颈问题。     

马铃薯及其制品中转基因成分的多重PCR检测

采用CTAB法提取15个马铃薯及其制品样品中的总DNA,内源PATA基因的PCR扩增结果均为阳性,表明已提取到DNA。应用根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因(nos)终止子和大肠杆菌K12菌株新霉素磷酸转移酶Ⅱ(nptⅡ)基因的二重PCR对样品进行转基因成分检测,结果均为阴性。将马铃薯DNA和阳性质粒pBI121混合作为PCR的反应模板,建立了内源PATA基因、花椰菜花叶病毒(Cauliflowermosaicvirus,CaMV)35S启动子、nos终止子和nptⅡ基因之间的多重PCR检测方法。多重PCR方法具有节约试剂、节省时间等特点,在转基因产品检测上的应用值得推广。