1 株产酸性α-淀粉酶黑曲霉原生质体制备和再生条件优化

通过单因素试验、Plackett-Burman（PB）试验和响应面优化获得产酸性α-淀粉酶黑曲霉孢子原生质体制备和再生的最佳工艺参数：黑曲霉种龄72 h、孢子浓度7.5×106CFU/mL、渗透压稳定剂甘露醇浓度0.85 mol/L,以10 g/L蜗牛酶＋ 10 g/L 纤维素酶＋ 10 g/L 溶菌酶为破壁酶、pH 6.8、酶解温度37 ℃、酶解2 h。在此条件下,原生质体制备率可达86.92%,再生率可达42.67%。     

鞘氨醇单胞菌TP-3原生质体制备与再生的研究

研究了EDTA预处理、菌龄、溶菌酶浓度、酶解温度及酶解时间对鞘氨醇单胞菌TP-3原生质体制备与再生的影响。结果表明:10 mmol/L EDTA对菌体进行预处理,菌龄18 h,酶浓度60μg/m L,酶解温度32℃,酶解时间30 min时,菌株原生质体的形成率可达96.1%,再生率达32.2%。本文为进行原生质体融合选育优良微生物菌种奠定了基础。     

游动放线菌原生质体诱变选育阿卡波糖高产菌株

为提高阿卡波糖发酵水平,制备了阿卡波糖产生菌犹他游动放线菌ZJB-08196的原生质体并对原生质体进行诱变处理。考察了甘氨酸的添加方式及浓度、菌龄、酶浓度、酶解时间、酶解温度、菌体浓度对原生质体制备和再生的影响,并对再生培养基进行了优化。较佳的原生质体制备与再生条件为:菌体一级培养56 h后,转接入含0.4%甘氨酸的菌丝培养基中二级培养22 h,收集菌体并调整菌体浓度为0.2 g/mL,用10 mg/mL溶菌酶35℃水浴酶解4 h后,涂布添加4 g/L L-脯氨酸和0.2 g/L聚乙烯吡咯烷酮的R2YE固体平板,原生质体的再生率达到了15.14%。原生质体经紫外诱变处理,筛选到1株高产突变株UN-52,阿卡波糖产量达到5 165.2 mg/L,比出发菌株提高了12%。     

橙色红曲菌AS3.4384转化方法的建立

本实验优化了橙色红曲菌AS3.4384原生质体制备及再生条件,将孢子接种在MPPY液体培养基中,30℃下,200r/min培养35h,以0.6mol/LMgSO4作为渗透压稳定剂,混合酶解液(0.3%裂解酶+4%纤维素酶+1%蜗牛酶)30℃,酶解3.5h,原生质体可达8×107个/ml,再生率为18%。并建立了PEG8000介导的原生质体转化方法。     

鼠李糖乳杆菌原生质体制备与再生

目的:以鼠李糖乳杆菌为试验菌株,探究其原生质体制备和再生的影响因素。方法:从菌龄、前处理、溶菌酶浓度及酶解时间等方面研究其对鼠李糖乳杆菌原生质体制备的影响。通过正交试验获得鼠李糖乳杆菌原生质体制备的最优组合,通过添加不同再生稳定剂确定鼠李糖乳杆菌原生质体再生的最适条件。结果:菌龄7 h,以1.5%的甘氨酸和0.5 mol/L蔗糖进行前处理,溶菌酶浓度30 mg/m L、酶解时间60 min,在此条件下进行试验原生质体形成率可达97%;同时,以蔗糖作为再生稳定剂的RM1再生培养基,可实现33.8%的原生质体再生率。结论:为实现鼠李糖乳杆菌原生质体转化以及乳酸菌遗传育种提供了技术支持。     

Mass Preparation and Regeneration Conditions of Protoplast from AspergiUus oryzae AS 3. 951 and RIB40

针对2株米曲霉进行原生质体制备条件的研究,比较了制备材料、菌龄、渗透压稳定剂、复合酶配比、酶解时间以及酶解温度对米曲霉原生质体形成和再生的影响。结果表明,2株米曲霉原生质体制备的最适宜条件稍有差异,其中米曲霉3.951菌株原生质体制备和再生的适宜条件是：以菌丝为制备材料,菌龄为14 h,渗透压稳定剂为0.8 mol/L NaCl,复合酶配比为1.0%纤维素酶、1.0%裂解酶、0.l%蜗牛酶,酶解时间为3 h,酶解温度为35℃;米曲霉RIB40的适宜条件是：以菌丝制备材料,菌龄为12 h,渗透要稳定剂为0.8 mol/L NaCl,复合酶配比是为1.0%纤维素酶、1.0%裂解酶、0.l%蜗牛酶,酶解时间为3 h,酶解温度是35℃。在优化条件下米曲霉3.951菌株释放的原生质体达6.43×107个/g,再生率可达23.5%,米曲霉RIB40释放的原生质体可达4.24×107个/g,再生率达22.41%。     

米曲霉3.951菌株与RIB40菌株高产原生质体的制备及再生条件的研究

针对2株米曲霉进行原生质体制备条件的研究,比较了制备材料、菌龄、渗透压稳定剂、复合酶配比、酶解时间以及酶解温度对米曲霉原生质体形成和再生的影响。结果表明,2株米曲霉原生质体制备的最适宜条件稍有差异,其中米曲霉3.951菌株原生质体制备和再生的适宜条件是:以菌丝为制备材料,菌龄为14 h,渗透压稳定剂为0.8 mol/L NaCl,复合酶配比为1.0%纤维素酶、1.0%裂解酶、0.l%蜗牛酶,酶解时间为3 h,酶解温度为35℃;米曲霉RIB40的适宜条件是:以菌丝制备材料,菌龄为12 h,渗透要稳定剂为0.8 mol/L NaCl,复合酶配比是为1.0%纤维素酶、1.0%裂解酶、0.l%蜗牛酶,酶解时间为3 h,酶解温度是35℃。在优化条件下米曲霉3.951菌株释放的原生质体达6.43×107个/g,再生率可达23.5%,米曲霉RIB40释放的原生质体可达4.24×107个/g,再生率达22.41%。     

酿酒酵母和酒类酒球菌原生质体制备与再生的条件优化

应用正交设计，研究酶解时间、酶浓度和酶解温度对酿酒酵母和酒类酒球菌原生质体制备和再生的影响。实验结果表明，酶解浓度对原生质体制备和再生的影响最大。最优组织条件为当蜗牛酶浓度为20g/L，酶解温度为37℃和酶解时间为20min时，酿酒酵母原生质体的制备率为88.4%。再生率为32.5%。当溶菌酶浓度为1mg/mL、酶解温度为37℃和酶解时间为20min时，酒类酒球菌原生质体的制备率为87.5%，再生率为31.2%。     

阿魏菇原生质体制备及再生条件的建立

以新疆阿魏菇为材料,研究菌龄、酶解时间、酶解液对阿魏菇菌丝原生质体产量的影响,同时还研究了不同渗透压稳定剂对原生质体再生的影响。结果显示,在0.6 mol/L KCl稳渗剂条件下,菌龄为8 d阿魏菇菌丝体(0.1 g)在0.8 mL混合酶解液中(1.5%离析酶+0.5%纤维素酶+2%溶菌酶)制备原生质体,35℃酶解3 h获得原生质体达5×106个/mL。原生质体再生结果显示,在0.8 mol/L蔗糖稳渗剂下,原生质体再生时间为16 d,其再生率可达0.6%。该文通过对阿魏菇原生质体分离和再生条件的研究,旨在从细胞水平上探索一条食用菌育种新途径,为发展和完善食用菌新菌株选育提供理论依据和技术借鉴。     

乳酸菌原生质体制备与再生研究

从市售酸乳中分离嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌,并对其进行原生质体制备和再生。采用溶菌酶对嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌进行处理,脱去细胞壁以探讨原生质体形成和恢复与菌龄、酶浓度、酶解时间及酶解温度之间的关系,利用四因素三水平的正交试验选出原生质体形成和恢复较适宜的条件。试验结果显示嗜热链球菌原生质体制备和恢复的较优条件为,菌龄16h,酶浓度1mg/ml,酶解时间40min,酶解温度42℃,此时原生质体形成率为98.75%,再生率为23.8%;而保加利亚乳杆菌原生质体制备和恢复的较优条件为,菌龄16h,酶浓度10mg/ml,酶解时间30min,酶解温度36℃,此时原生质体形成率为82.05%,再生率为27.1%。本文研究为这两种乳酸菌原生质体的制备、再生条件及其基因操作和相关研究提供技术思路和实验条件。     

酒酒球菌SD-2a原生质体制备的研究

通过单因素和正交试验,研究了菌龄、酶浓度、酶解温度及渗透压稳定剂等因素对酒酒球菌原生质体制备及再生的影响.确定其制备与再生的最佳条件为:菌龄34h,酶浓度1mg/mL,酶解温度37℃,0.8mol/L KCI为渗透压稳定剂,再生培养基也添加0.8mol/L KCI,在此条件下,其原生质体形成率与再生率之积为10.65%.     

干酪乳杆菌LC2W原生质体的制备与再生

以干酪乳杆菌LC2W为出发菌株,对其进行原生质体制备与再生。通过单因素试验研究菌龄、溶菌酶质量浓度、酶解时间及酶解温度对干酪乳杆菌LC2W原生质体制备的影响,并对制备条件进行正交设计优化。结果表明：干酪乳杆菌LC2W原生质体制备的最佳条件为：菌龄8h、酶质量浓度10mg/mL、酶解时间75min、酶解温度42℃,在此条件下制备原生质体并进行再生实验,原生质体形成率达到97.15%,再生率可达到31.25%。研究结果可为L. casei LC2W食品级外源表达系统的构建提供初步的基础。     

基于蛹虫草单核芽生孢子的原生质体制备条件的优化

为了获得单细胞核的蛹虫草材料和制备原生质体的最适酶解条件,以蛹虫草芽生孢子为试验材料,通过荧光染色观察其细胞核数,以溶壁酶质量分数、酶解温度、酶解时间为试验因子,原生质体得率为响应值,采用单因素和Box-Behnken试验设计进行优化。荧光显微镜观察结果表明蛹虫草芽生孢子为单个细胞核。响应面优化试验结果表明蛹虫草原生质体最适制备条件为:溶壁酶质量分数2.06%,酶解温度26.1℃,酶解时间2.57 h。在此条件下,原生质体得率的预测值为8.97×106个/mL,验证试验所得原生质体得率为(9.17±0.29)×106个/mL,预测值和试验值差异不显著,回归模型拟合良好。在优化条件下制备的原生质体在含有0.8 mol/L甘露醇的再生培养基上的再生率达43.33%±2.08%。     

粗壮脉纹孢菌原生质体的制备、再生及转化的条件

为建立原生质体介导的粗壮脉纹孢菌遗传转化系统,本研究主要考察了复合酶解液、菌龄及酶解时间对粗壮脉纹胞菌原生质体生成及再生的影响。结果表明,粗壮脉纹胞菌孢子悬液接种在马铃薯葡萄糖琼脂（potatodextrose agar,PDA）液体培养基中,30 ℃条件下摇床培养10 h的菌丝,采用0.5 g/100 mL蜗牛酶＋0.5 g/100 mL溶壁酶＋1 g/100 mL纤维素酶的复合酶解液、30 ℃条件下酶解10 h,粗壮脉纹胞菌原生质体生成及再生最为适合。在此条件下,原生质体生成数可达4.53×106 个,38#再生培养基中的再生数可达1.41×106 个,再生率达31.71%,聚乙二醇介导PAKHB载体转化NC原生质体,每微克质粒可获得8 个以上的转化子。     

产辅酶Q10的米曲霉原生质体制备条件研究

为了提高辅酶Q10的产生菌米曲霉菌的基因组改组育种效率,以提高辅酶Q10的产量,本试验对米曲霉原生质体的制备条件进行了研究。通过对影响制备效果的条件,即米曲霉的菌丝菌龄、酶解温度、时间和原生质体稳定剂的浓度四个因素进行全面优化,并利用正交试验确定了原生质体制备的适宜条件:菌龄为12h、原生质体渗透压稳定剂NaCl浓度为0.85mol/L、酶解时间为3.5min、酶解温度为30℃时,米曲霉原生质体制备效果最好,所得原生质体为6.3×106个/mL,再生率达到38.06%。较高的原生质体生成量和再生率为该菌后序的基因组改组研究奠定了基础。     

利用原生质体再生技术选育内切型菊粉酶高产菌株

利用原生质体制备与再生技术选育内切型菊粉酶高产菌株,以I200913作为出发菌株(酶活为0.413 u/m L),研究了在不同酶配比酶解液、不同酶解温度、不同酶解时间的条件下,对原生质体制备、再生以及内切型菊粉酶酶活的影响。研究结果表明,在酶配比为:纤维素酶0.7%+蜗牛酶0.2%+溶菌酶0.1%=1%,酶解温度为30℃,酶解时间为2.5h条件下,原生质体形成率最高,为22.32%。在酶配比为:纤维素酶0.7%+蜗牛酶0.2%+溶菌酶0.1%=1%,酶解温度为30℃,酶解时间为2.5h条件下,原生质体再生率最高,为16.02%。在酶配比为:纤维素酶0.7%+蜗牛酶0.2%+溶菌酶0.1%=1%,酶解温度为30℃,酶解时间为2.5h条件下,原生质体再生菌株内切型菊粉酶酶活最高为0.598 u/m L,比出发菌株提高了28%。     

乳酒酵母紫外诱变原生质体制备研究

在乳酒酵母原生质体形成率和再生率影响单因素研究的基础上,对菌龄、酶解温度、酶解时间、酶浓度、稳渗剂采用L16(4)5正交试验,评价各因素的影响程度,得出适宜该菌原生质体制备的条件.结果表明,菌龄 12 h、酶浓度1.0%、酶解时间1 h、酶解温度28℃、稳渗剂选用KCl的条件下,原生质体形成率76%,再生率62%.     

灵芝原生质体制备与融合条件的研究

以美国大灵芝和信州灵芝为起始菌株,对其原生质体制备和融合条件进行研究。结果表明:美国大灵芝原生质体制备最佳条件:摇瓶培养4d的菌丝球,复合酶液酶解,温度31℃,时间3h,原生质体制备率为5.80×106个/mL,再生率为0.32‰;信州灵芝原生质体制备最佳条件:摇瓶培养5d的菌丝球,复合酶液酶解,温度31℃,时间2.5h,原生质体制备率为4.71×106个/mL,再生率为0.24‰。两种原生质体最佳融合条件:促融剂PEG浓度30%,Ca2+浓度0.03mol/L,时间30min,温度35℃,融合率0.47%。     

啤酒酵母原生质体制备与再生条件的筛选

试验正交设计方法,对啤酒酵母原生质体制备与再生进行了研究。试验表明:以静置培养12h的细胞,0.6mol/L KCl作为渗透压稳定剂,经EDTA-Na2+预处理,在2%蜗牛酶作用下,32℃酶解90min为条件获得最佳制备率,制备率为99%以上;以静置培养14h的细胞,0.6mol/L蔗糖作为渗透压稳定剂,不经过预处理,在1.5%蜗牛酶作用下,30℃酶解120min,涂布于山梨醇为渗稳剂的再生培养基中为条件获得最佳再生率,再生率为65%。     

耐高糖酿酒酵母原生质体制备与再生过程研究

对1株耐高糖酿酒酵母的原生质体制备和再生条件进行了研究.结果表明,发酵7h后为对数生长中期,适宜原生质体化;L16(5)确定制备原生质体的最佳条件为蜗牛酶浓度(1.0%)、KCI高渗缓冲液(O.7mol/L)、酶解时间(1.5h)、预处理剂(0.1%B-巯基乙醇)和酶解温度(26℃),在此条件下原生质体形成率和再生率分别为80.84%和36.03%;原生质体形成后在7%蔗糖高渗培养基上夹层培养再生率较高(39.78%).