HCV/HBV联合抗原免疫原性研究

目的 探讨HCV/HBV联合抗原PCX/S免疫原性。方法 将纯化的HCV复合多表位抗原蛋白PCX与HBV的S蛋白按一定比例混合并免疫小鼠,用ELISA的方法检测抗-HBs和抗-HCVAb;~3H-TdR掺入法检测免疫小鼠T淋巴细胞增殖;~(51)Cr释放法检测免疫小鼠特异性CTL杀伤作用。结果 免疫后5、10及15μg的3组均能诱导抗-HBsAb和抗-HCVAb,但抗HCVAb水平明显低于抗-HBsAb水平。免疫小鼠可诱发针对PCX或S蛋白的CTL反应,前者更明显,并刺激T细胞增殖。结论 HCV/HBV联合抗原PCX/S蛋白可诱导特异性免疫应答,为HCV/HBV双价疫苗的研究提供一定实验基础。     

酶联免疫双抗原夹心法检测丙型肝炎病毒抗体试剂的质量评价

目的评价酶联免疫双抗原夹心法检测丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)抗体试剂的质量。方法采用3个厂家间接酶联免疫法的HCV抗体试剂各1批(A-1、A-2、A-3)和酶联免疫双抗原夹心法的HCV抗体试剂各1批(B-1、B-2、B-3),分别检测经Ortho和Dia Sorin公司抗HCV EIA试剂、CHIRON公司RIBA HCV 3.0 SIA及MP Biomedicals Asia Pacific Pte公司确证试剂检测的304份血浆样本(抗-HCV阳性139份及抗-HCV阴性165份);并经HCV BLOT 3.0确证试剂检测HCV假阴性样本的抗体谱。结果试剂A-1、A-2、A-3的阳性检出率分别为95.0%、97.8%、97.1%,阴性检出率分别为98.2%、92.7%、95.2%;试剂B-1、B-2、B-3的阳性检出率分别为98.6%、98.6%、99.3%,阴性检出率分别为95.8%、95.8%、96.4%,总符合率分别为96.7%∶97%、95.1∶97%、96.1%∶97.7%,不同厂家酶联免疫双抗原夹心法的HCV抗体试剂灵敏度均有提高,两种酶联免疫法的6种HCV抗体试剂检测均有不同份数的假阳性样本出现,该6种HCV抗体试剂的特异性无显著差异(P0.05)。HCV假阴性样本抗体谱分析结果表明,各HCV抗体试剂均有漏检现象。结论酶联免疫双抗原夹心法检测HCV抗体试剂具有较高的灵敏度和特异性,可在献血源筛查中推广应用。     

利用HCV多表位复合抗原制备高效价抗体

目的利用HCV多表位复合抗原免疫家兔制备高效价抗HCV多克隆抗体,为改进丙型肝炎病毒抗原的诊断试剂盒提供必要条件。方法HCV多表位复合抗原与完全弗氏佐剂混合免疫家兔,获得高效价抗血清,经硫酸铵沉淀及PrintA/G亲和层析纯化。结果已获得效价大于1∶16000的抗HCV多克隆抗血清,经纯化后达电泳纯。该抗体能与HCVNS3、NS5及C抗原特异性结合。结论HCV多表位复合抗原具有较好的免疫原性,可用于改进HCV病毒抗原诊断试剂。     

HCV Ag或HCV RNA试剂用于筛查丙型肝炎病毒感染样本的性能比较

目的比较丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)抗原(HCV Ag)与HCV RNA试剂检测HCV感染的性能。方法应用ABBOTT ARCHITECT HCV Ag和Abbott RealTime HCV RNA试剂分别检测经Ortho和DiaSorin公司抗HCV EIA试剂以及CHIRON公司RIBA HCV 3.0 SIA和MP Biomedicals Asia Pacific Pte公司确证试剂检测的304份血浆样本(抗-HCV阳性139份,抗-HCV阴性165份)。结果 139份抗-HCV阳性样本中,HCV RNA和HCV Ag试剂的阳性检出率分别为54.0%(75/139)和27.3%(38/139),HCV RNA试剂敏感性明显高于HCV Ag试剂(P0.01);检测165份抗-HCV阴性样本中,HCV RNA和HCV Ag试剂检测均为阳性的样本有5份,分别检出7份和2份单独阳性样本,特异性分别为7.3%(12/165)和4.2%(7/165),差异无统计学意义(P0.05);应用HCV Ab+HCV RNA或HCV Ab+HCV Ag筛查HCV感染,阳性检出率分别为49.7%(151/304)和48.0%(146/304),差异无统计学意义(P0.05)。在94份HCV Ag和HCV RNA阳性样本检测中,HCV Ag试剂阳性率随样本HCV RNA载量的升高而增加,HCV RNA载量与检测HCV Ag阳性率呈正相关。结论 HCV Ag或HCV RNA作为HCV筛查的补充试验方法,可有效降低HCV Ab窗口期的漏检率。     

HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合病毒样颗粒的制备及纯化

目的制备丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)中和抗原表位与HBV S抗原嵌合病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),并进行纯化和鉴定。方法采用脂质体法分别将4个HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合重组表达载体p CI-HBSE1、p CI-HBSE2、p CI-HBSE3、p CI-HBSE4转染HEK293T细胞,48 h后收集培养上清,获得自我装配的嵌合HCV中和表位的HBV VLPs,分别命名为VLPs-SE1、VLPs-SE2、VLPs-SE3、VLPs-SE4,蔗糖密度梯度离心,透析浓缩后,电镜观察VLPs,电化学发光法进行HBs Ag定量,ELISA法检测嵌合VLPs作为包被抗原与HCV感染患者血清的反应。结果电镜观察可见4种嵌合VLPs,大小约为22 nm;浓度最高的VLPs-SE2 HBs Ag含量达5.51×103ng/ml,该浓度可满足后续试验的要求;用混合VLPs作为包被抗原检测的HCV感染患者血清中和抗体水平稍高于单一VLPs作为包被抗原检测的水平。结论成功制备了HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合VLPs,为进一步评价VLPs体内诱导的中和抗体及中和抗体的保护作用奠定了基础。     

丙型肝炎病毒分片段抗体检测及优势抗原表位分析

目的检测丙型肝炎病毒(HCV)分片段抗体,并分析HCV优势抗原表位,为HCV抗原、抗体检测及疫苗研究提供依据。方法收集经ELISA法检测抗HCV阳性血清样品90份,使用总抗体检测试剂及抗HCV分片段试剂进行检测,并用荧光定量PCR对抗体弱阳性及阴性样品进行复核,分析不同片段出现的阳性率,从而分析HCV的优势抗原表位。结果 90份抗HCV阳性的样品经总抗体检测试剂检测,其中阳性78份(86.67%);90份抗HCV阳性的样品中,分片段试剂检测1个片段以上阳性样品59份(65.56%);其中C、NS3、NS4及NS5片段抗体阳性分别为56份(94.92%)、57份(96.61%)、42份(71.19%)及47份(79.66%),NS3及C片段抗体是HCV的优势抗体。结论 HCV-C及NS3表位是HCV的优势抗原表位;HCV分片段抗体与总抗体检测试剂之间阳性检出率存在一定差异。     

HCV核心抗原N-端片段生物素化表达质粒的构建及表达

目的构建HCV核心(C)抗原N-端1～130aa片段的生物素化表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达。方法PCR扩增HCV C抗原N-端1～130aa片段的编码基因,拼接上生物素-蛋白连接酶底物肽序列(BSP),构建重组原核表达质粒pGEX4T-1-CN130BSP,转化大肠杆菌Rosetta,IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE后,电转至硝酸纤维素膜上,以抗HCVC抗原的单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素对表达产物进行分析。结果PCR扩增出约466bp的目的基因片段;质粒pGEX4T-1-CN130BSP经PCR及双酶切鉴定,与预期结果一致,测序鉴定基因无突变;SDS-PAGE显示表达产物相对分子质量约为42000,22℃诱导16h可溶性表达产物含量较高;表达的重组蛋白可被抗HCV C抗原的单克隆抗体所识别,并能特异性结合辣根过氧化物酶标记的亲和素。结论已成功构建了HCV C抗原N-端1～130aa片段生物素化表达质粒,并表达出带生物素标签的GST融合蛋白,为进一步研制HCV双抗原夹心检测试剂奠定了基础。     

sIPV疫苗D抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及验证

目的 建立牛多抗对兔多抗夹心ELISA方法 检测Sabin株脊灰病毒灭活疫苗(Sabin strain inactivated poliovirus Vaccine,sIPV)D抗原含量,并对建立的方法 进行验证。方法 分别采用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型sIPV疫苗原液作为抗原制备兔多抗,并通过间接ELISA法检测其效价及特异性。以牛多抗为包被抗体、兔多抗为显示抗体建立检测D抗原含量的双抗体夹心ELISA方法 ,并对方法 的准确度、精密度及D抗原专属性进行验证。用建立的方法 检测国内5家企业sIPV疫苗样品。结果 制备获得型别特异性好、效价高的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型兔多抗,并成功建立了双抗体夹心ELISA方法 。采用四参数拟合,3型别标准曲线均具有良好的线性关系,R²均>0.99。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型各试验加标回收率均为80%～120%,各浓度平均回收率分别为98.11%、97.41%、98.66%;重复性与中间精密度CV均<10%;能够对D/C抗原进行区分。建立的方法 对5家企业生产的sIPV疫苗均能够进行D抗原定量检测。结论 成功建立了检测sIPV疫苗D抗原含量的双抗体夹心ELI...     

蛋白对HCV/HBV DNA疫苗的免疫增强作用

目的探讨蛋白对HCV/HBV DNA疫苗的免疫增强作用。方法将构建的HCV/HBV真核表达载体pcDNA-PCXS和蛋白分别免疫BALB/c小鼠,用ELISA的方法检测抗-HBs和抗-HCV Ab;3H-TdR掺入法检测免疫小鼠T淋巴细胞增殖;51Cr释放法检测免疫小鼠特异性CTLs杀伤作用。结果DNA-蛋白组抗-HBs和抗-HCV抗体均较DNA组出现早,且抗体水平明显高,DNA-蛋白组的CTL应答水平也明显高于DNA组。结论蛋白能提高DNA疫苗的特异性体液和细胞免疫功能,为DNA疫苗的实际应用提供了一种新的策略。     

戊型肝炎病毒重组蛋白P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒的制备

目的制备戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)重组蛋白P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒。方法以4型HEV ORF2重组蛋白P179免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株,有限稀释法进行克隆化培养,制备腹水,并对杂交瘤细胞进行染色体计数,鉴定单抗亚类及特异性、并检测稳定性;经SDS-PAGE分析抗体纯度,以兔抗179抗原多抗作为包被抗体,HRP标记P179单抗作为酶标抗体,建立双抗体夹心ELISA法,制备试剂盒,并进行最佳线性范围测定、准确性、精密性和稳定性验证。结果获得4株能稳定分泌抗P179抗原单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为3A10、3F8、4E9和5G6,腹水抗体效价分别为1∶10-7、1∶10-6、1∶10-6和1∶10-7,染色体数分别为96、98、101和99条;亚类分别为IgG2a、IgG2a、IgG1和IgG2b;4株单抗连续传代3个月,液氮冻存1年抗体效价未发生变化;制备的试剂盒有良好的线性(R2>0.950 0)、准确性、精密性,试验内变异系数为4.17%～6.26%,回收率在87.9%～114.8%之间,试验间变异系数为5.82%～8.01%,回收率在90.8%～108.9%之间;于37℃及4℃放置3 d,仍具有良好的稳定性。结论成功制备了戊型肝炎病毒P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒,可用于戊型肝炎疫苗生产中定量检测疫苗抗原。     

丙型肝炎病毒核心蛋白的高效表达及纯化

用新型表达载体PGEX4T－2在大肠杆菌内高效表达了丙型肝炎病毒核心蛋白。所表达的核心蛋白融合有谷优甘肽转移酶，用Sepharose4B—GSH凝胶一步亲和层析纯化即可获得高纯度的核心蛋白、该蛋白具有较好的抗原性和特异性。     

丙型肝炎病毒E2抗原基因的克隆、表达及纯化

目的　为了获得大量重组HCVE2蛋白 ,以研究E2抗体潜在的保护作用。方法　利用PCR方法从HCV基因组序列中扩增出 931bp的E2基因片段 ,经EcoRI和Sall双酶切后连接到pET 2 8a表达载体上 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)菌株 ,得到重组质粒PET -E2 ,工程菌经IPTG诱导培养 ,明显表达出HCVE2蛋白 ,表达产物经固定化金属配体亲和层析纯化 ,用ELISA方法检测生物学活性。结果　表达产物主要以包涵体形式存在 ,表达量达菌体蛋白的 18%以上 ,目的蛋白具有良好的反应原性。结论　HCVE2基因的克隆与表达为进一步开展HCVE2蛋白和疫苗研究奠定了基础     

HCV复合多表位基因真核表达载体的构建及在真核细胞中的表达

目的建立丙型肝炎病毒(HCV)复合多表位基因的真核表达载体,并在COS7细胞中瞬时表达。方法用PCR方法扩增核心区羧基端部分缺失的基因片段;分别合成HCV E2区模拟表位和NS3~NS57个T或Th细胞表位基因;PCR方法将羧基端部分缺失的HCV核心区基因与合成的表位基因串联,克隆入真核表达载体pcDNA3·1(-),并通过脂质体瞬时转染COS7细胞。结果所构建的真核表达载体pcDNA3·1(-)-CtEm已成功转染COS7,间接免疫荧光和RT-PCR证实,pcDNA3·1(-)-CtEm可在COS7中表达复合多表位基因。结论已成功构建HCV复合多表位基因的真核表达载体,并在COS7细胞中瞬时表达,为进一步复合多表位的基因免疫奠定基础。     

Cyclic Peptides Made by Linking Synthetic and Genetically Encoded Fragments

Cyclic peptides can be highly valuable as bioactive molecules, both for biomedical applications and in basic research. We introduce a new fragment‐based approach to access cyclic peptide structures in which one fragment is of synthetic origin and the other is genetically encoded. The synthetic peptide, which can contain one or more non‐proteinogenic building blocks, is coupled to the recombinantly expressed peptide through two bonds, one formed by protein trans‐splicing with a split intein and the other by oxime ligation. Semisynthetic macrocycles were obtained with high efficiency for various sequences and ring sizes; they can be prepared in quantities sufficient for initial bioactivity tests. We also prepared lipidated and d ‐amino‐acid‐containing peptides that were inspired by the peptide antibiotic daptomycin. Such structures are not accessible by other methods that harness the power of simple genetic diversification in the DNA‐encoded part of the peptide.     

HCV核心区全基因片段的表达及产物抗原活性分析

目的 表达并纯化核心基因全片段,以得到良好特异性的核心蛋白。方法 自克隆载体pUC19/HCV-C中切下核心基因全片段,将其插入带有His 6纯化标签的融合表达质粒pTrcHisA中,转化入大肠杆菌,经IPTG诱导,通过SDS-PAGE、中和抑制ELISA和Western blot对占菌体总蛋白15％以上的表达产物进行鉴定,用IMAC一步法纯化,纯化产物检测HCV阴阳性血清标本,并与日本东燃公司核心抗原C_(11)检测结果进行比较。结果 核心基因全片段插入pTrcHisA载体,转化入大肠杆菌TOP10后构建成功稳定的表达株PTrcHisA/HCV-C/TDP10,用纯化产物检测血清标本,与日本东燃公司核心抗原C_(11)检测结果的阳性均值与阴性均值之比及A值分布基本相同。结论 表达抗原具有良好的免疫反应性和特异性。     

中国人丙型肝炎病毒全长NS3基因的克隆、序列分析及表达

目的　为改进HCV试剂的质量克隆 1b型丙型肝炎病毒 (HCV)全长NS3基因并在原核细胞中表达。方法　用RT PCR方法从中国人血清中扩增全长NS3片段 ,进行序列分析 ,并克隆到pET3 0a(+)原核表达载体中 ,构建的原核表达载体pET NS3 180 0在大肠杆菌BL2 1(DE3 )中表达 ,用Westernblot方法进行验证。结果　扩增到 1b型HCV全长NS3片段 ,经Westernblot实验表明该片段具有抗原活性。结论　构建的质粒可在大肠杆菌中表达完整的NS3蛋白     

HCV聚合酶在大肠杆菌中表达产物的纯化及结构研究

目的　构建HCV聚合酶基因重组原核表达质粒 ,研究高效表达聚合酶蛋白的最适条件、表达产物的纯化方法以及最佳变性和复性条件 ,同时分析其二级结构 ,为建立细胞外HCV聚合酶复制模型及筛选药物创造条件。方法　采用高保真PfuDNA聚合酶进行反转录及套式PCR扩增 ,从我国HCVRNA阳性病人血清中扩增出HCVNS5bRNA聚合酶全长基因序列 ,构建原核表达载体。在多个载体中选取pET 30a作为表达载体 ,选择诱导表达条件。利用Ni2 + 金属离子螯和亲和层析将其纯化。同时对该酶蛋白的变性和复性条件进行研究 ,对其相关的分子生物学参数和二级结构进行分析。结果　测序及读码框架分析结果表明 ,按照上述技术路线得到了相关HCVNS5bRNA聚合酶全基因序列。在最佳表达条件下 ,诱导表达融合蛋白 (相对分子质量 6 5 0 0 0 ) ,其最高表达量为18 9% ,纯度大于 92 83% ,Westernblot法检测 ,能与HCVNS5b单抗反应 ,证明其为NS5b蛋白。对其二级结构的分析表明 ,已获得了活性基团完整的HCV聚合酶。结论　HCV聚合酶的高效表达和纯化 ,为建立细胞外HCV聚合酶复制模型及筛选药物奠定基础。     

不同代次S191株麻疹病毒HA基因的序列分析

目的　考察麻疹S191疫苗株在长期传代过程中HA基因的变化 ,以确定用于生产的最佳代次。方法　对麻疹S191疫苗株鸡胚细胞系 (CEC) 2 0、30代病毒株及S191株羊膜系病毒株 (强毒 )HAM42的血凝蛋白 (HA)基因进行RT—PCR ,克隆到PUC质粒后进行测序。结果　 2 0代和 30代疫苗的HA基因的 185 4个碱基序列中未出现核苷酸的变化 ,但二者与HAM42株相比有两个核苷酸的变化 ,分别在 15 17和 1799位 ,并导致 5 0 6位的Gly变为Asp ,6 0 0位的氨基酸由Glu变为Val。结论　麻疹病毒的减毒株与强毒株存在差异。而麻疹减毒株在鸡胚细胞的长期传代中 ,HA基因未出现明显变化 ,没有出现抗原漂移 ,30代毒株与 2 0代毒株是一致的     

几家HCV抗体诊断试剂盒检测系列血清的比较

应用Abbott、UBI及国内几家的HCV第二代抗体诊断试剂盒A、B、c及D检测25名HCV感染者的210份感染后不同时期的系列血清,首次采用ELISA及RIBA分片段检测抗体,并与敏感的PCR法检测血清中HCV RNA结果相比较。虽然各试剂盒的总体检测符合率无显著性差异,但个别国产试剂盒的早期检测能力尚有待提高。用任何一家抗体检测试剂盒均会漏检小部分标本,抗体检测阴性的血清在100000倍稀释后仍可检出HCV RNA,因此,有必要发展包括更多片段包被的第三代HCV抗体诊断试剂盒。